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牡丹花瓣提取物及其制备方法与应用

花匠小妙招
2024-11-23 11:59

牡丹花瓣提取物及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别地涉及牡丹花瓣提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

2.牡丹花瓣可泡水饮用，具有一定的药理功效。传统中医药理论认为适量的喝一些牡丹花瓣茶可调理身体健康，是功效不错的花茶饮品。cn103494206b公开了一种含有牡丹花瓣异黄酮和牡丹籽精油的软胶囊制备工艺，所提供的制备工艺中牡丹花瓣异黄酮采用生物法进行提取。cn108452035a公开了一种牡丹花瓣多酚的提取方法，包括原料预处理、多酚的提取和粗液离心步骤，将牡丹花瓣烘干，制粉，过筛后，取牡丹花瓣细粉与体积分数为50～90％的乙醇溶液按照30∶1～50∶1的液料比混合均匀，将牡丹花瓣细粉与乙醇溶液混合液置于超声波清洗机中进行超声提取，超声提取后得到花瓣提取粗液；花瓣提取粗液过滤、离心即得多酚粗提液。cn110063496a公开了一种牡丹花瓣胶囊及其制备方法，该方法将盛开期的牡丹花经过清洗、预冷、干燥和粉碎后制得牡丹花瓣作为胶囊填充物，从农作物中提取出淀粉，以植物凝胶作为凝胶剂，制得胶囊壳。cn110050995a公开了一种牡丹花瓣冲剂及其制备方法。
3.以上所公开的牡丹花瓣产品或制剂，都是基于对牡丹花瓣的传统认识和功效，制备方法也较简单，并缺少对牡丹花瓣提取物的药用价值分析。

技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的主要目的是提供牡丹花瓣提取物及其制备方法与应用。
5.为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了牡丹花瓣提取物的制备方法。
6.本发明所提供的牡丹花瓣提取物的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将牡丹花瓣干燥、粉碎，加入有机酸
‑
有机溶剂
‑
水混合溶剂进行超声提取，收集合并提取液，得到粗提液；
8.(2)将步骤(1)得到的粗提液减压浓缩至无有机溶剂味，用水稀释至相对密度为1.10
‑
1.20，加入碱水溶液，调节溶液ph值至11.0
‑
13.0，过滤除掉不溶物，过滤后的溶液用乙酸乙酯萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，得到碱水萃取液；碱水萃取液是指的去除乙酸乙酸萃取的那部分溶液而剩下的溶液；
9.(3)将步骤(2)得到的碱水萃取液用酸水酸化，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，去除溶剂并干燥得到目标提取物。
10.上述步骤(1)中加入的有机酸
‑
有机溶剂
‑
水混合溶剂，有机酸、有机溶剂和水直接混合；其中有机酸可以使提取溶剂偏酸，这种环境下可以让牡丹花瓣中的多酚类化合物可以保持在游离状态下，增加在有机溶剂中的溶解度。牡丹花瓣与牡丹其它部位中所含的化合物有区别，例如牡丹籽中富含脂肪酸，牡丹根中含有简单芳香族化合物丹皮酚和萜类化合物芍药苷，而牡丹花瓣中富含以黄酮为主的多酚类化合物。
11.上述步骤(2)中用碱水调节酸碱性后用乙酸乙酯萃取，主要目的是让牡丹花瓣中
的偏酸性的多酚类化合物富集在碱水层，而中性或碱性的有机化合物被转移到乙酸乙酯层；然后步骤(3)又进一步用酸水酸化，再用乙酸乙酯萃取，目的是让偏酸性的多酚类成分在游离状态下转移到乙酸乙酯层中。
12.上述步骤(2)中加入碱水溶液的目的就是让目标成分溶解于碱水，让杂质溶解于乙酸乙酯。
13.上述步骤(3)中酸化目的是使目标成分以游离状态存在，更容易转移到乙酸乙酯层。
14.所述步骤(1)中所述有机酸
‑
有机溶剂
‑
水混合溶剂，其中有机酸的选自苹果酸、乙酸、甲酸中的任意一种，所述有机酸的体积百分比浓度为3％～5％；其中有机溶剂为乙醇，所述有机溶剂的体积百分比浓度为67％～80％；
15.所述牡丹花瓣与所述有机酸
‑
有机溶剂
‑
水混合溶剂的料液比为1g：12ml～1g：20ml。
16.所述步骤(1)中所述超声提取的条件为：在20℃～30℃温度下超声提取1～3次，每次10min～30min。
17.所述步骤(2)中的所述碱水为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液；所述碱水溶液的体积百分比浓度为1％～3％；
18.所述步骤(2)中所述减压浓缩是在温度为30℃～60℃、压力为0.01mpa～0.1mpa的条件下减压浓缩至无醇味。
19.所述步骤(3)中所述酸水为浓度为0.1m～1m的盐酸水溶液，酸化至ph为1.0～3.0。
20.由上述牡丹花瓣提取物的制备方法制备得到的牡丹花瓣提取物也属于本发明的保护范围。
21.根据本发明的另一个方面，提供了一种脂肪酸合酶抑制剂。
22.本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂，其活性成分为上述方法制备得到的牡丹花瓣提取物。
23.上述方法制备得到的牡丹花瓣提取物在制备诱导癌症细胞凋亡的产品或药物中的应用也属于本发明的保护范围。
24.所述癌症细胞为乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231或mcf
‑
7。
25.所述牡丹花瓣提取物在制备具有减肥或抗癌功效的药物、化妆品或食品中的用途也属于本发明的保护范围。
26.本发明提供牡丹花蕊提取物的制备方法具有以下特点或优势：
27.(1)本发明的制备牡丹花瓣提取物的方法中用含有机酸的有机溶剂超声提取、调节酸碱性后用乙酸乙酯萃取对牡丹花瓣提取物的制备最关键。其中用含有机酸的溶剂超声提取是为了能够避免使牡丹花瓣中的酸性成分解离，并在相对低温的条件下完成对有效成分的最大效率的提取，用碱水及酸水调节酸碱性后用乙酸乙酯萃取可以有效去除脂溶性杂质。
28.(2)与常规提取方法不同，本方法充分考虑了温度对提取物中化学成分的影响，因此所有操作在不高于60℃的条件下进行。
29.(3)本发明的另一个优势在于通过反复酸碱处理结合有机溶剂与水溶液的萃取操用，让牡丹花瓣中的酚酸性成分充分富集。
附图说明
30.为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
31.图1为本发明提取物与三种目前已知的抑制剂对于脂肪酸合酶活性的抑制能力的对比结果；其中1为实施例1的本发明提取物a、2为实施例2的本发明提取物b、3为实施例3的本发明提取物c、4为cerulenin、5为egcg；纵座标单位为微克/毫升。
32.图2为本发明提取物对乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231活力的影响结果；其中1为dmso处理组，2为本发明提取物a，3为本发明提取物b，4为本发明提取物c。
33.图3为本发明提取物对乳腺癌细胞mcf
‑
7活力的影响结果；其中1为dmso处理组，2为本发明提取物a，3为本发明提取物b，4为本发明提取物c。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
35.实施例1、制备牡丹花瓣提取物a
36.一、牡丹花瓣提取物a的制备方法
37.牡丹花瓣提取物a的制备方法包括以下步骤：
38.(1)将牡丹花瓣干燥、粉碎，按料液比1g：15ml加入体积比为3:67:30的苹果酸
‑
乙醇
‑
水溶液，于温度20℃下超声提取2次，每次30min，收集合并提取液，得到粗提液；
39.(2)将步骤(1)得到的粗提液在温度为50℃、压力为0.05mpa的条件下减压浓缩至无醇味，用水稀释至相对密度为1.10，加入体积百分比浓度为1％的氢氧化钠水溶液，调节溶液ph值至13.0，过滤除掉不溶物，过滤后的溶液用乙酸乙酯萃取3次，并去除乙酸乙酯萃取液，得到碱水萃取液；
40.(3)将步骤(2)得到的碱水萃取液用浓度为0.1m的盐酸水溶液酸化，并用ph计调节水溶液的ph至1.0，再用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，得到乙酸乙酯萃取液，去除溶剂并干燥得到目标牡丹花瓣提取物a。
41.二、牡丹花瓣提取物a对脂肪酸合酶(fas)活性的抑制作用
42.取适量的牡丹花瓣提取物a溶于dmso中作为受试样品溶液，配制成1mg/ml的母液，并用dmso稀释成各个不同浓度的样品，用脂肪酸合酶活性的标准测定方法进行试验。所用的脂肪酸合酶活性测定方法为采用体外对肿瘤细胞内酶活进行测定的常规方法。即将乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231(购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)或mcf
‑
7细胞(购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)破碎后，采用乙酰辅酶a、丙二酸单酰辅酶a、nadph为底物的标准测活方法进行测定(tian w.x.et al.,1985.j.biol.chem.,260:11375
‑
11387；li p.,et al.,2014.mol cancer 13:138)。具体方法为乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231或mcf
‑
7细胞以70％
‑
80％密度接种于细胞培养皿(直径10cm)，待贴壁过夜后，加入含不同药物浓度的培养基。药物处理24h后，用预冷的pbs洗两遍，在冰上用细胞刮刀将贴壁细胞转移至离心管中。超声破碎细胞直至澄清。收集破碎液于4℃条件下13000rpm离心20min，取上清，测定酶活。fas采用前人报道的方法，在37℃条件下，紫外340nm处连续监测120s。其中500μl测活体系中含有25mm kh2po4‑
k2hpo4测活缓冲液(ph＝7)、0.25mm edta、0.25mm dtt、30μm乙酰辅酶a、100μm丙二酸单酰辅酶a和350μm nadph用上清液把总体积补充到500μl。以
未加入丙二酸单酰辅酶a为本底吸收，最后利用bca法测定总蛋白浓度，每个样品重复测定三次以上。fas的活力用每min每毫克总蛋白nmol nadph的消耗量来计算。所有的试验均重复三次。
43.脂肪酸合酶(fas)活性被抑制的程度用相对活力来表示，其计算方法为：以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合酶活性值，该值用a0表示，并设定其为100％。底物中加入脂肪酸合酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合酶活性的数值为a0的50％时，抑制剂的浓度为ic50值。
44.用两种目前已知的抑制剂对于脂肪酸合酶抑制活性的半抑制浓度做对比，脂肪酸合酶活性测定方法如前所述，为采用体外对肿瘤细胞内酶活进行测定的常规方法。两种对照在做活性测定前不需进行前处理，只是溶解于dmso中，测定时所用浓度根据它们活力的大小而有不同。
45.对照1：cerulenin。cerulenin是一种广泛使用的天然脂肪酸合成酶(fas)抑制剂。cerulenin是由真菌cephalosporiumcaeruleus产生的。本发明所用的cerulenin购自sigma
‑
aldrich公司，产品目录号为219557。
46.对照2：egcg。egcg(epigallocatechin gallate)即表没食子儿茶素没食子酸酯，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体。本发明所用的egcg购自sigma
‑
aldrich公司，产品目录号为93894。
47.本实施例1的牡丹花瓣提取物a与上述两种目前已知的抑制剂对于脂肪酸合酶抑制活性的半抑制浓度的对比结果见图1所示。其中1为实施例1的本发明提取物a、4为cerulenin、5为egcg；纵座标单位为微克/毫升。实施例1的牡丹花瓣提取物a对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)为5.30μg/ml，而对照1(cerulenin)、对照2(egcg)对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)分别为24.2μg/ml、25.8μg/ml，说明实施例1的牡丹花瓣提取物a对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。
48.三、牡丹花瓣提取物a对脂肪酸合酶高表达的人乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞及mcf
‑
7细胞活力的影响
49.采用cck
‑
8法测定细胞活力。将乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231或mcf
‑
7接种于96孔板，贴壁过夜后使细胞密度为70％
‑
80％，移去含血清的培养基，加入含不同药物浓度的无血清培养基，每个浓度的药物设置6个复孔。待药物处理细胞24h后，吸去培养基，每孔加入100μl新鲜无血清培养基和10μl cck
‑
8溶液，在37℃下孵育1
‑
2h，然后用酶标仪检测450nm下的吸光值。数据为6个复孔的平均值，所有实验重复三次以上。以dmso处理组细胞活力计为100％，计算牡丹花瓣提取物a处理组细胞的相对活力。
50.牡丹花瓣提取物a对脂肪酸合酶高表达的人乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞活力影响结果如图2所示，图2纵座标为mda
‑
mb
‑
231细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、2为本发明提取物a(样品浓度均为10微克/毫升)。结果显示，在mda
‑
mb
‑
231细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物a处理后，细胞相对活力为45.0％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物a在10微克/毫升浓度下可以显著降低mda
‑
mb
‑
231细胞活力(p<0.05)。
51.牡丹花瓣提取物a对mcf
‑
7细胞活力影响结果如图3所示，图3纵座标为mcf
‑
7细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、2为本发明提取物a(样品浓度均为10微克/毫升)。结
果显示，在mcf
‑
7细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物a处理后，细胞相对活力为39.3％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物a在10微克/毫升浓度下可以显著降低mcf
‑
7细胞活力(p<0.05)。
52.实施例2、制备牡丹花瓣提取物b
53.一、牡丹花瓣提取物b的制备方法
54.牡丹花瓣提取物b的制备方法包括以下步骤：
55.(1)将牡丹花瓣干燥、粉碎，按料液比1g：20ml加入体积比为5:80:15的乙酸
‑
乙醇
‑
水溶液，于温度25℃下超声提取3次，每次分别为30min、20min、10min，收集合并提取液，得到粗提液；
56.(2)将步骤(1)得到的粗提液在温度为30℃、压力为0.1mpa的条件下减压浓缩至无醇味，用水稀释至相对密度为1.20，加入体积百分比浓度为3％的氢氧化钾的水溶液，调节溶液ph值至11.0，过滤除掉不溶物，过滤后的溶液用乙酸乙酯萃取3次，并去除乙酸乙酯萃取液，得到碱水萃取液；
57.(3)将步骤(2)得到的碱水萃取液用浓度为0.5m的盐酸水溶液酸化，并用ph计调节水溶液的ph至2.0，再用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，得到乙酸乙酯萃取液，去除溶剂并干燥得到目标提取物b。
58.二、牡丹花瓣提取物b对脂肪酸合酶(fas)活性的抑制作用
59.取适量的牡丹花瓣提取物b于dmso中作为受试样品溶液，用上述脂肪酸合酶活性的标准测定方法进行试验。
60.结果如图1所示，图1为牡丹花瓣提取物与上述两种目前已知的抑制剂对于脂肪酸合酶抑制活性的半抑制浓度的对比结果。图1中2为实施例2的本发明牡丹花瓣提取物b、4为cerulenin、5为egcg；纵座标单位为微克/毫升。实施例2的牡丹花瓣提取物b对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)为5.63μg/ml，而对照1(cerulenin)、对照2(egcg)对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)分别为24.2μg/ml、25.8μg/ml，说明实施例2的牡丹花瓣提取物b对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。
61.三、牡丹花瓣提取物b对乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞及mcf
‑
7细胞活力的影响
62.采用cck
‑
8法测定细胞活力，具体方法同实施例1。
63.牡丹花瓣提取物b对脂肪酸合酶高表达的人乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞活力影响结果如图2所示，图2纵座标为mda
‑
mb
‑
231细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、3为本发明提取物b(样品浓度均为10微克/毫升)。结果显示，在mda
‑
mb
‑
231细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物b处理后，细胞相对活力为56.3％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物b在10微克/毫升浓度下可以显著降低mda
‑
mb
‑
231细胞活力(p<0.05)。
64.牡丹花瓣提取物b对mcf
‑
7细胞活力影响结果如图3所示，图3纵座标为mcf
‑
7细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、3为本发明提取物b(样品浓度均为10微克/毫升)。结果显示，在mcf
‑
7细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物b处理后，细胞相对活力为43.2％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物b在10微克/毫升浓度下可以显著降低mcf
‑
7细胞活力(p<0.05)。
65.实施例3、制备牡丹花瓣提取物c
66.一、牡丹花瓣提取物c的制备方法
67.牡丹花瓣提取物c的制备方法包括以下步骤：
68.(1)将牡丹花瓣干燥、粉碎，按料液比1g：12ml加入体积比为4:76:20的甲酸
‑
乙醇
‑
水溶液，于温度30℃下超声提取3次，每次15min，收集合并提取液，得到粗提液；
69.(2)将步骤(1)得到的粗提液在温度为60℃、压力为0.01mpa的条件下减压浓缩至无醇味，用水稀释至相对密度为1.10，加入体积百分比浓度为2％的氢氧化钾水溶液，调节溶液ph值至12.0，过滤除掉不溶物，过滤后的溶液用乙酸乙酯萃取3次，并去除乙酸乙酯萃取液，得到碱水萃取液；
70.(3)将步骤(2)得到的碱水萃取液用浓度为1m的盐酸水溶液酸化，并用ph计调节水溶液的ph至3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，得到乙酸乙酯萃取液，去除溶剂并干燥得到目标牡丹花瓣提取物c。
71.二、牡丹花瓣提取物c对脂肪酸合酶(fas)活性的抑制作用
72.取适量的牡丹花瓣提取物c溶于dmso中作为受试样品溶液，用上述脂肪酸合酶活性的标准测定方法进行试验。
73.结果如图1所示，图1为牡丹花瓣提取物与上述两种目前已知的抑制剂对于脂肪酸合酶抑制活性的半抑制浓度的对比结果。图1中3为实施例3的本发明牡丹花瓣提取物c、4为cerulenin、5为egcg；纵座标单位为微克/毫升。实施例3的牡丹花瓣提取物c对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)为5.72μg/ml，而对照1(cerulenin)、对照2(egcg)对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(ic50)分别为24.2μg/ml、25.8μg/ml，说明实施例3的牡丹花瓣提取物c对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。
74.三、牡丹花瓣提取物c对乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞及mcf
‑
7细胞活力的影响
75.采用cck
‑
8法测定细胞活力，具体方法同实施例1。
76.牡丹花瓣提取物c对脂肪酸合酶高表达的人乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞活力影响结果如图2所示，图2纵座标为mda
‑
mb
‑
231细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、4为本发明提取物c(样品浓度均为10微克/毫升)。结果显示，在mda
‑
mb
‑
231细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物c处理后，细胞相对活力为47.5％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物c在10微克/毫升浓度下可以显著降低mda
‑
mb
‑
231细胞活力(p<0.05)。
77.牡丹花瓣提取物c对mcf
‑
7细胞活力影响结果如图3所示，图3纵座标为mcf
‑
7细胞相对活力，横座标中：1为dmso处理组、4为本发明提取物c(样品浓度均为10微克/毫升)。结果显示，在mcf
‑
7细胞中，dmso处理组细胞相对活力为100％，本发明提取物c处理后，细胞相对活力为36.8％。与dmso处理组相比，本实施例的牡丹花瓣提取物c在10微克/毫升浓度下可以显著降低mcf
‑
7细胞活力(p<0.05)。
78.上述实施例1～3中的牡丹花瓣提取物在制备具有减肥或抗癌功效的药物中的应用。
79.上述实施例1～3中的牡丹花瓣提取物在制备具有减肥或抗癌功效的保健食品中的应用。
80.上述实施例1～3中的牡丹花瓣提取物在制备具有减肥或抗癌功效的功能化妆品中的应用。
81.上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。