涨知识！医药人必看的「细胞培养」狂犬疫苗发展简史
说到世界上致死率最高的疾病，相信很多人会第一时间就想到狂犬病。因为一旦感染，它的病死率接近100% 。
狂犬病病毒通过动物传播给人，是一种病毒性人兽共患病，可引起脑部和脊髓进行性、致命性炎症。据估计，狂犬病每年在 150 多个国家造成 5.9 万人死亡，其中95%的病例发生在亚洲和非洲。由于漏报和不确定统计，这一数字很可能被严重低估，不过好在，狂犬病可以通过接种疫苗进行预防和控制。
1885年，法国的巴斯德首次对一名被疯狗严重咬伤60h后的9岁男孩(名叫Joseph Meister)于皮下注射干燥狂犬病病毒家兔脊髓液，连续注射13针，其中最后5针含有大量活病毒，结果这名男孩获得了免疫保护，未患上狂犬病。巴斯德这一成功预防狂犬病的方法开创了人用狂犬病疫苗新纪元，引起医学界极大重视。
从20世纪20年代开始，中国人用狂犬病疫苗从动物脑组织疫苗开始，不断提升研发水平，目前已进入细胞培养狂犬病疫苗阶段，生产工艺逐步成熟稳定。从百年前年产量20-50 人份到2022年年产量2000万人份，中国已跃升为人用狂犬病疫苗的生产和使用大国。经过近百年的努力,中国人群狂犬病的发病率降到0.0111/10万，人用狂犬病疫苗的接种功不可没。
而细胞培养的狂犬病疫苗，有3个核心技术，分别是毒株、细胞基质、生产工艺。狂犬病疫苗的生产，可以形象的比喻为果实的种植：毒株是种子，细胞基质是土壤，生产工艺是播种工具，而疫苗就是最终收获的果实。
一、狂犬病疫苗毒株的发展
毒株是狂犬病疫苗所培育的种子，种子的优劣决定果实的质量。 众所周知，狂犬病疫苗的有效成分为灭活的固定毒，所以毒株决定了狂犬病疫苗的免疫效率。狂犬病疫苗使用的毒株与自然环境下人类感染的狂犬病病毒株(简称“街病毒株”)的同源性越高，所产生的抗体针对性越强，免疫效率越高。
目前国内狂犬病疫苗使用的毒株有CTN-1V株、aGV株、PV株、PM株这四个毒株。与国内街毒的同源性可以从以下几个维度进行分析：
从时间维度来看 ，与其他病毒类似，狂犬病病毒处于缓慢变异的过程中，随时间推移，街病毒株可能与早期分离出来的各类固定毒株(用于目前各类狂犬病疫苗生产)存在差异，进而理论保护力会降低：PV株及PM株均来源于1882年的巴斯德株，aGV株为1931年北京猎杀的狂犬病犬中获得，CTN-1V株为1956年山东淄博一名死于狂犬病病人脑组织分离。
从地域维度 ，PV株及PM株来源于法国;而aG株和CTN-1株来源于中国本土。
从来源维度 ，PV株及PM株来源疯牛脑，aG株来源于犬脑，而CTN-1株来源于人体。
从基因维度 ，若狂犬病疫苗所使用狂犬病病毒毒株与现阶段街病毒株的基因相似性越高(即基因同源性越高)，理论上对人体的保护性越强。一项来自中国药品生物制品鉴定所的研究者发表的研究(《中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析》)显示，CTN-1V疫苗毒株与国内分离毒株的氨基酸同源性大多在92.4%~97.7%，aGV株为87.2~92.9%，PV株为87.4%~92.6%，PM株为86.1%~90.8%，显示CTN-1V疫苗株与国内多数街毒株的同源性较高。 表明 CTN- 1 株 更 适用于中国狂犬病的预防 。
二、狂犬病疫苗细胞基质的发展
细胞基质是狂犬病疫苗生 产的土壤，土壤的肥沃程度决定了果实的产量。 根据生产狂犬病疫苗所使用的细胞基质种类进行区分，我国获批上市的狂犬病疫苗可分为狂犬病疫苗(Vero 细胞)、狂犬病疫苗(人二倍体细胞)、狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)
第一代细胞基质狂犬病疫苗：地鼠肾细胞，使用的是分离自地鼠肾脏组织的原代细胞，外源病毒因子污染风险高，不适于大规模培养，且批间差异较大。
第二代细胞基质狂犬病疫苗：人二倍体细胞，最初于 1974 年获批上市，但由于人二倍体细胞分裂能力有限，不适于大规模培养，且生产成本较高。
第三代细胞基质狂犬病疫苗： Vero 细胞，最初于 1984 年获批上市，Vero 细胞可稳定传代，根据WHO 建议用于生产的最大工作细胞代次可达到 150 代，因此适用于大规模生产且生产成本较低、批间质量稳定。
三、生产工艺的发展
改进病毒规模化生产效率，优化疫苗生产工艺是病毒疫苗研制的关键环节。 俗话说，工欲善其事,必先利其器。工具用得好，结果亦会事半功倍。
目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变。生物反应器培养动物细胞的常见方法有悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等。
悬浮培养条件单一且具备良好的传质、传氧效果，借助装置振动使细胞处于分散状态，多用于单细胞及微小细胞团的系统培养。
微载体主要通过为细胞提供贴附接触面积的方式实现细胞的生长繁殖。微载体因体积小、比重轻等独特优点，在无外界或轻度外力的搅拌和影响下，能完全自由均匀地分布在整个固体培养基内。
片状载体培养是通过一定材质的填充材料，借助片状载体袋的前后与左右摆动完成培养阶段的传质、传氧，在静态、动态的结合方式下，提升传质、传氧效率，以供细胞贴壁繁殖。片状载体较于微载体的培养工艺，能提高细胞与设备的分离效率，并在实际生产过程中极大降低生产成本。此外， 在稳定性方面，片状载体对于外界搅拌系统剪切力的抗干扰性更强，保证细胞培养液间充分交换，获得更高的病毒滴度，利于后续疫苗的纯化操作。
在生物反应器中规模化生产的人用狂犬病疫苗，相对于转瓶培养技术，生物反应器能提高细胞密度和培养基利用率。生物反应器全自动化控制培养条件及全封闭管路系统，即使不添加抗生素，也能有效控制污染，同时还降低了批间差异，提高了培养规模和效率，更为重要的是，产品质量更稳定、均一、可控 。
四、结语
在最肥沃的土地上，用最新技术的工具，种植最好的种子，一直是人类几千年来孜孜不倦的追求。人用狂犬病疫苗的生产亦是如此，同时采用同源性最高的毒株、可以大规模生产的基质、最新技术的生物反应器，这样的产品才能引领中国人用狂犬病疫苗发展新趋势。
责任编辑：柯鹏
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