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一种提高水稻抗虫抗病力的多肽免疫激活剂

花匠小妙招
2024-11-24 16:40

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1.本发明属于水稻病虫害防治领域，具体涉及一种提高水稻抗虫抗病力的多肽免疫激活剂。

背景技术：

2.水稻是关系国计民生的主要粮食作物。褐飞虱(brown planthopper,nilaparvata lugens)是一种专门吸食水稻的迁飞性害虫，严重威胁着我国水稻的安全生产。我国华南、江南和长江中下游稻区为稻飞虱危害最为严重的地区，稻飞虱发生面积为水稻病虫害之首。而稻瘟病则是由一种稻瘟菌(magnaporthe oryzae)侵染引起的真菌性病害，是危害我国水稻生产最严重的病害之一，发病时会造成严重的粮食减产，被称为水稻的“癌症”。目前施用化学农药仍是控制水稻病虫害的主要手段。但是该方法不仅污染环境还威胁食品安全，同时容易引发害虫的抗药性。近年来越来越多的研究开始专注于利用水稻天生免疫机制开发高效无毒无公害的新型病虫害防控技术。
3.目前培育抗褐飞虱水稻品种的常规策略是从已有水稻种质资源中挖掘并利用新的褐飞虱抗性基因，培育出抗虫品种。目前已经有至少30个水稻褐飞虱抗性基因被发现并定位到染色体上,然而其中只有6个成功被克隆，分别为bph3/6/9/14/29/32。bph3基因编码一类定位在细胞膜上的凝集素受体激酶oslecrk1
‑
osleckrk3,它们可能参与了对害虫模式相关分子(herbivore
‑
associated molecular patterns,hamp)的识别并介导广谱持久的抗虫免疫。bph9和bph14编码的是水稻r蛋白，能够识别褐飞虱释放的效应因子并与转录因子如oswrky46,oswrky72结合,激活抗虫免疫。bph6则是一个定位在胞泌复合体exocysts的未知功能蛋白，参与细胞壁的建成和稳定，减轻褐飞虱对细胞壁的破坏。bph29和bph32分别编码含有b3
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dna结合结构域和scr结构域的未知功能蛋白。利用杂交技术，一些褐飞虱抗性基因如bph14,bph15已经被整合进高产优质的水稻品种中，培育出了“珞红4a”等抗虫品种。然而，早期由国际水稻所(irri)培育的抗虫品种(具有bph1,bph2,bph3单抗性基因)在种植几年后就迅速失去了抗性。褐飞虱对水稻抗虫品种的快速适应给防控治理褐飞虱带来了巨大的挑战。
4.截止到今年，研究者们已经在不同的水稻品种鉴定到了100多个稻瘟病抗性基因，其中24个为主效抗病基因。其中pi1、pi2、pi5、piz、pi9、pi40(t)、pizt、pi33、pigm和bsr
‑
d1等10个稻瘟菌抗病基因被认为具有广谱抗性，能够应对多种稻瘟菌生理小种。长期的实践经验表明在同一地区随着只含有一个抗性基因的水品种的推广，稻瘟菌的优势生理小种会迅速地发生变化，使得原来抗病的品种很快就失去了抗病性。为培育具有广谱、持久性抗性品种常常需要聚合多个抗性基因，这大大增加了培育的难度和工作量。
5.害虫或者病菌在侵染植物过程中会诱导植物产生损伤相关分子模式(damage
‑
associated molecular patterns,damp)，激活或放大模式触发式免疫(patterns
‑
triggered immunity,pti)。pep小肽(plant elicitor peptides)是一类发现于2006年的damp信号分子，在十字花科、茄科、蔷薇科、禾本科等大量植物中广泛存在。在拟南芥中，pep
前体蛋白propep在细胞内合成后经过蛋白酶加工，其c端序列成为成熟的pep小肽。本专利申请人在2019年与比利时根特大学的hander等人几乎同时发现拟南芥ii型metacaspase(mc)蛋白酶是加工propep前体的酶。pep小肽随后通过未知方式运输至细胞外，再被细胞膜上的受体pepr(plant elicitor peptides receptor)识别后，激活该受体并招募共受体bak1。pep受体pepr属于典型的植物类受体激酶(receptor
‑
like kinase,rlk)，包含识别信号分子的胞外结合域、跨膜序列以及激活和调控信号转导的胞内激酶结构域。蛋白磷酸化在rlk介导的植物信号转导过程中发挥着重要的作用。由pepr和bak1组成的受体复合物磷酸化激活下游的类受体胞质激酶(receptor
‑
like cytoplasmic kinase，rlck)bik1和pbl1。二者进一步磷酸化下游底物蛋白，激活免疫信号通路，产生一系列的免疫反应：如胞外的ca
2+
内流、活性氧(reactive oxygen species，ros)爆发、mapk和cdpk信号通路的激活以及防御相关次生代谢物和防御激素的合成等，最终使植物获得广谱的病虫害抗性。由pep
‑
pepr信号通路介导的pti免疫已被证实参与了拟南芥、玉米、大豆等多种植物对咀嚼式昆虫抗性的调控。外源pep处理可以上调防御基因pr
‑
1、pdf1.2的表达、诱导胼胝质的沉积、合成抗虫代谢物植保素等，从而增强拟南芥对棉叶虫、玉米对甜菜夜蛾、大豆对弱线虫的抗性。
6.最近有文献报道，水稻ospep3的处理可以诱导水稻悬浮细胞产生一系列的抗虫免疫反应，如mapk信号通路的激活、抗虫次生代谢物的合成等，提示pep
‑
pepr信号通路同样可能参与了调控水稻对害虫的防御。值得注意的是，不同于咀嚼式昆虫，刺吸式的褐飞虱只在水稻的茎和叶片上造成很小的伤口，能否诱导水稻产生pep小肽尚未有定论。截止本发明申请之日起，尚无文献报道水稻ospep3小肽是否能够增强水稻抗虫抗病的能力。

技术实现要素：

7.本发明的第一个目的是提供一种提高水稻抗虫抗病力的多肽免疫激活剂。
8.本发明的提高水稻抗虫抗病力的多肽免疫激活剂，其含有以下任一多肽作为活性成分：
9.ospep1：arlrpkppgnpregsggngghhh，其序列如seq id no.1所示；
10.ospep2：ddskptrpgapaegsggnggaih，其序列如seq id no.2所示；
11.ospep3：adsapqrpgspaegaggnggavh，其序列如seq id no.3所示；
12.ospep7：skpkpeppgypreggggnggvvd，其序列如seq id no.4所示。
13.本发明的第二个目的是提供上述多肽在制备提高水稻抗虫和/或抗病能力的制剂中的应用。
14.优选，所述的抗虫是抗褐飞虱。
15.优选，所述的抗病是抗稻瘟病。
16.本发明的第三个目的是提供一种增强水稻抗病抗虫能力的方法，其是用上述多肽喷施水稻，激活水稻天生免疫防御机制，合成抗虫抗病次生代谢物，提高水稻对病虫害的耐受性。
17.优选，所述的多肽是ospep3。
18.优选，所述的用上述多肽喷施水稻是在水稻4叶期或1个月大时喷施。
19.优选，所述的水稻可以是水稻zh11。
20.施用化学农药是控制水稻病虫害主要的方式之一，但是长期的农药滥用导致很多害虫和病菌产生了耐药性，而且容易误杀有益昆虫、有益菌群，引起生态失衡。不仅如此，作物的农药残留同样危害着食品安全。而培育推广抗虫抗病的水稻品种往往需要耗费大量的人力和时间成本。本发明通过外源喷施多肽免疫激活剂，激活水稻天生免疫防御机制，合成抗虫抗病次生代谢物，提高水稻对病虫害的耐受性。相较于传统农药，本发明无毒无公害、易降解无残留；相较于抗病抗虫水稻品种的培育，本发明高效、便捷，容易推广。
附图说明
21.图1是植物多个物种的免疫小肽pep的氨基酸序列；
22.图2是4个由23个氨基酸组成的ospep小肽；
23.图3是ospep小肽诱导水稻叶片产生ros爆发；
24.图4是叶片mapk级联通路中的激酶磷酸化水平变化；
25.图5是ospepr1pepr2#1和#2的突变位点图；
26.图6是ospep3无法诱导ospepr1pepr2突变体的ros爆发图；
27.图7是ospep3无法诱导ospepr1pepr2突变体的mapk的磷酸化；
28.图8是ospep3处理10天后水稻对褐飞虱的耐受性图；
29.图9是褐飞虱取食48小时后每株水稻上褐飞虱的数量图；
30.图10是叶片病斑大小图。
具体实施方式
31.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
32.实施例1：
33.1.1氨基酸同源序列比对预测水稻ospropep基因
34.本发明首先利用公开的数据库(ncbi:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析了植物多个物种的免疫小肽pep的氨基酸序列(图1)。通过同源比对发现，水稻粳稻(oryza sativa.ssp.japonica)基因组发现7个propep同源基因。这些ospropep的c端与禾本科的其他pep小肽具有较高的相似性，都拥有pgxpxegxggxgg保守基序。推测这些ospropep加工后可能会产生ospep小肽。
35.1.2人工合成ospep小肽
36.诸多文献表明外源施加人工合成的拟南芥atpep小肽以及zmpep小肽能够激活植物细胞的免疫反应。本发明根据预测的ospep序列，利用固相多肽合成法人工合成4个由23个氨基酸组成的ospep小肽(图2)。
37.ospep1：arlrpkppgnpregsggngghhh；
38.ospep2：ddskptrpgapaegsggnggaih；
39.ospep3：adsapqrpgspaegaggnggavh；
40.ospep7：skpkpeppgypreggggnggvvd。
41.人工合成的ospep3粉末用纯水溶解成10mm的水溶液，
‑
80℃冰箱保存。使用时从冰箱中取出后，用纯水稀释成目标浓度如10μm的水溶液。为克服水稻叶片、叶鞘、茎等组织表皮蜡质层对ospep小肽的吸收，在处理前在相应的ospep小肽水溶液加入0.05％silwet
‑
l77
(广州捷倍斯:货号：l77080596)。同时对照组为不含ospep3小肽的0.05％silwet
‑
l77水溶液(以下简称mock溶液)。
42.1.3验证ospep小肽的免疫原活性
43.本发明检测了这4个ospep小肽的免疫活性。将10天大的野生型水稻(中花11)叶片浸泡在含有ospep小肽的水溶液(浓度10μm，下同)中处理30分钟，利用化学发光法分析水稻叶片产生的活性氧ros的含量。结果表明所有的ospep小肽均能有效地诱导水稻叶片产生ros爆发(图3)。该结果提示这4个ospep小肽具有免疫原活性，能够诱发水稻细胞的免疫反应。其中ospep3的免疫原活性最强。
44.为进一步验证ospep小肽的免疫原活性，将10天大的野生型水稻叶片浸泡在含有ospep小肽的水溶液中处理15分钟后，裂解叶片提取总蛋白进行western
‑
blot蛋白印迹实验，用α
‑
mapk抗体检测叶片mapk级联通路中的激酶磷酸化水平变化(图4)。结果表明ospep2、ospep3和ospep7能够有效地激活水稻叶片的mapk级联通路，磷酸化osmpak。这说明ospep2、ospep3和ospep7具有免原疫活性。
45.1.4构建ospep小肽受体突变体验证其特异性
46.为了验证ospep免疫原活性是由其受体ospepr介导的，我们利用cripsr
‑
cas9基因编辑技术，以水稻品系中花11号(zh11)为背景材料，创制敲除ospepr1(水稻数据库rap
‑
dbhttps://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html，基因号：os08g0446200)以及ospepr2(基因号：os08g0446200)转基因水稻。最终通过将目的片段pcr扩增后进行一代测序检测后发现转基因水稻株系ospepr1pepr2#1和#2成功敲除了ospepr1和ospepr2。其中ospepr1pepr2#1基因组中ospepr1基因cds上游靶点位置插入个a导致提前出现终止密码子，而其ospepr2基因cds下游靶点位置出现了月1093bp的长片段缺失。ospepr1pepr2#2的ospepr1以及ospepr2基因出现了类似ospepr1pepr2#1的基因突变，仅在ospepr1的cds下游靶点位置有别于ospepr1pepr2#1(图5)。
47.以免疫原活性最高的ospep3浸泡处理10天大ospepr1pepr2突变体和野生型水稻(中花11)叶片30分钟，检测叶片中ros含量的变化，发现ospep3无法诱导ospepr1pepr2突变体的ros爆发(图6)；同样也无法诱导ospepr1pepr2突变体的mapk的磷酸化(图7)。这说明ospep3小肽的免疫功能依赖于其受体ospepr介导的免疫信号通路。
48.综合以上所有实验结果可以看出外施人工合成的ospep3小肽，能够激活水稻的抗虫抗病免疫信号通路。
49.2.1喷施ospep3小肽能增强水稻对褐飞虱的抗性
50.ospep3小肽对水稻免疫的激活能力提示其是一种潜在的生物农药，可以通过外施的方式快速提高水稻的抗病抗虫力。为此，我们采用喷施(将小肽水溶液装入小型喷壶，距离水稻植株5cm处对全株进行均匀喷施直至植株表面滴液为止)的方法对4叶期的zh11和ospepr1pepr2水稻进行ospep3小肽的水溶液(浓度10μm)处理后以每株15头3龄若虫的方式接种褐飞虱，ospep3连续处理10天后观察水稻对褐飞虱的耐受性。实验结果显示ospep3处理后的zh11褐飞虱耐受性明显要高于对照未处理组(使用mock处理后接褐飞虱)，而ospep3处理则无法增强ospepr1pepr2对褐飞虱耐受力(图8)。这说明ospep3小肽处理能增强水稻对褐飞虱的耐受性。
51.除了耐受性以外，水稻还能够通过分泌挥发性次生代谢物驱离害虫，从而提高其
对害虫的抵抗力。为此，我们将zh11和ospepr1pepr2水稻以每盆各两株幼苗的密度种植在同一个方盆(长:宽:高:15厘米:15厘米：25厘米)。待水稻长到1个月大，采用喷施的方式(同上)对水稻进行ospep3处理。处理24小时后，以每盆60头3龄若虫的密度接种褐飞虱。褐飞虱取食48小时后统计每株水稻上褐飞虱的数量。实验结果显示，相比于对照未处理组(使用mock处理后接褐飞虱)ospep3处理可以有效地提高水稻的驱虫性，减少停留在其上的褐飞虱数量(图9)。
52.综上所述，ospep3处理可以提高水稻对褐飞虱的耐受性和驱虫性，从而增强对褐飞虱的抗性。
53.2.2ospep3小肽能增强水稻对稻瘟菌的抗性
54.为了验证ospep3小肽能否提高水稻对稻瘟病的抵抗力，我们采用喷施的方法(同2.1)对1个月大的zh11和ospepr1pepr2水稻进行ospep3处理，24小时后剪下8厘米长度的水稻叶片。然后用移液器枪头将剪下来的水稻叶片轻轻地戳破表皮，造成伤口，随后在伤口上滴5μl稻瘟菌孢子悬浮液(2x105个孢子/ml)。之后将滴有稻瘟菌孢子的叶片漂浮在0.1％6
‑
ba水溶液(添加10μm ospep3或者水作为对照)中，28℃,12小时光照/12小时黑暗培养7天后统计叶片病斑大小。实验结果显示ospep3处理后zh11水稻叶片的病斑大小明显要小于对照组，同时ospep3处理如预期一样未能改变ospepr1pepr2水稻对稻瘟菌的易感性(附图10)。
55.同时为进一步量化病害程度，我们将发病的病斑组织均一打孔后提取dna，利用荧光定量pcr技术检测病斑组织中稻瘟菌的生物量。稻瘟菌生物量的量化是以稻瘟菌看家基因mopot2基因与水稻看家基因osug基因的dna量比值作为参考。实验结果显示，ospep3处理后的zh11水稻病斑组织中的稻瘟菌生物量明显要少于对照组。
56.以上结果表明通过ospep3处理可以有效地增强水稻对稻瘟菌的抗性。
57.附录：部分使用的实验方法：
58.1)固相化学法合成ospep小肽
59.ospep小肽的合成由武汉星皓生物科技有限公司委托完成。合成步骤为先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复(缩合
→
洗涤
→
去保护
→
中和及洗涤
→
下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽，其中α
‑
氨基采用fmoc(9
‑
芴甲氧羰基)保护。
60.2)活性氧ros爆发检测
61.将7天大水稻幼叶打孔成0.25cm2小叶片，水溶液中过夜培养后，将水溶液置换为反应液，同时根据实验需要增加ospep3处理(10μm ospep3水溶液+0.05％silwet
‑
l77)或者对照处理(去离子水+0.05％silwet
‑
l77)等，反应30分钟内用化学发光检测仪varioskan lux(thermo)进行实时检测。反应液配方为：200μm luminol,0.01μg/μl horseradish peroxidase。
62.3)水稻mapk蛋白磷酸化检测
63.将7天大水稻叶片剪成均一等长的小片段后，用液氮研磨成粉后，加入2x sds
‑
page蛋白上样缓冲液(北京碧云天，货号p0015b)后，100℃加热煮沸5分钟。将煮沸后的蛋白经过10％sds
‑
page(赛默飞，货号np0326box)电泳后，电转至pdvf膜(默克，货号ievh85r)，
用5％脱脂牛奶封闭1h，后转移至含有α
‑
mapk抗体(sigma,货号：ma5
‑
15174)的牛奶
‑
tbst缓冲液(索莱宝，货号t1081)中过夜孵育，后用tbst缓冲液洗涤，加入含有二抗的牛奶
‑
tbst缓冲液室温杂交2小时，用tbst缓冲液洗涤干净。pdvf膜上加入化学发光底物supersignal west femto kit(thermo scientific)，用化学发光检测仪检测信号。
64.4)pyl
‑
crispr/cas9
‑
ospepr1/2载体的构建
65.pyl
‑
crispr/cas9
‑
ospepr1/2载体的构建参考相关文献(ma x.and liu y.crispr/cas9
‑
based multiplex genome editing in monocot and dicot plants.curr.protoc.mol.biol.2016.115:31.6.1
‑
31.6.21)，首先根据文献描述利用以下引物进行2轮pcr获得含有osu6a,osu6b,osu6c以及osu3m启动子驱动的靶向ospepr1/2sgrna表达框，并最终利用bsai限制性内切酶和t4 ligase连接酶将sgrna表达框连入含有crispr/cas9相关元件的pyl双元载体。
66.osu6at1f:gccgtagcccttctttctctgtct
67.osu6at1r:aaacagacagagaaagaagggcta
68.osu6bt2f:gttgtgcgctataccatagctct
69.osu6bt2r:aaacagagctatggtatagcgca
70.osu6ct3f:tcagctcaaactacaacacaatg
71.osu6ct3r:aaaccattgtgttgtagtttgag
72.osu3t4f:ggcatccgctacagcatagctct
73.osu3t4r:aaacagagctatgctgtagcgga
74.其中t1,t2,t3,t4分别靶向ospepr1，ospepr目标区域的sgrna。其他引物参考相应文献。
75.5)ospepr1/2突变体水稻的创制
76.野生型水稻中花11号(以下简称zh11)种子表面消毒后接种至n6培养基进行愈伤诱导，28℃暗培养一个月，挑选亮黄色的胚性愈伤，转移至n6培养基上相同条件下进行继代培养。继代培养2周后，将愈伤浸泡在含有pyl
‑
crispr/cas9
‑
ospepr1/2质粒农杆菌的侵染培养基中进行转化，滤干后转移至共培养培养基上，28℃继续暗培养2天。将转化完成的愈伤用无菌水清洗表面后转移至含有筛选抗性的筛选培养基上，28℃暗培养，每隔2周继代1次，至重新长出新的致密亮黄色愈伤后，将新愈伤接种至分化培养基，28℃培养7天后，再转移至分化培养基上，25℃光照培养至长出幼苗后，转移至含有潮霉素的生根培养基中，25℃光照培养至足够强壮后，移栽至室外，获得t1代转基因水稻，转基因水稻阳性苗的筛选方法参见附录中的2。
77.n6培养基货号：c0203.0001(艾美捷科技)；
78.侵染培养基：n6d2(n6加2mg/l 2,4
‑
d)液体培养基+乙酰丁香酮as(100μm)；
79.共培养培养基：n6d2+as(100μm)固体培养基+1.5％琼脂；
80.筛选培养基：n6d2+特美汀timentin(50mg/l)+潮霉素hyg(50mg/l)固体培养基+1.5％琼脂；
81.分化培养基：n6d2+6
‑
ba(2mg/l)+naa(0.2mg/l)+特美汀timentin(50mg/l)+潮霉素hyg(50mg/l)+1.5％琼脂；
82.生根培养基：n6d2+naa(0.2mg/l)+特美汀timentin(50mg/l)+潮霉素hyg(50mg/l)
+1.5％琼脂。
83.6)ospepr1/2突变体水稻阳性苗的检测
84.在添加了潮霉素的抗性培养基中萌发7天大的转基因水稻幼苗，剪取50mg叶片，利用dna提取试剂盒(索莱宝，货号：d1500)提取总dna后，利用以下引物将ospepr1和ospepr2靶序列附近片段pcr扩增出来后，委托上海生工生物有限公司利用一代测序技术完成pcr片段测序，分析目标序列的突变。
85.ospepr1
‑
sgrna1
‑
f:ttgtgctgtttgacaaatga
86.ospepr1
‑
sgrna1
‑
r:ttgtaggctcttcataagtc
87.ospepr1
‑
sgrna2
‑
f:caatatctgcacagaaaggt
88.ospepr1
‑
sgrna2
‑
r:cagattatgcatgctaatgt
89.ospepr2
‑
sgrna1
‑
f:ggttgtgattccgcggtgct
90.ospepr2
‑
sgrna1
‑
r:aaggatcccactcaatcgat
91.ospepr2
‑
sgrna2
‑
f:gaggtcaggagaagtatatg
92.ospepr2
‑
sgrna2
‑
r:tagctagatcacaaagacaa
93.7)荧光定量pcr。荧光定量pcr试剂盒(applied biosystems taqman,thermofisher)按照说明书进行荧光定量pcr。
94.8)稻瘟菌生物量定量
95.菌斑如上所述均一取样后，采用植物dna提取试剂盒(同上)提取总dna，利用荧光定量pcr检测稻瘟菌看家基因mopot2以及水稻看家基因osug的dna量。所用的引物为：
96.mopot2_f:acgacccgtctttacttatttgg
97.mopot2_r:aagtagcgttggttttgttggat
98.osug
‑
f:ttctggtccttccactttcag
99.osug
‑
r:acgattgatttaaccagtccatga
100.9)本专利使用到的生物材料
101.本专利使用的水稻(oryza sativa l.japonica)为野生型中花11号，从武汉伯远生物有限公司购买。本专利使用的褐飞虱(nilaparvata lugens)为生物1型，由广东省农科院植物保护所提供。本专利使用的稻瘟菌(magnaporthe oryzae)菌株为guy11，由福建农林大学植物免疫研究中心提供。