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腺病毒的实验室检测技术

花匠小妙招
2024-11-24 18:13

腺病毒（adenovirus）最初由罗（W.P.Rowe）等于1953年在人类腺样增殖体组织培养中分离得到，此病毒名称由此而来，是一群分布十分广泛的DNA病毒，目前已经发现有51个血清型能感染人类。

一、腺病毒概述

腺病毒能引起人类呼吸道、胃肠道、泌尿系统及眼部疾病，少数对动物有致癌作用，在急性上呼吸道感染和肺炎中由腺病毒引起的约占2%~4% ，多发生于儿童。腺病毒引起的急性呼吸道感染可引起暴发或流行，尤其是在学校和托幼机构、部队、医院等。传播途径主要为呼吸道飞沫和直接接触传播。

腺病毒核酸为双股线状DNA，人类腺病毒根据物理、化学、生物学性质和病毒基因组的同源性分为A～F6个亚属，每一亚属包含若干血清型，目前已经鉴定的有51个血清型。用于腺病毒检测的样本应根据病毒感染部位的不同而采集。常见上呼吸道感染患者样本可取自上呼吸道鼻咽腔，咽结膜热患者样本除采集呼吸道样本外，还需采集患者眼拭子样本。

二、腺病毒实验室检测

（一）病毒分离培养

人类腺病毒不能在鸡胚中增殖。除40型和41型外，其他所有人腺病毒都可在连续传代的人上皮来源细胞系如Hela、KB、A549或Hep-2细胞及其他胚胎成纤维细胞上复制并产生细胞病变（CPE），细胞病变的特征是被感染的细胞发生肿胀、变圆、折光性很强，聚集成葡萄串状。细胞培养阳性分离物可采用PCR和实时荧光PCR技术检测病毒核酸进行鉴定。

（二）血清学免疫学检测

常采用ELISA间接法检测腺病毒IgM、IgA或IgG抗体。用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgM、IgA和IgG抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。其与酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。

（三）分子生物学检测

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。根据腺病毒的特异性片段设计引物，以样本悬液或病毒阳性分离物中的病毒核酸为模板，经过不断循环的变性、退火、延伸三个基本反应步骤，使目的基因数量呈指数上升，经鉴定扩增产物的分子量大小，以初步判定是否检测到腺病毒的特异性核酸片段。

目前，市疾控中心微检所采用实时荧光定量PCR法检测腺病毒核酸。针对腺病毒高度保守区域设计特异性引物和探针，结合SYBR Green I荧光染料技术，可用于腺病毒实时荧光定量PCR检测。SYBR Green I是一种能与双联DNA结合发光的荧光染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，根据荧光信号可以检测出PCR体系存在的双链DNA数量。实验室可以在获得样本后3~4h内，利用分子生物学方法对腺病毒感染做出判定，及时指导现场采取有效控制措施。