基于MSAP的牡丹复色花DNA甲基化分析
【摘要】： 牡丹原产中国,花色丰富,娇艳多变。在牡丹众多的花色表型中,复色花最为稀少珍贵,具有较高的观赏价值。但牡丹复色花形成的机理,目前尚不清楚。探讨牡丹复色花形成机理对指导牡丹花色调控以及牡丹复色花育种具有重要意义。本研究选取花色表型较稳定的牡丹复色花品种‘岛锦’及红色对照品种‘太阳’(‘岛锦’为‘太阳’的芽变品种)作为研究对象,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对‘岛锦’和‘太阳’花瓣以及‘岛锦’红色和粉色花瓣分别进行基因组DNA甲基化水平和模式分析,对DNA甲基化差异修饰位点进行克隆及序列比对,筛选甲基化差异基因,以期从DNA甲基化角度解析‘岛锦’牡丹复色花形成机制。主要研究结果如下。1、确定了适合的牡丹基因组DNA提取方法。分别用试剂盒法和改良CTAB法对牡丹花瓣进行基因组DNA提取,进行结果对比。结果表明改良CTAB法,虽然步骤繁琐、耗时长,但提取结果优于试剂盒,提取的DNA质量较高、无拖带现象,更适用于后续试验分析。2、优化了MSAP技术体系。探索并优化牡丹MSAP技术体系,确定了最佳双酶切时间为1h,酶连产物稀释20倍,从100对引物组合中筛选出31对扩增条带清晰、稳定、多态性好的引物组合。3、初步确定了较低的DNA甲基化水平与‘岛锦’牡丹复色花形成有关。对破绽期、初开期、盛开期的‘岛锦’牡丹红、粉色花瓣基因组DNA进行了甲基化水平分析。31对引物共扩增出4035条清晰可辨的条带,其中甲基化位点有1983条,占总扩增条带数的49.14%。在全部扩增位点中,检测到红色花瓣的基因组DNA甲基化水平在47.55%-58.45%之间,粉色花瓣的基因组DNA甲基化水平在44.42%-47.54%之间。粉色花瓣的DNA甲基化水平总是低于红色花瓣,特别是在初开期时,差异显著。该结果表明较低的DNA甲基化水平与‘岛锦’牡丹复色花形成有关。4、初步确定了较高比例的去甲基化模式与‘岛锦’牡丹复色花形成有关。对破绽期、初开期、盛开期的‘岛锦’牡丹红、粉色花瓣基因组DNA进行甲基化模式分析,发现共扩增出下列4种甲基化模式:维持甲基化(A型)、重新甲基化(B型)、去甲基化(C型)和未确定模式(D型,所占比例较小,不计入分析)。A型模式在三个不同开花时期发生的比例较高,分别为76.80%,57.11%和83.14%,可以看出在‘岛锦’牡丹红、粉色花瓣中,以维持甲基化模式占主导地位。B型和C型为多态性甲基化模式,其中,B型模式在三个不同开花时期发生的比例分别为11.27%,11.49%,8.31%;C型模式分别为11.93%,31.40%和8.55%。发现在相同时期C型模式的比例总是高于B型模式,特别是初开期时,差异显著。该结果表明较高比例的去甲基化模式与‘岛锦’牡丹复色花形成有关。推测某些关键基因在‘岛锦’牡丹花瓣中发生了去甲基化,促进了基因的表达,最终导致了花色差异。5、确定了1个负调控‘岛锦’牡丹花青苷合成的基因——PsbHLH1基因。通过对85条甲基化特异性条带的回收、连接转化和测序分析,共BLAST比对得到1个与花青苷合成相关的基因,即PsbHLH1。通过其在‘岛锦’牡丹不同开花时期的qRT-PCR分析,发现粉色花瓣中的相对表达量总是高于红色花瓣,表明PsbHLH1基因对‘岛锦’牡丹花青苷合成具有负调控作用。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2020
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