牡丹观赏花型发育和延缓开花的分子生理基础
牡丹观赏花型发育和延缓开花的分子生理基础
【摘要】： 牡丹(Paeonia spp.)为我国传统名花,已有1600多年的栽培历史,花朵雍容华贵纵览群芳,冠有“花中之王”的美誉。河南洛阳、山东菏泽等地每年举办牡丹文化节,来自国内外的游赏客人熙熙攘攘络绎不绝。但牡丹花期短、开花时间集中,难以满足日益增长的美好游赏期待,制约着牡丹花卉经济和文化产业发展。本世纪发展了牡丹籽油新资源食品,‘凤丹’(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang var.lishizhenii B.A.Shen)成为集观赏、药用和油用于一体的多用途牡丹材料。本研究以‘凤丹’等试材,探索观赏牡丹花型(单瓣、半重瓣和重瓣)形成的转录组基因表达调控,揭示延长观赏期的分子生理基础。喷施4种植物生长调节剂:水杨酸(SA)、萘乙酸(NAA)、褪黑素(MT)和油菜素内酯(BR),通过分析花期、生理指标、内源激素、DNA甲基化(MSAP)的变化优化其处理并发掘花期调控相关的miRNA及其靶基因,为揭示牡丹花期调控分子遗传机制和延长观赏花期提供理论依据和技术途经。主要结果如下:1.同株植物三种花型发育过程的转录组差异表达基因富集于植物激素等通路,发掘花器官形成功能基因2个。花梗、花托、花萼、花瓣、雄蕊和柱头转录组测序共获得360.19 Gb的clean data,通过Trinity软件进行拼接和D-HIT软件聚类去冗余,获得55,934条Unigene,平均长度为1108.5 bp。其中,31,910个Unigene被注释到NR、KOG、GO、Swissprot、egg NOG、KEGG、Pfam数据库中。营养生长到生殖生长过程中的差异表达基因,花梗与花托、花托与花萼、花萼与花瓣、花瓣与雄蕊以及雄蕊与柱头之间分别为3783、89、4747、444和4235个;单瓣与半重瓣、半重瓣与重瓣和单瓣与重瓣之间分别为4257、2959和3786个。GO和KEGG分析发现,营养生长向生殖生长转变以及花器官发育过程中,差异表达基因主要富集于植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等通路。5个Unigene注释为AGAMOUS(AG)的同源基因且与雄蕊和心皮形成相关,1个Unigene注释为PISTILLATA 1(PI 1)的同源基因且与花瓣和雄蕊形成相关。这为以植物生长调节剂延缓开花提供技术依据。2.‘凤丹’平桃期的叶片喷施四种植物生长调节剂,BR 0.050 mg/L延缓开花时间最长3天,整体花期不变,为最佳效应。其他较好的处理分别为SA 1000 mg/L延缓开花时间最长3天,整体花期缩短1天;MT 40 mg/L延缓开花时间最长2天,整体花期不变;NAA 1000 mg/L延缓开花时间最长2天,整体花期缩短2天。上述条件下,SOD、POD和CAT活性分别提高43.54%-139.10%、24.91%-54.11%和42.86%-52.33%,MDA含量降低30.29%-38.31%,可溶性糖和可溶性蛋白含量无规律性变化。喷施SA、NAA、MT,‘凤丹’内源激素赤霉素、激动素、吲哚-3-乙酸含量分别降低18.73%-76.38%、6.23%-57.34%和26.77%-65.29%;脱落酸含量开花前增加35.30%-221.05%,赤霉素/脱落酸降低13.61%-82.34%;水杨酸含量则无规律变化。同时,MSAP全甲基化率和半甲基化率分别降低7.02%-10.82%和11.17%-27.26%。3.BR通过影响2条通路的miRNA及其靶基因表达延缓‘凤丹’开花。(1)‘凤丹’花瓣全长转录组测序,共产生22.25 G的raw data,过滤后获得21.27 G的clean data,13,978,732条subreads,694,572条ROI。reads聚类校正后,Quvier>0.99的转录本有135,541条Isoform,去冗余后获得62,229个Isoform。其中,58,218个Isoform被注释到NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Interpro、GO数据库中;富集到54个GO条目和20条KEGG通路中。通过与数据库比对,共获得53,760条CDS,最大长度为6,375 bp。(2)BR 0.050 mg/L处理的‘凤丹’进行miRNA和转录组测序,鉴定出60,442个Isoform,22个已知的miRNA和84个novel miRNA。miRNA和转录组联合分析,预测到18个已知的miRNA对应376个靶基因,23个novel miRNA对应177个靶基因。靶基因进行GO分析,注释到29个功能组中,包含生物过程、细胞组分和分子功能;KEGG分析注释到62条途径中,包含细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢和生物体系统。通过miRNA及其靶基因表达量分析和注释,筛选出6个miRNA及其对应靶基因3个。其中,2个miRNA(Po-miR156b和Po-miR172a)对应靶基因分别注释为SQUAMOSA PROTEIN BINDING LIKE 9(SPL9)的同源基因和APETALA 2(AP2)家族的第7个同源基因(AP2 7);4个novel miRNA(Po-novel＿miR2、Po-novel＿miR36、Po-novel＿miR60和Po-novel＿miR79)对应靶基因注释为SUPPRESSOR 1(SPA1)的同源基因。miRNA及其对应靶基因的结构特征通过克隆和生物信息学分析发现,Po-miR156b和Po-miR172a形成稳定的二级茎环结构,成熟序列产生于基因前体序列的5'端臂上;Po SPL9开放阅读框为1128 bp,编码375个氨基酸且含有SBP保守结构域,属SPL转录因子;Po AP2 7开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸且含有AP2保守结构域,属AP2/ERF转录因子。Po-novel＿miR2、Po-novel＿mir36、Po-novel＿mir60、Po-novel＿mir79的二级结构均可形成稳定的二级茎环结构,成熟序列产生于基因前体序列的5'端臂上。(3)miRNA与其靶基因对BR的响应机制通过RT-q PCR分析发现,6个miRNA与其靶基因的表达趋势相反。miRNA与转录组联合分析发现两条响应通路:(1)增加PomiR156b而抑制Po SPL9的表达,促进FUL和LFY表达和依序促进下游Po-miR172a和抑制Po AP2 7表达;(2)增加Po-novel＿miR2、Po-novel＿mir36、Po-novel＿mir60、Ponovel＿mir79的表达而抑制Po SPA1表达。本研究发现,花器官发育相关的5个Unigene注释为AG的同源基因,花型相关的1个Unigene注释为PI 1的同源基因;BR 0.050 mg/L喷施‘凤丹’平桃期叶片通过促进PomiR56b/Po-miR72a和Po-novel＿miR2、Po-novel＿mir36、Po-novel＿mir60、Ponovel＿mir79,分别抑制两条通路的靶基因表达而延缓开花;为揭示牡丹花型分子调控机制和延长观赏花期提供分子生理基础和技术途经。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2022
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