花药培养

• 花匠小妙招
• 2024-08-28 15:55

花药培养（精选九篇）

花药培养 篇1

1花药组织培养发展概况

自1964年Guha等利用曼陀罗花药培养出单倍体［１－２］以来,各国的科学家都开始致力于花药离体培养的研究,并且发展飞速。1972年以来, 人们陆续开展了对观赏植物进行花药组织培养诱导培育单倍体植株的研究。随着花药组织培养技术的发展,花药培养技术开始应用于其它领域。 在植物遗传研究方面,花药培养单倍体可以产生纯种植株,还可以创造突变体;在植物育种研究时,利用花药离体培养技术,可以提高选择效率, 加快育种进程。自花药组织培养研究至今,利用花药离体培养技术产生单倍体植株,已经被广泛应用到28科68属170多种植物上［３］。据不完全统计,已经有23科52属约300种高等植物的花药组织培养取得成功［４］,其中还包括大麦［５］、玉米［６］、大豆［７］、梨［８］、橡胶［９］、桃［１０］、杨树［１１］、苹果［１２］、荔枝［１３］、龙眼［１４］多种经济作物。我国科学家在花药离体培养单倍体方面做出了杰出的贡献,从培育出世界上第一个作物新品种到培育出高产、抗病、适应强的玉米、小麦。近年来在花卉新品种和中药的快繁方面也做出了很大的贡献。

2花药组织培养的影响因素

花药组织组培过程会受到外植体、培养基、接种方式和培养条件的影响,只有选择合适的材料及培养基,正确的接种并培养在适当的条件下,才能更好地保障花药组织培养的成功。

2.1植物材料的影响

不同的材料或同一材料的不同时期花药组织培养的成功率存在明显差异。不同基因型的材料,花药组织培养的效果不同,且不同品种之间也存在很大差异。一般茄科植物花药培养较容易成功,同属禾本科的大稻、大麦的培养效果良好,而棉花、大豆的花药组织培养至今未成功。

花药组织培养时植物材料的花药发育时期是决定是否成功的关键因素,不同植物的花药对外界刺激敏感的时期不同。研究者在花药组织培养研究中发现,花药只有发育到一定时期才会对外界刺激敏感,不是任何时期的花药都可以组培出愈伤组织或胚状体。多数植物在花药发育的单核期特别是单核中后期对外界刺激非常敏感,利于组培的成功,但也有些植物稍早或稍迟。例如,小麦、玉米在单核的中期诱导最佳,烟草、水稻的花粉在单核的中期至双核都可以诱导成功,而大麦、 番茄最佳花药诱导时期为单核的前期。

2.2培养基的影响

花药组织培养主要应 用MS 、 N 6 、 B 5 、 Nitsch等基本培养基 , 再加以适宜配比的植物调节物质 , 不同植物花药组织培养的最适培养基配方不同 。

2.2.1基本培养基基本培养基直接影响培养材料的生长,对花药培养成功的影响很大,目前花药组织培养时广泛应用的基本培养基为MS。从20世纪60年代到80年代,20余年的花药组培研究中,研究者们不仅证实了一些普遍适用的培养基如MS、Miller和Kitsch,而且根据一些植物花药培养的特殊要求,设计了几种新的培养基配方, 如适用于小麦的C１７和适用于水稻、玉米的N６培养基等,从而提高了花药愈伤组织的诱导率和分化成苗的频率。例如,葡萄花药愈伤组织诱导和植株再生的最适基本培养基为改良的B５［１５］,而枣花药组织培养的最适基本培养基为MS［１６］,红景天花药组织培养使用基本培养基MS和B５都效果较好［１７］。

2.2.2生长调节剂培养基中诱导分化和分裂的植物生长调节剂的水平和配比对花药组培起至关重要的作用。据以往研究结果可知,对于大多数禾本科植物,如水稻、小麦、大麦的花药组培中, 外源生长素特别是生长素2,4-D对于启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织是不可缺少的。培养基中激素水平和配比不仅会影响组培的诱导率,还会直接影响花粉的发育,如小麦花粉在2mg·L－１的2,4-D培养基上发育形成愈伤组织,在较低浓度2,4-D或较高浓度激动素的培养基上,发育形成胚状体。禾本科植物花药培养时,培养基中必须同时具有生长素和细胞分裂素,而草本植物花药组培时需要的生长调节剂暂未发现固定规律。对于细胞分裂素,在不同植物花药脱分化培养基的配合使用是不同的。如小苹果［１８］、橡胶树［１９］、七叶树［２０］花药组培时只能用KIN与2,4-D配合使用;葡萄［２１］花药组培时用6-BA、KIN和2,4-D配合使用。

2.2.3碳源培养基中碳源的种类及浓度与花粉的发育密切相关。花药组培研究开始一直以蔗糖作为碳源,近10年来,开始尝试用麦芽糖、葡萄糖等作为碳源。在矮牵牛花药组培研究中发现, 麦芽糖不仅能替代蔗糖,还能提高愈伤组织诱导率,提高分化能力。碳源浓度的不同,决定了培养基的渗透压,还与花药发育成苗密切相关。如烟草花药在不含蔗糖的培养基上培养,不能发育成苗,蔗糖浓度为1%~4%时花粉能发育成苗。

2.2.4其它花药培养的培养基除了基本培养基、激素和碳源会影响诱导效果,培养基的状态和一些附加物质会影响花粉的发育。例如,小麦花粉培养基中添加水解乳蛋白对愈伤组织的形成有一定影响;玉米花药培养基中添加酪蛋白水解物对组培有显著作用;在烟草花药培养时,加入1% 活性炭,提高出苗率1~4倍;玉米花药愈伤组织诱导时,加入0.5%活性炭使诱导率提高一倍;在培养基中加入聚蔗糖,使花药漂浮在液体培养基表面,保持通气良好,能显著提高培养效果。

2.3接种的影响

花药组织培养过程中,接种前的预处理、材料的消毒方式及接种的密度都与花药组培的成功及效果密切相关。

2.3.1预处理的影响材料在接种前适当的预处理可以提高花药愈伤组织诱导率,常用的方法有低温处理、热处理、化学药剂喷施处理,其中最有效的是低温预处理。对离体花药进行2~6℃ 的低温预处理,有助于花粉植株的诱导［２２］,因为低温可以阻止纺锤丝的形成,打破有丝分裂正常过程,导致发生分化,并且可以抑制小孢子的衰败,延长小孢子存活时间。例如,在烟草花药组织培养时,在5~8℃ 条件下分别预处理24、48、96及120h,结果表明处理48h时,诱导率最高;水稻花药组织培养时,稻穗低温预处理10d效果最佳［２３］。

2.3.2消毒方式的影响组培中的污染问题严重影响成功率。在自然界采集的花蕾一般都带有各种微生物,接种前的消毒工作十分重要。通常适用于接种的花药大多没成熟,花蕾含苞待放,花药基本上处于无菌状态,所以花药的消毒主要针对于外部微生物的污染。一般的消毒方法有2种,用75% 酒精对花蕾进行表面擦拭;或先用70%酒精表面消毒30s,反复无水冲洗,2次,每次3min,然后0.1%HgCl消毒10min,用无菌水冲洗4~7次。

2.3.3接种密度的影响在花药组培时,接种在培养基上的花药之间呼吸代谢会相互影响,存在竞争关系,因此花药接种的密度会直接影响愈伤组织的诱导频率和效果。李春玲［２４］在长期的花药组培研究中发现,50mL的锥形瓶培养基接种10个花药,其胚状体诱导率最高;梁高涛等［２５］在对马铃薯花药组培的研究中发现每瓶40个花药的接种最适。

2.4培养条件的影响

花药组培过程中,培养时的温度和光照也是重要的影响因素。一般离体培养的花药对温度十分敏感,大多数植物花药在25~28℃温度下培养是最适的,不同温度条件下培养效果也会有很大差异。如,曼陀罗花药分别在15、25、30℃条件下培养,在高温下胚状体诱导率高,低温下胚状体难以形成。不同植物花药对光反应不同,如烟草花药在低温的白光或红光中效果明显较好,曼陀罗花药培养中,红光抑制花粉胚产生,而紫光和蓝光促进芽的形成。

3花药组织培养的应用

花粉具有数量多、呈游离状、体积小、形态均一以及便于人工控制的特点,花粉花药组织培养技术已成为遗传学、生理学和生化学研究的常用方法。通过花药组培技术可获得单倍体组织和植株,通过染色体加倍可获得纯合的二倍体植株,因此,花药组培可应用于育种研究和基础理论研究。 花药组培相比较常规的育种方法,具有加速杂种纯合,缩短育种年限和选择效率高的特点。此外, 花药组培还可以从远缘杂种的花粉中诱导出单倍体,克服远缘杂交不育的难题。利用花药组培技术,现已培育出大量新品种,尤其是玉米、水稻和小麦的新品种,使其产量和品质都有所提升［２６－２７］。

4花药组织培养存在的问题及其展望

花药培养 篇2

1.教学目标

（一）知识与技能：

1、识记被子植物花粉发育的过程

2、通过学习花药培养的基本技术，培养设计试验、动手操作、分析解释实验现象的能力

（二）过程与方法：

1、列表比较花药培养与组织培养

2、选择适宜的培养材料和培养基

（三）情感、态度与价值观：

1、培养动手实践、勇于探索的科学探究素质

2、通过讨论花药离体培养技术在生产实践中的应用，帮助学生确立理论联系实际的观点

2.教学重点/难点

1、课题重点

选取适宜的培养材料和培养基

2、课题难点

选取适宜的培养材料和培养基

3.教学用具

多媒体、板书

4.标签

教学过程

（一）引入新课 利用植物的茎可以经过组织培养得到新植株，但这种方法同时也存在着一定的缺陷，繁殖出来的新植株往往无法获得一些新的性状。本节我们将学习花药离体培养技术，这是一种信的育种技术。

（二）进行新课 1．基础知识

活动2：阅读“被子植物的花粉发育”，回答下列问题：

1．被子植物的花粉是在花粉管中由生殖细胞经过减数分裂形成的。2．结合教材内容填下列示意图：

〖思考2〗由此可见，被子植物的花粉的发育要经历 四分体 时期，单核 期和 双核 期等阶段。

〖思考3〗在正常情况下，一个小孢子母细胞可以产生 4 个精子；在一枚花药中可以产生 很多 个花粉。

〖思考4〗营养细胞在花粉萌发过程中的作用是什么？ 控制花粉的萌发并提供营养。

活动3：阅读“产生花粉植株的两条途径”，讨论并回答下列问题：

1．产生花粉植株（即单倍体植株）的两种途径：一是花粉通过 胚状体 阶段发育为植株，二是通过 愈伤组织 阶段发育为植株。这两种途径的区别主要取决于培养基中 激素 的种类及其 浓度 的配比。

2．填写培育花粉植株的途径图解：

3．胚状体的结构及其发育过程与种子相似，所以把胚状体到从芽的过程称为 分化，而把从愈伤组织到从芽的过程称为 再分化。

活动4：阅读“影响花药培养的因素”，回答下列问题：

1．影响花粉植株的主要因素： 材料的选择 和 培养基的组成 等。2．材料的选择：

①从花药来看，应当选择（初花期、盛花期、晚花期）的花药；

②从花粉来看，应当选择（四分体期、单核期、双核期、萌发期）的花粉； ③从花蕾来看，应当选择（完全未开放、略微开放、完全盛开）的花蕾。〖思考5〗除此之外，你认为影响花粉诱导成功率的因素还有哪些？

植物的种类、亲本生长条件、材料的低温处理、接种密度、培养基组成、培养的环境条件等。

〖思考6〗为什么不选择使用单核期之前或之后的花粉？

单核期之前，花药质地幼嫩，容易破碎；单核期之后，花瓣开始松动，消毒困难。〖思考7〗花瓣松动会给材料消毒带来困难的原因是 外界环境中的微生物容易侵入到花药中。

2．实验设计

活动5：阅读“材料的选择”，回答下列问题：

1．选择花药时一般通过 镜检 确定花粉发育时期，此时需要对花粉细胞核进行染色，最常用的染色剂是醋酸洋红溶液 和 焙花青－铬钒溶液，它们分别可以将细胞核染成 红 色和 蓝黑 色。2．在使用焙花青－铬钒溶液时，需要首先将花药用 卡诺氏固定液 处理20min。该试剂的配制方法是将 无水酒精和冰醋酸 按体积比为 3：1 的比例混合均匀。

活动6：阅读“材料的消毒”，填写下列流程图：

〖思考8〗月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？ 在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。活动7：阅读“接种和培养”，回答下列问题：

1．剥取花药：消毒后的花蕾，要在 无菌 条件下除去花萼、花瓣。

〖思考9〗剥取花药时，一是注意不要损伤花药，原因是 容易从受伤部位产生愈伤组织 ；二是要彻底除去花丝，原因是 花丝不利于愈伤组织或胚状体的形成。

2．接种花药：剥取的花药要立刻接种到 培养基 上。每个培养瓶接种 7～10 个花药。3．培养：花药培养利用的培养基是 MS 培养基，pH为 5.8，温度为 25 ℃，幼苗形成之前（需要、不需要）光照。

〖思考10〗在花药培养基中，用量最高的激素是 IAA ；在诱导丛芽或胚状体培养基中，用量最高的激素是 BA ；在诱导生根的培养基中，用量最高的激素是 IAA。

4．培养20－30d后，花药开裂，长出 愈伤组织 或释放出 胚状体。前者还要转移到 分化培养基 上进行分化培养成再生植株；后者要尽快 分开 并转移到新的培养基上。

5．通过愈伤组织形成的植株，常常会出现 染色体倍性 的变化，因而需要鉴定和筛选。〖思考11〗为什么通过愈伤组织形成的植株会发生染色体倍性的变化？

有些是由花粉发育形成的单倍体花粉植株，有些是由花粉壁细胞发育形成的二倍体花药壁植株。

活动8：培养过程梳理

栽培选育：鉴定和筛选染色体的倍性变化 活动9：界定花药离体培养和单倍体育种（1）单倍体育种过程：

①在花药离体培养基础上，用秋水仙素继续处理单倍体幼苗。

②染色体加倍，重新恢复为二倍体。由于此二倍体是由单倍体的染色体加倍而来的，所以是纯系，不会发生性状分离(见下图)。

课堂小结

通过本节课题二月季的花药培养内容的学习，熟悉植物花药培养的基本过程,识记被子植物花粉发育的过程，了解影响植物花药培养的各种因素，选择适宜的培养材料和培养基，列表比较花药培养与组织培养。通过学习花药培养的基本技术，培养设计试验、动手操作、分析解释实验现象的能力

月季花药培养的基础知识对于学生来来说具有一定的难度，以往在必修教材的内容中也涉及到过，但不是那么具体。本节课通过教师引导，学生回顾和思考，再经过师生共同总结，起到了很好的教学效果；为了学生能规范地进行实验操作，教师特意安排了录像观看并插入字幕讲述要点，起到了很好的示范作用。

利用生活中的实例来调动学生的学习兴趣，通过讨论花药离体培养技术在生产实践中的应用，帮助学生确立理论联系实际的观点，激发学生对生物科学的兴趣，会让问题的讨论更加激烈，会让每个学生都认真地去思考。充分利用了教材资源、本地资源和学生收集的图片资料等资源，增强学生理论联系实际能力，分析资料的能力以及探究解决问题的能力，培养学以致用的意识。

板书

专题三 植物的组织培养技术 课题2 月季的花药培养

一、基础知识

1、被子植物的花粉发育

2、产生花粉植株的两种途径

3、影响花药培养的因素

二、实验操作

1、材料的选取

2、材料的消毒

3、接种和培养

柱花草花药离体培养研究 篇3

分类号 S541.04

In Vitro Anther Culture of Stylosanthes

SHAN Guoyan1，2） ZHENG Jinlong1，2） GAO Jianming1，2，3）

CHEN Helong1，2，3） ZHANG Shiqing1，2，3） YI Kexian1，2）

（1 Environment and Plant Protection Institute，CATASs，Haikou，Hainan 571101，P.R. China；

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology， Haikou， Hainan 571101；

3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101，P.R. China）

Abstract In order to establish an efficient anther culture system of Stylosanthes， get regenerate plantlet and provide basic materials for the research of ploidy， genomics and molecular biology of Stylosanthes. This experiment taking the anther of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 as explants to study the effect of plant growth regulator， medium and low temperature pretreatment on Stylosanthes anther culture. The results indicated that low temperature pretreatment for 24 h was better than other treatments. N6 medium supplemented with 2，4-D 0.5 mg/L，KT 1.0 mg/L was the best for induction of cullus. MS +NAA 0.2 mg/L + 6-BA 3.0 mg/L was the best for regeneration culture.

Keywords Stylosanthes ； anther culture ； callus induction ； division of adventitious bud

柱花草（Stylosanthes spp.）又名笔花豆，是全球热带地区栽培面积最大、应用最广泛的优良豆科牧草。柱花草原产于南美洲，该属有44个以上的种或亚种[1]。柱花草炭疽病是威胁其推广种植的主要障碍，近年来国内外在柱花草种质资源的收集、引种选育，从体细胞变异或体细胞融合技术中获得抗炭疽病植株以及利用遗传工程获得抗病转基因植株等方面展开了多项研究[2-6]。国外在20世纪60年代就开展了柱花草的组织培养研究[7-8]，但由于所使用的基因型有限，成效不显著。随着遗传工程技术的日益成熟，通过该技术培育更多优良的柱花草品种希望较大。同科柱花草不同品种的组织培养技术国内外已有成功的报道[9-13]。但是目前关于柱花草花药培养研究尚未见报道。

花药培养作为一种新的育种手段，在很多作物育种中得到应用。通过花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期，还有利于诱导花药形成隐型突变体，提高选择效率。所诱导出的单倍体仅有一套染色体，它具有特殊的遗传学特征：（1）遗传的（染色体的）稳定性和变异性；（2）小孢子无性系变异；（3）遗传基因型在纯合的植株水平上充分表达。所以，不仅是研究遗传、变异、重组和表达等遗传学问题的一个理想体系[14]，通过它还可以迅速得到DH 群体、克服远缘杂交不育性、提高育种效率。本试验主要研究影响柱花草花药培养的因素，旨在建立柱花草花药培养技术体系，为今后开展柱花草遗传育种研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

材料为‘热研2号’柱花草的花药，取自中国热带农业科学院热带牧草研究中心。

1.1.2 试验用品

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

2.1.1 愈伤组织形成

柱花草花药离体培养1周左右开始膨大，部分花药颜色由黄色变淡黄色至黄褐色，个别花药出现晶状小水珠。2周左右某些花药颜色发亮，经过1～2 d，发亮的花药逐渐开裂，并从缢痕处生出小白点，逐渐扩大体积，颜色由白变淡黄或黄绿色，这就是愈伤组织。大多数在20 d左右形成愈伤组织，刚开始愈伤组织生长缓慢，但以后逐渐加快，接种20～30 d为愈伤增殖高峰期，35 d后逐渐有褐化现象出现。愈伤组织的形态大致可以分为2种，一种是质地疏松的白色组织，另一种是质地致密的黄绿色组织，有紧实型和疏松型，紧实型中又分表面光滑和不光滑2种。前者颜色较深，在培养过程中慢慢老化死亡，或不分化；后者生长旺盛，分裂能力强，分化成苗的潜力大。故紧实表面不光滑、黄绿色的愈伤组织，具有分化成带有绿色芽点和植株的能力。

2.1.2 不同基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效应

培养基类型对花药愈伤组织的诱导率有明显影响，花药在不同培养基上的长势也不同（表2）。在2种基本培养基比较试验种，以N6培养基的愈伤组织诱导率最高，MS次之。同时，N6培养基上的愈伤组织发生时间最早，愈伤组织直径也大于MS培养基所诱导的愈伤组织。N6培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效果优于MS培养基。试验说明，不同基本培养基对诱导柱花草花药愈伤差异较大。以N6培养基最适合柱花草花药愈伤诱导。

2.1.3 培养基及附加成分对愈伤组织形成的影响

柱花草花药接种于12种培养基上（表3），2.3 生根培养

在分化培养基中的苗长到4～5 cm的时候，将丛生芽由愈伤组织上切下，在无菌条件下分成细小的单株和健壮的单株，分别转接到生根培养基M13和M14中。转接后约过10 d开始生根，生根率均可达90%以上。

3 讨论与结论

（1） 低温预处理对柱花草花药培养的影响

有研究认为，低温预处理的作用是能够提供一个更适合的环境，以利于愈伤组织诱导和诱导期花药存活。接种前的低温处理有利于提高花药培养效率，但确切的机制尚不清楚，可能与一种分子量为32 ku的蛋白质有关[16]。自Nitsch等[17]于1973年首次发现低温预处理可提高毛叶曼陀罗花药培养中胚状体的形成以来，水稻、小麦、大麦等多种作物的花药培养用低温预处理后均可不同程度地提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导频率[18-20]。本试验中，分别对柱花草花药进行4℃低温预处理24、48、72 h，其愈伤组织诱导率均高于对照，在这一点上，与大多数植物的花药培养相似。

（2） 基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的影响

培养基是植物组织培养的物质基础。选择不同的基本培养基，对柱花草花药愈伤组织诱导有着明显的影响，因此有人研制专门的培养基及其附加物，如针对烟草花培的H和T培养基[21]。本实验选取MS、N6两种培养基对花药诱导进行比较，结果表明，MS培养基的诱导率最高，愈伤组织发生时间最早，而且愈伤组织在继代培养过程中色泽、质地均优于N6培养基。因此，在进行柱花草花药培养时，可选择MS培养基作为基本培养基，以提高花药培养效率。

（3） 激素处理对柱花草花药培养愈伤组织诱导的影响

在培养基中加入不同的激素种类及浓度，对柱花草花药愈伤组织的诱导有不同的影响。培养基中激素的种类、用量和配比，对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化起决定性作用，一般低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导率[22]。有研究[23]表明，愈伤组织的诱导形成，生长素是必需的，其中2，4-D应用较多，附加一定浓度的细胞分裂素效果可能更好。本试验结果表明：在柱花草花药培养中，2，4-D对愈伤组织的形成是必不可少的，并且2，4-D与KT配合使用比单独使用KT、6-BA的诱导效果好。不同激素配比对柱花草花药培养的效果有待进一步研究。

柱花草花药培养是获得无毒苗的途径之一，其优点是脱毒率高、安全可靠。在提高花药培养诱导率的基础上，将花药培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，可在短时间内培育出柱花草新品种。特别是以花药培养单倍体愈伤组织或植株作为转化受体，可以实现外源基因的稳定转化，在柱花草转化研究中具有广泛应用前景。

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胡萝卜花药培养的研究进展 篇4

常规育种主要是通过杂交优势, 以雄性不育系作为母本系进行的杂交育种, 以期获得整齐一致、商品性高的杂交种。但由于胡萝卜生长周期长, 并且往往由于亲本的不完全纯合, 使得杂种优势技术不能完全发挥潜力。且胡萝卜自交3~4代后, 会出现严重的自交衰退现象。因此, 加快基因纯合, 缩短育种时间, 成为育种家首先需要解决的问题。为缩短育种进程, 目前国际上广泛采用通过获取单倍体植株, 加倍后成为纯合的二倍体材料, 来用于作物育种, 基因突变及转基因的研究, 如烟草、玉米、小麦、大麦等已成功的将小孢子胚状体的发生与遗传转化结合在一起。获得单倍体的方法主要有:孤雄发育 (花药培养, 小孢子培养) , 雌核发育, 远缘杂交及孤雌生殖。

花药培养是孤雄发育的一种, 指离体花药在适宜的条件下, 小孢子不形成配子体, 而是继续进行细胞分裂或形成孢子体。花药培养的4个阶段: (1) 预处理或者诱导阶段, 目的是将花粉从最初的配子体阶段转变到孢子体阶段; (2) 培养阶段, 诱导小孢子的胚发生; (3) 再生阶段, 使胚状体再生为单倍体植株; (4) 染色体加倍, 用秋水仙素处理或者自然发生。与常规育种相比而言, 花药培养单倍体育种可以较快获得纯合体植株, 较好地利用杂种优势, 提高产量。花药及小孢子组培技术可作为基因变异、转基因及中间基因型获得的辅助手段。

1 影响花药培养的因素

1.1 供体材料的影响

1.1.1 基因型的影响

供体植株基因型是影响花药培养获得DH植株的关键因素。目前已有多种作物发现了与胚状体形成的相关基因。另有学者认为, 花药的胚胎发生反应是由多个基因位点控制的数量遗传性状, 因此, 有可能通过有效基因的积累及相关基因的导入来提高花药的诱导力。

在胡萝卜花药培养过程中, 不同基因型的胚状体发生能力差异显著。Andersen等人于1990年对15个胡萝卜品种进行试验, 仅有2个品种的花药能够被诱导;2003年, Adela和Barbara对21个胡萝卜品种的花药进行了花药培养, 其中, Koral出愈率和出胚率最高, 分别为20.8%和1.2%。另外, Krystyna在2005年对胡萝卜5个不同品种进行了花药培养试验, 也表明基因型对花药培养的效果影响明显, 与Andersen, Adela等人的观点相同, 在这些品种中, HCM A.C.的诱导效果最好, 平均出胚率为5.6%。

1.1.2 小孢子发育时期及供体状况的影响

烟草及芸薹属的一些作物从小孢子单核期至双核中期均可被进行胚诱导, 有学者认为, 双核期能诱导的原因是双核中处于G1期的营养核被抑制并诱导形成了胚状体。大多作物的小孢子胚诱导时期相对严格一些, 多为单核期。Andersen等人于1990年通过对不同时期的胡萝卜花药进行培养, 发现自四分体时期至单核中晚期的花药均可被诱导, 但其中以单核中前期的诱导率为最高, 达到35.1%, 其次是单核中期, 为21.8%。

1.1.3 不同的花序在花药胚状体发生能力上的差异

Andersen等人在1990年的试验中采用了2个品种的204个不同的花序进行花药培养, 仅有26个花序的花药被诱导, 出胚或出愈的花药占到总花药数的0.8%, 且所获胚状体或胚性愈伤组织存在着严重的褐化, 大多再生植株生长势弱, 变异严重, 其中仅有49个花药的胚状体或胚性愈伤能获得健壮的再生植株;同时, 从同一花序的3个不同花药分化形成的再生植株发生了性状分离, 其中1株为正常植株, 其余2株为矮化植株。

1.2 培养基不同成分的影响

作物种类不同, 需要的诱导培养基也不同, 培养基中的硝态氮及铵态氮的浓度及比例对于花药的诱导率有着明显的影响作用。蔬菜作物目前多采用B5或MS培养基作为花药培养的基本培养基。

诱导培养基中多采用生长素及分裂素, 激素的浓度水平和配比对于胚性愈伤或胚状体的诱导有着重要作用。但也有学者认为, 外源激素在小孢子胚状体的形成过程中只起到了次要作用, 且无论是在诱导培养基中还是在再生培养基中, 激素的加入都会使再生植株的品质下降。在胡萝卜花药培养过程中, 国外学者在激素筛选方面做了一定量的工作。Matsubara等人发现, 如果培养基中2.4—D浓度偏高, 将有利于形成胚性愈伤组织, 但对再生植株的发生有抑制作用, 2.4-D浓度过低会使花药的诱导受到抑制。培养基中的碳水化合物不仅调节渗透压, 还是重要的能源物质。Andersen等人认为, 胡萝卜花药诱导培养基中蔗糖浓度的降低会诱导花丝的切口处形成体细胞愈伤组织, Matsubara等人也在试验中发现低浓度蔗糖有利于花药形成愈伤组织, 高浓度蔗糖有利于形成胚状体。

除以上因素会影响花药诱导率外, 往往还在培养基中加入一些特定的附加物, 如活性炭、硝酸银、秋水仙素等来促进花药诱导。Andersen等人在试验中发现, 在胡萝卜花药培养基中加入0.5%的活性炭, 不会促进花药的诱导, 反而对花药的诱导产生抑制作用, 可能原因是活性炭在培养基中不仅吸附了花药培养过程中的一些有毒物质, 而且也吸附了培养基中的各种激素, 另一方面也说明, 胡萝卜花药诱导可能对外源激素的依赖性较强。

1.3 培养条件的影响

温度预处理是指在花药培养前对花药通过低温、高温及变温进行的胁迫处理。接种前对花药进行冷激及热激处理时, 花药中会产生一系列高度保守的冷激或热激蛋白, 如MAR32、HSP70和HSP90等。这些蛋白质改变了细胞的蛋白组成及膜的结构, 影响花药分化必需蛋白质的合成, 阻断花药的正常分化, 使孢子体的形成成为可能, 且研究认为这些蛋白的积累与出胚率的高低呈正相关。

另外, 一些研究表明, 光照也可能会影响花药培养效率。Krystyna等人通过试验认为, 将胡萝卜花药置于27℃下, 暗培养至胚状体出现的诱导率要高于27℃下暗培养2周后, 将花药转接到同种培养基上培养, 并持续照射白光的诱导率。

2 离体条件下小孢子细胞结构的改变

2.1 细胞器的演变

花药或小孢子在培养时, 经历了细胞器及细胞质的剧烈演变调整, 在溶酶体的作用下, 原有的部分细胞器被降解。花药或小孢子在培养前, 通常具有一个大的明显的液泡, 液泡中含有一定量的电子团物质;细胞质内含有一定量的细胞器:尚未继续分化的质体 (通常在下一发育阶段会分化为多种类型的细胞器) 呈延长状并具有较浓的间质, 大量的核糖体及由内质网围绕成的球状物等。小孢子或花药培养时, 一些刚分化形成结构的细胞重新返回到新陈代谢旺盛的状态。随后, 随着一系列新的细胞器的再生及旧的细胞器的解体, 胚发生花粉粒进入休眠状态, 此时会有利于形成胚状体及胚性愈伤组织;而对于培养的双核花粉粒而言, 从配子体途径向孢子体途径转变的关键是营养细胞的细胞器结构的退化。

Sangwan等人在1989年结合电子显微镜和细胞化学技术对毛曼陀罗的小孢子进行了研究, 认为细胞的自我吞噬对于小孢子从配子体向孢子体的转变有着重要的意义, 小孢子在这一过程中会形成自我吞噬型液泡, 一些细胞器发生降解, 形成一种不稳定的生理状态, 使得配子体向孢子体的转变成为可能。

2.2 细胞骨架的改变

雄核诱导时通常伴随着小孢子有丝分裂过程中微丝和微管的改变, 如当小孢子核周围的胞质丝转变为皮层下胞质丝时, 液泡发生破裂;细胞核移到较为中央的位置时, 细胞丝穿过液泡与核周细胞质相连接等。小孢子或花药培养时, 小孢子合成一层较厚的纤维壁, 并定位于小孢子的内壁附近。绒毡层深度为1~2层细胞厚度。培养时, 发现其发生了降解现象, 花药外壁结构性质发生改变, 在花粉壁开始降解之前, 花粉胚状体在旧的细胞壁里形成新的细胞壁。

细胞骨架的重新构建可能会对小孢子发育的转变具有促进作用, 通过化学胁迫或者将微管系统打乱, 能够启动小孢子的全能性。经热激处理后培养的小孢子随着细胞核移向中央位置, 小孢子内出现了微管形成的分裂期带, 而正常发育的小孢子并不会出现分裂期带。

3 再生植株的自然加倍现象

3.1 再生植株的自然加倍机理

离体条件下的花药或小孢子在适宜的培养条件下正常发育途径被抑制, 细胞全能性被启动, 得到再生植株。但所获植株中除单倍体植株外, 往往还有不同比例的因自然加倍而获得的双单倍体、同源三倍体及同源四倍体植株。

Jensen认为, 染色体加倍的发生共有4种方式:核内有丝分裂、C—有丝分裂、核内复制及核融合。核内有丝分裂分裂指染色体进行了复制分离, 但由于纺锤体的功能缺失, 使其染色体发生了加倍;C-有丝分裂是核内有丝分裂的一种特殊形式, 是指在秋水仙素的影响作用下, 最终导致了染色体加倍;核内复制是由于姊妹染色单体没有分离, 从而导致染色体加倍, 如果复制多次发生, 将会导致多线染色体。核融合是指小孢子经过第1次不对称减数分裂后, 形成了营养核和生殖核, 生殖核随后分裂为2个生殖核, 在外界诱导的影响下, 小孢子成膜系统被破坏, 相邻两核发生融合, 包括营养核、生殖核之间的融合, 或2个生殖核之间融合, 之后进行分裂形成胚状体。当2个核未进行DNA复制时, 融合后会形成二倍体, 但1个以上的核开始进行DNA复制时, 便会形成三倍体, 四倍体植株, 核融合对于再生植株的自然加倍有着重要意义, 是染色体自然加倍的最可能发生的加倍方式。

染色体数目加倍机制, 目前还不太清楚。许多学者研究认为, 雄核诱导的染色体加倍应涉及小孢子有丝分裂过程中微丝和微管的改变。正常的小孢子在进入双核期时, 会形成一个不对称的纺锤体, 完成不对称分裂, 形成营养核及生殖核。Hu和Kasha在试验中发现, 小麦的诱导小孢子非对称纺锤体不能形成, 发生均等分裂, 并由于随后没有细胞壁的形成, 出现了核融合现象。

3.2 影响再生植株自然加倍的因素

小孢子的微丝和微管可能参与了核的迁移、小孢子壁的形成及小孢子多极化的建立。Simmonds和Keller认为微管系统的再重组是胚发生的关键环节。如果采用一定程度的胁迫预处理, 如一定时间的低温预处理, 使用一定浓度的秋水仙素等, 可能会扰乱诱导小孢子的微管系统, 诱导胚状体的形成, 并且可能会使早期阶段的胚状体染色体加倍, 从而产生完全加倍及可育的再生植株。另也有学者报道认为, 一定的预处理可能会延迟细胞周期。

雄核发育, 诱导过程中很多因素会影响到染色体的加倍, 其中小孢子诱导时的时期对于DNA的复制及染色体加倍频率有着重要的影响。Touraev等人报道说, 将处于G1期的烟草小孢子进行饥饿及热激处理, DAN仍会继续进行复制, 但不会进入G2期, 而对于处于G2期的小孢子进行胁迫处理, 游离小孢子仍会继续进行有丝分裂。对于培养的双核花粉而言, 营养核在受到胁迫处理后, 会进行DNA的合成, 但不会进入G2期;但生殖核不会受到胁迫处理的影响, 仍保持在G2期, 因此, 不同的小孢子周期经过不同的预处理后, 会有不同的DNA合成及合成时间。

低温预处理可能会影响微管系统, 使小孢子进入对称分裂, 诱导胚的发生, 引起染色体的自然加倍。Hu和Kasha对小麦小孢子进行28 d的4℃低温预处理, 发现花药的正常发育途径被打破, 核发生了不均等分裂, 随后形成多胚结构。Shim及Kasha同样对大麦小孢子进行28 d的4℃低温预处理, 也发现核发生了不均等分裂, 形成1个小的生殖核和1个大的营养核, 在第2次分裂时, 营养核发生了有丝分裂, 形成三核, 此时DNA水平是G1期的3倍。

含笑花药用价值是什么 篇5

据《本草纲目》等医书记载和科学考证，天然的植物花含笑花 草不但以其艳色、美形于香味使人赏心悦目，而且含有丰富的营养成分、生物活性成分以及天然植物精华。根据花草所含的不同营养成分和药用功效，结合专家们多年的实践经验，将具有相同功效的天然花草有机组合，并根据花色、花型、花香与品种调配成具有不同美容养颜和保健功效的花草茶系列。

饮用花草茶不仅可使人心情愉悦、振奋精神、还具有活血调筋、养肤养颜、安神减压、纤身美体、保健强身和祛病延年的神奇功效。经常饮用还可使皮肤细嫩红润、光洁亮丽、富有光泽和弹性。花草等植物中含有丰富的养分和特效成分。具有抗氧化作用，从而延缓人体的衰老过程。能松弛紧张的神经，有助于镇静身心、去除紧张、安抚烦躁的情绪，恢复身心的平衡。振奋精神，激发活力，消除疲劳。

小型西瓜花药愈伤组织诱导条件 篇6

关键词：西瓜；花药；愈伤组织；诱导

中图分类号： Q943.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0030-03

小型西瓜又名迷你西瓜，果型小巧外形美观，肉质鲜嫩多汁，瓜薄皮而少纤维，已成为一种高档礼品。近年来，随着人们生活水平的提高以及小型化家庭的发展，小型西瓜作为一种新兴的西瓜优良新品种，市场发展前景十分广阔，现已经成为高效农业项目之一[1]。目前，小西瓜品种主要依赖进口，种子价格很高，选育优良小型西瓜新品种是促进西瓜产业发展的重要因素[2]。采用常规育种手段选育新品种不仅耗时耗力、效率低，而且难以显著提高新品种的产量、品质及抗性等。通过花药培养获得纯系材料，是一种行之有效的育种途径，既可以大大缩短育种时间，提高育种效率，节省人力和物力，同时也可为分子标记和基因研究提供材料基础。薛光荣等研究，获得西瓜花药再生植株，但是愈伤组织的诱导率及分化率均较低，且重复性较差[3-4]。袁万良等通过改良培养基将愈伤组织诱导率从0.5%提高到94.4%[5]。魏瑛研究表明，低温预处理对西瓜花药愈伤组织诱导有促进作用[6]。缑艳霞等在西瓜花药离体培养影响因子研究中发现，适当添加激素以及4 ℃条件下低温预处理也可提高愈伤组织的诱导率[7]。有关小型西瓜花药培养至今未见相关报道。

本试验研究了花药横径大小、激素浓度组合、低温预处理、热激处理对西瓜花药培养愈伤组织诱导的影响，旨在确定西瓜花药培养的最佳条件，为西瓜花药培养体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为齐齐哈尔园艺研究所西甜瓜研究室提供的2份小型西瓜种子，均为高代自交系，分别编号G1和G2。材料于 2014年 2 月初催芽播种，4 月初定植于温室，于开花期取新鲜花蕾进行试验。

1.2 方法

1.2.1 取材和消毒

于西瓜盛花期晴天08：00—09：00，选择健壮植株的花蕾，将G1花蕾按照横径不同分为4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3组。首先将花蕾于70%的乙醇中表面消毒30 s，再用0.1% 的 HgCl2 浸泡 8 min，最后用无菌水冲洗 3次，每次 5 min。

1.2.2 激素处理

剥取G1和G2无菌花蕾的花药接种于诱导培养基上。诱导培养基以MS为基本培养基（蔗糖40 g/L+琼脂7.5 g/L），分别添加不同质量浓度的6-BA和NAA，共计9 个激素组合处理，以不添加任何激素的培养基为对照（表1）。利用愈伤组织诱导率最高的培养基进行后续试验。

1.2.3 低温处理

取供试材料G2花蕾120个，随机分为4组，再用湿纱布包裹好，分别于4 ℃下预处理0、24、48、72 h，花蕾预处理完毕后，分别剥出花药接种于“1.2.2”节筛选出的诱导培养基上进行培养，每瓶5枚花药，每个处理接种6瓶。

1.2.4 热激处理

采集G2大小一致的花蕾，剥取花药接种于筛选出的诱导培养基后，先在33 ℃条件下12 h的热激处理后再转为25 ℃培养，以始终25 ℃培养为对照，各处理接种50枚花药，共计10瓶。25 d后统计愈伤组织诱导率。

以上处理后均置于25 ℃黑暗条件下培养25 d后，统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的花药数量/接种的花药数量×100%。

2 结果与分析

2.1 花蕾大小对愈伤组织诱导的影响

将大小不同花蕾的花药于MS培养基后，置于25 ℃环境下暗培养25 d后，愈伤组织诱导率见表2。不同大小的花蕾其花药愈伤组织的诱导率有显著差异，横径在4.6～5.0 mm的花蕾诱导率最高，达36.00%，显著高于其他组；其次是横径在5.1～5.5 mm的，为24.00%，最低的是横径在4.0～4.5 mm 的，仅为18.00%。横径为4.6～5.0 mm时，外植体的褐变率显著低于其他2组。本试验中西瓜花蕾直径处于4.6～5.0 mm时，花药愈伤组织的诱导效果最好。

2.2 不同激素配比对花药愈伤组织诱导的影响

2種基因型材料在9种激素组合的培养基中都能诱导出愈伤组织（表3），且愈伤组织诱导率存在一定的差异，2种基因型材料都在M2 （MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）培养基中愈伤组织诱导率较高，分别达到了4552%和3050%；并且M2号培养基诱导的愈伤质量最好，外植体褐化率也较低。在试验中还观察到，不同花药形成愈伤组织形态特征不同，一种愈伤组织质地疏松，呈绿色或者白色；另一种愈伤组织质地紧密、色嫩绿，有光泽，愈伤组织多由花药顶端及中部由里及外生长。当NAA激素超过1.0 mg/L时，生成的愈伤组织比较疏松白化，培养时外植体容易褐化死亡，当NAA浓度为1.0 mg/L、6-BA浓度为1.5 mg/L时形成的愈伤组织质地致密，色泽亮绿，质量较好。

2.3 低温处理时间对花药愈伤组织诱导的影响

利用M2培养基对G2花药进行培养，研究不同低温处理时间对花药诱导率的影响（图1）。当低温处理时间为48 h时，花药愈伤组织的诱导率最高，达40.67%，处理时间为 24 h 时，诱导率达35.00%，当预处理时间延长至72 h时，诱导率仅有32.33%，但均高于对照21.00%的诱导率。

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2.4 热激处理对西瓜花药愈伤组织诱导的影响

将G2花药接种在M2培养基上，将部分培养基于33 ℃下进行12 h的热激处理，之后置于25 ℃的环境下培养，花药愈伤组织诱导率结果见表4。进行热激处理的花药愈伤组织诱导率显著低于未经处理的对照，花药褐化率也明显高于未进行热激处理的。

3 讨论

花粉发育阶段对诱导雄性单性生殖至关重要，是能否诱导成功及诱导频率高低的内在因素之一，关系到是否能产生胚性愈伤组织，进而也关系到培养效果。在大多数作物花药培养中，花粉发育时期选用的都是单核靠边期[8]。但在试验中对每个花蕾进行镜检过于麻烦，如果找到适宜诱导愈伤组织形成的花蕾大小，可让培养过程更加简单。本试验中将花蕾按照横径不同分为4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3组，分别进行诱导，诱导结果横径在4.6～5.0 mm的花蕾诱导率最高，达36.00%，显著高于其他组，在后期试验中可以根据花蕾横径进行挑选试材。

不同培养基对植物花药的培养效果不同。王玉英等在甜椒花药培养中对N6、MS、NTH 3种培养基的培养效果进行了对比，结果发现MS和NTH培养基既能很好地产生愈伤组织，也能形成胚状体[9]。陈肖师将MS、H、B5、Nitsch和NTH 5种培养基的诱导率进行了比较，发现MS培养基的效果最好[10]。本试验中以MS为基本培养基，在试验中发现2个基因型材料在9种激素组合的培养基上都能诱导出愈伤组织，但是不同激素组合诱导频率存在一定的差异。G1基因型花药愈伤组织诱导率总体要高于G2基因型，但是M2培养基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）上2个基因型的愈伤组织诱导频率均最高而且质量最好，外植体褐化率也较低。后期试验中就可以在MS基本培养基中添加上述激素浓度进行诱导。

诱导花药形成愈伤组织的质量受低温预处理的时间长短影响[11-12]。Sunderland认为，低温作用机理不在于改变纺锤体的轴向，而在于使花粉保持生活力，使其不在数天内死亡[13]。徐武等推测低温处理作用是改变了花药中内源激素的含量，阻断了花粉正常发育途径，使其由配子体发育途径向孢子体发育途径转变[14]。黄斌也认为，低温致使花药内源激素发生变化，进而愈伤组织形成；低温处理使花药的壁细胞及绒毡层逐渐解体，导致小孢子孤立化，使绝大部分小孢子保持其生活力[15]。基于以上研究，本试验对花药进行了不同时间的低温预处理，结果表明，低温处理 48 h时，花药愈伤组织的诱导率最高，达40.67%，其次是处理时间为24 h时，诱导率达3000%，最低的是处理72 h，仅有32.33%，但均高于对照处理21.00%的诱导率。表明适宜的低温预处理可以提高花药愈伤组织的诱导率。

组织褐变的主要原因是由多酚氧化酶催化多酚类物质氧化生成褐色物质所致，褐变与多酚氧化酶的活性及酚类物质的含量密切相关[16]。夏铭等采用45 ℃处理红豆杉外植体，发现热激处理对克服褐变是有效的[17]。Martin等研究认为热激处理抑制了多酚氧化酶的合成[18]。本试验结果与以上研究结果相反，前期热激处理的花药愈伤组织诱导率明显偏低，而且褐化率高于未进行热激处理的花药。本结果与 Fukumoto 等在冰山莴苣组织培养中的研究结果[19]一致。

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金莲花药用研究进展 篇7

关键词：金莲花,金莲花药渣,药用

金莲花 (Trollius Chinensis Bunge) 又名旱金莲, 为毛茛科金莲花多年生草本植物。《本草纲目拾遗》中谓其“味苦、性寒、无毒”, 可“治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛”, 并具“明目、解岚障”之功效[1]。同属植物中, 金莲花 (T.chinensis Bge.) 和亚洲 (宽瓣) 金莲花 (T.asiaticus L.) 均被《中药大辞典》收录供药用[2]。

1 金莲花药用价值

1.1 抗菌活性

近代药理研究表明, 金莲花对绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌等均有明显的抑制作用。刘平[3]研究金莲花总黄酮 (FTLR) 体内外抗菌活性, 结果表明总黄酮对多种细菌有明显的抑制作用, 相等生药量的总黄酮对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用强于金莲花片, 提示FTLR是金莲花抗菌的活性部位。李占林等[4]对金莲花抗菌有效活性进行研究, 通过各种色谱手段和波谱数据分析, 从中分离并鉴定了7个化合物, 其中化合物苯甲酸、 (R) -10, 16-二羟基十六烷酸、芹菜素为首次从金莲花属植物中分离得到, 进一步探索了抗菌成分有机酸的种类。李世相等[5]首次对河北围场地区野生金莲花中的抗菌成分及活性进行研究, 结果表明该地区金莲花中所含抗菌活性成分较高, 并对其进行分离及有效单体的结构鉴定, 为其进一步开发提供基础。有学者[6]对金莲花总黄酮解热作用进行试验研究, 发现其有明显的解热作用, 并有明显的剂量依赖关系。其解热作用机制与抑制细菌内毒素引起的TNF-α, IL-1β和PGE2等致热因子的合成或释放有关。

1.2 抗病毒活性

金莲花水提液有明显的抗病毒作用, 在体外对某些呼吸道病毒有一定的抑制作用。林秋凤等[7]对金莲花总黄酮进行抗病毒活性研究。结果表明, 总黄酮、牡荆甙和荭草甙对副流感病毒有较强的抑制作用。苏连杰等[8]研究金莲花醇提物对流感病毒感染小鼠的保护作用, 从而研究金莲花醇提物的体内抗病毒作用, 结果表明金莲花醇提物对流感病毒感染小鼠引起的死亡有明显的保护作用。

1.3 抗氧化活性

氧化还原反应是生命机体的重要生理生化反应, 以自由基参与的氧化还原反应最为常见。赵二劳等[9]以清除DPPH自由基法, 对金莲花黄酮的抗氧化性进行分析, 结果发现金莲花黄酮能有效地清除DPPH自由基, 其质量浓度与对DPPH自由基的清除率呈正相关, 表明金莲花黄酮具有较强的抗氧化能力。王书华等[10]通过对小鼠抗氧化酶系的检测, 探究金莲花有效成分荭草苷和牡荆苷抗氧化作用以及筛选出抗衰老作用最佳药物的构效关系。结果发现, 金莲花活性成分荭草苷和牡荆苷具有提高小鼠血清总抗氧化能力 (T-AOC) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 的活性, 消除体内过多的自由基, 从而阻断自由基对机体的损伤, 延缓和预防衰老。唐津忠等[11]研究了金莲花中黄酮类化合物对猪油所致的氧化损伤作用, 发现其有明显的抗氧化作用, 且黄酮类化合物的添加量在试验剂量范围内与其抗氧化性呈正相关;当添加量为0.5%时, 金莲花中黄酮类化合物的抗氧化性能可与BHT相媲美;同时还研究了提取物与VC的协同抗氧化作用, 结果表明金莲花中黄酮类化合物与VC有较好的增效协同效应。

1.4 抗炎活性

王如峰等[12]采用巴豆油致小鼠耳肿胀模型, 皮下注射给药方式, 观察牡荆素、荭草素、藜芦酸和金莲花苷四种成分对小鼠耳肿胀的抑制效果, 结果发现四种成分具有一定的抗炎作用, 其抗炎活性强弱顺序为:牡荆素>金莲花苷>藜芦酸>荭草素。

1.5 抗肿瘤活性

孙黎等[13]研究了金莲花黄酮对人非小细胞肺癌A549细胞生长与凋亡的影响及其体外抗肿瘤效应, 发现不同浓度金莲花黄酮作用A549细胞24h增殖抑制明显 (P<0.05) , 其抑制效应具有剂量依赖的特点, 同时上调p53基因表达、下调bcl-2基因表达 (P<0.05) , 从而诱发A549细胞凋亡。

2 金莲花药渣应用研究

2.1 药渣发酵物

中药材经过提取后, 药渣中的小分子成分含量降低, 而粗蛋白的含量相对增加, 通过选择菌种对中药渣进行发酵处理, 水解掉大部分纤维, 使药渣中的粗蛋白、粗多糖含量进一步提高, 高蛋白高多糖的中药渣发酵饲料有利于提高家畜的抗病能力[14]。桑秀妹等[15]研究金莲花药渣的重复利用, 即将其发酵, 测定金莲花药渣中的最大葡萄糖含量, 进而确定金莲花药渣发酵物制备的最优的工艺条件:时间为3天, pH值为8, 温度为27℃。金莲花药渣发酵后, 其微量元素的含量也有所变化。高华君等[16]测定了金莲花药渣发酵物中有益微量元素Mn、Fe、Zn、Se、Cu、I、Co、Mo和有害微量元素Pb、Cd、Hg的含量。结果表明, 发酵后微量元素Mn、Fe、Zn、Cu、I、Co含量明显高于发酵前, 而有害微量元素Pb、Cd、Hg的含量均低于发酵前, 随着发酵时间的延长其降低更明显。对金莲花药渣最佳发酵条件的研究及对其发酵产物中微量元素含量的测定, 为其作为动物饲料添加剂提供了依据。药渣发酵物在一定的剂量下, 还具有一定的抗菌作用。王珊等[17]通过用含不同百分比金莲花药渣发酵物的饲料喂养小鼠, 1周后分别进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染小鼠, 观察小鼠存活时间及小鼠耐高温、低温、缺氧存活时间。结果表明, 喂养金莲花药渣发酵物小鼠对两种细菌感染的病死率均有降低作用, 小鼠生存时间延长, 表明金莲花药渣发酵物有一定的抗菌作用及能增强机体的免疫能力。以上研究表明, 金莲花药渣发酵是金莲花药渣再利用的有效途径。

2.2 药渣水提物

许多中药具有免疫增强作用, 中草药增强免疫的成分主要是多糖类、有机酸类、生物碱、甙类和挥发油类等, 这些成分在药渣中都有不同程度的残留[18]。敖杨等[19]对金莲花药渣进行水提, 研究其对小鼠抗应激反应及免疫能力的影响。将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、金莲花药渣水提物高剂量组 (200g/kg) 、中剂量组 (100g/kg) 、低剂量 (50g/kg) , 各组小鼠均灌胃给药, 1次/d, 连续给药21天。末次给药后测定金莲花药渣水提物对正常小鼠和免疫功能低下小鼠常压缺氧和抗疲劳游泳时间的影响, 同时测定小鼠体质量动态变化、脾指数、胸腺指数和外周血白细胞数。结果发现, 金莲花药渣水提物可以有效地增强正常小鼠和免疫功能低下小鼠抗应激反应能力和免疫功能。由此可知, 金莲花药渣经水提后可重新再利用。

3 结语

水稻花药发育相关基因研究进展 篇8

1 水稻雄性生殖与花药

配子形成一般发生在植物发育晚期, 并受一系列发育过程控制以保证在合适的时间开花完成受精然后结实[8,9]。水稻作为单子叶开花植物, 其雄性生殖发育的显著特征是形成6枚雄蕊, 在孢子体基因和配子体基因的共同作用下, 小孢子母细胞在花粉囊中进行减数分裂产生小孢子, 并进一步发育成花粉粒。当花粉囊开裂时, 成熟的花粉粒被释放出来[10]。花药发育与小孢子发育过程密切相关。

花药中有4个结构相似的小室, 它们都通过药隔与连接组织和维管组织相通。花药形态发生完成时, 药室中央的减数分裂细胞 (也称小孢子母细胞) 由4层壁细胞包围, 由表及里分别为:表皮层、药室内壁、中间层和绒毡层[11]。

2 绒毡层发育相关基因

绒毡层处在花药最内层, 与发育中的小孢子直接接触, 为小孢子发育提供必需的营养和结构物质, 在小孢子母细胞向成熟花粉粒发育过程中起着非常重要的作用。小孢子在绒毡层中发育, 和绒毡层有着直接的物质与信息交流。任何引起绒毡层发育异常的突变都有可能引起小孢子发育异常, 最终导致花粉败育。截至目前, 发现的影响水稻绒毡层发育的主要有YY1[12]、YY2[12,13]、TDR[14,15]、UDT1[16]、RTS[17]等。

氨基酸序列中的二硫键及N末端的疏水区结构常见于不同被子植物花药发育特有基因序列中, 具有以上特殊结构的基因编码蛋白组成一个控制花药发育的蛋白家族。1994年, Hihara等研究发现, YY1与YY2在单核靠边期花药绒毡层细胞中特异表达。YY1含有95个氨基酸组成的开放编码框, 该氨基酸序列包含由8个半胱氨酸组成的二硫桥, 在N末端含有疏水区域, 可能是分泌性的, 且与花药发育有关。YY2的c DNA含有389个氨基酸组成的开放编码框, 与查耳酮合成酶具有很高的同源性, YY2转录产物具有控制花药绒毡层细胞的作用。

RTS也是水稻花药特异表达基因;其没有内含子, 编码携有疏水N-末端的94氨基酸多肽;antisense-RTS转基因植株绒毡层发育受阻, 导致花粉发育畸形, 没有活力。

Udt1在花药中优势表达, 是一个转录因子, 被定位于细胞核中;从减数分裂早期开始, 在次生壁细胞分化形成成熟的绒毡层细胞过程中发挥着重要作用。Udt1基因突变引起雄配子不育。减数分裂前, udt1突变体药室壁及性母细胞正常, 到减数分裂期, 绒毡层分化受阻并空泡化。性母细胞不分化形成小孢子, 花药中间层不解体, 最终药室内无花粉。

TDR和UDT1对花粉发育有相似的调节功能。TDR在绒毡层中特异表达, 编码推测的b HLH蛋白, 参与绒毡层程序性死亡的调控, 被定位在细胞核中。tdr突变体表现为绒毡层和药壁中层解体障碍, 小孢子母细胞萎缩。染色质免疫分析和电泳迁移率改变法试验结果表明, TDR很可能是Os CP1[18]和Osc6[19]分别编码一个半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶阻遏蛋白的直接靶标, 是水稻花药发育及其绒毡层解体过程分子调节网络的一个关键组成。

3 表皮层发育相关基因

花药表皮层是一层角质化的表皮细胞, 主要由角质层蜡质构成, 对防止非气孔失水和病原菌感染以及适应环境压力起着重要作用。迄今为止, 已报道水稻相关基因只有WDA1[20]。花药蜡质缺陷基因Wda1在花药表皮细胞中大量表达。wda1突变体花药中特长链烃类、烯烃、脂肪酸及伯醇的水平严重减少。电子显微扫描分析表明, 花药外层外角质层不存在蜡质晶体, 且小孢子母细胞发育迟缓, 最终由于突变体花药、花粉外壁形成缺陷而终止。

4 其他

Os GAMYB[21]基因影响糊粉层和花药发育过程中a-淀粉酶的表达, 在糊粉层和花药中大量表达, 对花器官发育非常重要。Os GAMYB的突变体营养生长期没有明显变化;而生殖生长期花药皱缩, 花药中无花粉。

除上述已明确功能的基因外, 在过去20年间, 科学家们还发现并克隆到了不少在水稻绒毡层或者花药中特异表达的基因, 包括Osg6B[22], Osg6、Osc4、Osc6, RA8[23], RA39[24]和PS1[25]等, 它们很可能参与水稻花药发育调控。

5 总结与展望

花药培养 篇9

关键词：苯磺隆；油菜；花药；细胞学观察

中图分类号：S565.401文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0128-02

油菜是人们日常生活所需食用油和调味料的重要资源，还可作为一种蔬菜。利用杂种优势是提升农作物产量和价值的重要技术[1-2]，而油菜在产量和一些农艺性状方面具有显著的杂种优势。阻止母本自我受精虽然降低了农作物种子的纯度，但对杂种的获得具有重要的意义。开发利用雄性不育亲本是确保母本异型杂交和大规模获得F1代杂交种子的重要途径。张宝娟等研究表明，通过叶面喷施15～20 mL磺酰脲类除草剂苯磺隆（TM）2次，能诱导甘蓝型油菜中双9号完全不育，且高效稳定，是一种较好的油菜化学杀雄剂[3]。本研究通过苯磺隆诱导油菜品种中双2号，对其花药进行形态和细胞学观察，为揭示化学药物诱导油菜雄性不育的机制提供形态和细胞学依据。

1材料与方法

1.1材料

适合于河北省种植的冬性甘蓝型油菜品种中双2号，由中国农业科学院油料作物研究所提供；化学杀雄剂75%苯磺隆水分散粒剂，由江苏江南农化有限公司生产。

1.2处理方法

2013年9月初，将油菜定植在大田，株行距为0.1 m×0.5 m；11月中旬，将油菜从大田移植到温室，温室条件：温度为16～23 ℃，湿度为65～75%，光照16 h左右；在油菜抽薹高度为15～20 cm、最大花蕾长度为1～2 mm时，按苯磺隆最佳用药量15～20 mL/单株，采用小型手动喷雾器均匀喷施于油菜叶片表面，以喷清水为对照。

1.3细胞学观察

采用石蜡切片法对花药进行细胞学观察。石蜡切片法流程采用李正理的方法[4]，将油菜稳定的可育和不育性花序在双蒸水 ∶无水乙醇 ∶醋酸为6 ∶3 ∶1的改良卡诺固定液中固定24 h；分别用30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇从低浓度到高浓度进行梯度脱水；用二甲苯进行透明，浸56～58 ℃石蜡，包埋；对石蜡块进行固着和整修，用Leica EM UC7超薄切片机进行切片，切片厚度为1 μm；明胶黏贴剂黏片，37 ℃烘干超过24 h；苏木精染色，阿拉伯树胶封片，Olympus BX51显微镜观察，获得70 nm超微结构，用JEM-1230型透射电子显微镜进行拍照。

2结果与分析

2.1形态观察

由图1可见，正常发育的油菜花药（喷清水）生长良好，长而丰满，花粉粒数量众多；苯磺隆诱导处理的油菜，雌蕊显著长于雄蕊，花药发育较差，呈淡黄色，皱缩，呈干燥的三角形，纤维丝薄短，与蜜腺管底端紧密相连，没有花粉粒的形成。

2.2细胞学观察

在花粉母细胞、四分体、单核细胞、成熟期4个发育时期，对中双2号油菜花药的细胞结构进行观察。由图2可见，在花粉母细胞时期，喷清水处理的油菜花药，细胞结构包括1层源表皮、药室内壁、中层及绒毡层，细胞质的染色较均匀（图2-A）；苯磺隆诱导药物处理的油菜花药，细胞源表皮、药室内壁、中层细胞没有发生明显变化，花粉母细胞的数量和形态也未发生改变，绒毡层虽然保持完整性，但有大量蓝色物质聚集在绒毡层细胞中央，周围形成空泡结构（图2-B），与清水处理的花药有明显差别；在四分体时期，苯磺隆处理的油菜花药绒毡层细胞遭到不同程度破坏，与对照（图2-C）相比，其花药虽然包括有完整的绒毡层，但细胞质聚合成块，周围形成空泡状，细胞数量和排布密度都有很大程度降低（图2-D）；在单核期，清水处理的花药小孢子出现空泡化，绒毡层也发生退化，这是单核晚期的表现（图2-E），而苯磺隆诱导处理的花药，其细胞绒毡层发生异常，大小不一，退化延迟，且无细胞核，小孢子细胞发生畸变而无活性（图2-F）；在成熟期，清水处理的花药中已经形成许多去空泡化、可育的小孢子，绒毡层还存在，但已经发生退化（图2-G），而苯磺隆处理的花药绒毡层已经消失不见，小孢子数量很少，即使形成小孢子，也呈空泡化状，呈现败育性状（图2-H）。

3结论

苯磺隆属于乙酰乳酸合酶抑制剂，是一类非常重要的磺酰脲类除草剂[5]，目前对其杂草清除的生化和分子机制已经进行了深入研究[6]。苯磺隆还是一种可高效诱导甘蓝型油菜完全雄性不育的化学杀雄剂[3，7-8]，但当前对其诱导植物雄性不育的细胞学机制还不是十分明确。

通过光学显微镜和透射电子显微镜观察分析苯磺隆诱导处理的油菜花药细胞学形态发现，在花粉母细胞、四分体、单核细胞、成熟期4个发育时期，都能观察到花药细胞有缺陷的绒毡层，花粉母细胞时期绒毡层细胞的细胞质浓缩聚集，形成空泡状结构，绒毡层细胞在单核期退化延迟。除此之外，在苯磺隆诱导处理的花药中，还观察到一些畸变的小孢子，最终导致成熟期花粉的败育，与Cheng等研究结论[9-10]较为相似。这可能是因为苯磺隆诱导处理油菜花药，使各个时期绒毡层的细胞发育异常，包括提早分裂、绒毡层与中间层剥离、延迟降解等，不能提供正常花粉发育所需的成分，形成败育的小孢子，从而诱导油菜雄性不育，这种化学药物诱导的油菜雄性不育，其花药细胞学特性不同于受特定育性相关基因调控的细胞质雄性不育和细胞核雄性不育[11-12]。

参考文献：

[1]李培武，丁小霞，张文，等. 甘蓝型油菜叶片硫甙含量的杂种优势研究[C]//湖北省植物生理学会第十五次学术研讨会论文集，2007：63-68.

[2]傅廷栋. 杂交油菜的育种与利用[M]. 武汉：湖北科学技术出版社，1995.

[3]张宝娟，赵惠贤，胡胜武. 苯磺隆对甘蓝型油菜中双9号的杀雄效果[J]. 中国油料作物学报，2010，32（4）：467-471.

[4]李正理. 植物制片技术[M]. 2版.北京：科学出版社，1987：90-92.

[5]Zhou Q Y，Liu W P，Zhang Y S，et al. Action mechanisms of acetolactate synthase-inhibiting herbicides[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，89（2）：89-96.

[6]Das M，Reichman J R，Haberer G，et al. A composite transcriptional signature differentiates responses towards closely related herbicides in Arabidopsis thaliana and Brassica napus[J]. Plant Molecular Biology，2010，72（4/5）：545-556.

[7]Yu C，Hu S，He P，et al. Inducing male sterility in Brassica napus L. by a sulphonylurea herbicide，tribenuron-methyl[J]. Plant Breeding，2006，125（1）：61-64.

[8]胡海兵. 化学除草剂诱导甘蓝型油菜雄性不育效果与生理机制研究[D]. 雅安：四川农业大学，2012：14-27.

[9]Cheng Y，Wang Q，Li Z，et al. Cytological and comparative proteomic analyses on male sterility in Brassica napus L. induced by the chemical hybridization agent monosulphuron ester sodium[J]. PLoS One，2013，8（11）：e80191.

[10]井苗，董振生，严自斌，等. BHL等4种药物对油菜杀雄效果的研究[J]. 西北农业学报，2008，17（3）：165-170.

[11]González-Melendi P，Uyttewaal M，Morcillo C N，et al. A light and electron microscopy analysis of the events leading to male sterility in Ogu-INRA CMS of rapeseed （Brassica napus）[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59（4）：827-838.

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