吉林农业大学学报2024年1期电子杂志

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• 2024-08-28 20:26

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吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

峰值，是0 h的13.74倍，而对照组整体趋势稳定。

在茉莉酸途径中，由图 5-C可见，JAZ基因处

理组在 0，6，12，36，72 h 整体呈现上调，72 h 达到

最大转录峰值，是 0 h的 6.57倍；而对照整体趋势

趋于稳定，差异不显著。由图5-D可见，COI基因

的处理组在0~6 h出现上调，6，12，36，72 h开始下

调，在72 h时达到最低转录峰值，是0 h的2.32倍，

而对照组整体趋势稳定。

在生长素信号转导途径中，由图 5-E 可见，

MP基因在处理组 0，6，12 h出现上调，随后在 12，

36，72 h 下调，其中在 12 h 达到最高转录峰值，是

0 h时的13.80倍；而对照整体趋势稳定。AUX1基

因在处理组 0，6，12 h 出现上调，随后在 12，36，

72 h 下调，其中 12 h 达到最高转录峰值，是 0 h 的

5.65倍，对照组仅出现小幅波动，但与处理组相比

差异不显著。

图5　红松防御相关的基因表达桥图

Fig. 5 Bridge chart of gene expression related to defense of P. koraiensis

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张平，等：解淀粉芽孢杆菌AW3诱导发病红松的抗病机制

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3　讨 论

PGPR 具有广泛的拮抗特性，通过定殖在植

物根的表面或内部，在促进植物生长和控制病害

的发生方面发挥重要作用［20］

。本研究中的菌株

AW3来源于芜菁变态根，虽然芜菁与红松在植株

形态、分类地位等方面特征不同，且缺乏对宿主的

特异性，但它们都可以生长在低温干旱的恶劣环

境中。研究表明，在自然条件下，使用与宿主共同

进化或相容的菌株对植物进行诱导更为有利［21］

。

诱导宿主植物防御酶活性的表达也是 PGPR

控制植物病害的重要生物防治机制［22］

。例如，

CAT 和 SOD 能够有效清除植物体内的氧自由基

（O2

-

·

），从而对细胞起到保护作用。本研究中对二者

的活性测定结果表明，处理组与对照组相比，SOD

酶在 0~12 h内活性显著增加，对于感病的红松而

言，初期 SOD 酶活性的增加可能是一种应激反

应，推测这种应激反应来自于菌株 AW3 的诱导，

从而避免了由病原菌侵染造成的红松组织坏死，

该结果与王璐瑶等［23］

的研究结果一致。PAL 酶

的活性在处理组初期显著增加，对照组的差异不

显著，说明菌株AW3可以诱导红松防御机制的产

生，该结果与焦姣［24］

的研究结果一致。同样，可

溶性蛋白和可溶性糖广泛参与了植物对生物胁迫

的应答和信号转导过程，其相对含量的增加能够

对细胞起保护作用，本研究中，可溶性蛋白和可溶

性糖的处理组分别在 0，6，12 h 整体呈现上升趋

势，而对照组的差异不明显，说明解淀粉芽孢杆菌

AW3可以缓解发病红松细胞的氧化程度，从而对

其起到保护作用，该研究结果与庞亚琴等［25］

的研

究结果一致。

活性氧（ROS）是植物在各种生物和非生物胁

迫下产生的主要物质。当 ROS 的产生和抗氧化

防御反应失衡时，会引起氧化应激反应［26-28］

。植

物具有多种复杂的细胞防御机制，可以保护自身

免受植物病原体的侵害。本研究在菌株 AW3 对

红松的诱导抗病中，伊文思蓝和 NBT指示整个植

株染色面积有所减少，说明在 AW3 诱导下，寄主

对病原体侵染的早期响应中，产生的超氧化物自

由基迅速清除H2O2，由此释放的H2O2可以通过捍

卫酶的活性来促进植物细胞膜结构增强［29］

。当

菌株AW3用作红松治疗剂时，会触发相关防御酶

活性的变化，从而导致 ROS减少并消除过多的羟

基自由基。因此，在植物感染病原体之前，使用

PGPR 诱导植物可以增强植物对病原体系统抗性

水平的上升，降低由疾病造成的植物死亡率。

菌株 AW3 可以重新激活植物抗病及植物生

长激素相关基因的信号传导途径，这些基因在调

节植物的防御途径中起着关键作用，这主要是基

于宿主与病原体相互作用下进行的复杂网络调

节［30］。研究结果表明，水杨酸途径的 NPR1 和

PR1基因的处理组在试验初期阶段分别出现了上

调，而对照组之间差异不明显。茉莉酸途径的

COI 和 JAZ 基因在初期阶段同样出现上调，已知

SA是SAR信号转导途径的内源性信号分子，该结

果的出现可能与尖孢镰刀菌和菌株 AW3 的营养

特性或与 SAR 和 ISR 信号途径之间的协同作用

有关［31］

。受到非病原性细菌感染后，NPR1 基因

能够通过协同作用介导植物SAR途径和ISR途径

的发生［32］

，即 NPR1 基因不仅能够介导 SA 中的

SAR，还能够介导 JA 中的 ISR［33］

。另外 2 个基因

（AUX1和 MP）的转录趋势，与对照组相比，2个基

因初期均上调，与文献［34］研究结果相同。菌株

AW3对红松的JA和SA信号转导通路有着显著影

响，不仅能够引起红松的 ISR，还会引起 SAR，为

了确保红松对病原体具有广谱抗性，菌株AW3还

诱导了红松中与生长素信号传导途径相关基因的

表达，从而促进其生长。

综上，在尖孢镰刀菌的侵染下，解淀粉芽孢杆

菌AW3能够触发染病红松的防御机制，在相关防

御酶和基因的综合作用下减缓了红松的病害发

生。这可能有助于在野外条件下，更好地利用解

淀粉芽孢杆菌AW3以降低红松病害的发生。

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（责任编辑：王希）

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吉林农业大学学报 2024，46（1）：49-57 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核

表达及产物纯化*

韩 静1

，安一博1

，季世达3

，田 桢1

，刘志华1，2，3**

1. 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈

尔滨 150040；3. 沈阳农业大学林学院，沈阳 110866

摘 要：以棘孢木霉 CGMCC11653 菌株菌丝体总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，克隆全长 717 bp 转录因子

Myb27基因编码序列，其编码238氨基酸组成的多肽。用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域并进行

亚细胞定位、氨基酸多序列比对和进化关系分析，结果表明：其相对分子质量为 27 000，属于 Myb-like DNAbinding结构域的蛋白，亚细胞定位在细胞核中。链格孢菌毒素诱导条件下Myb27的表达有显著变化，可能参

与棘孢木霉抗链格孢菌毒素胁迫应答反应的正向调控。构建原核表达载体 pMAL-Emyb27，转化大肠杆菌

ER2523获得转化子 ER2523-Emyb27，其成功诱导的最适条件为 0. 1 mmol/L IPTG 37 °C 连续诱导培养 3 h；用

PBS+10 mmol/L 麦芽糖洗脱层析柱可得到与 MBP 标签融合的单一可溶性 69 500 重组 rMyb27 蛋白。可见

Myb27转录因子调控抗病基因的表达所结合的顺式作用元件提供体外重组蛋白，为调控棘孢木霉抗杨树叶枯

病链格孢菌毒素胁迫的机理提供理论依据。

关键词：棘孢木霉；转录因子；链格孢菌；毒素胁迫；特性分析；原核表达

中图分类号：S763. 1 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0049-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5926

引用格式：韩静，安一博，季世达，等 .棘孢木霉 Myb27转录因子基因特性分析，原核表达及产物纯化［J］.吉林

农业大学学报，2024，46（1）：49-57.

Characteristics Analysis, Prokaryotic Expression and Product Purifi⁃

cation of Trichoderma asperellum Myb27 Transcription Factor *

HAN Jing1

，AN Yibo1

，JI Shida3

，TIAN Zhen1

，LIU Zhihua1，2，3**

1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China；2. State Key Laboratory

of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China；3. School of

Forestry， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China

Abstract：Using cDNA of the total RNA reverse transcription from the mycelium of Trichoderma

CGMCC11653 strain as a template, the full-length 717 bp transcription factor Myb27 coding se‐

quence was cloned, encoding 238 amino acids polypeptide. The bioinformatics software was used to

predict the physical and chemical properties, structural domains and protein subcellular localization,

and to analyze the multi-sequence alignment of amino acids and the evolutionary relationship. The re‐

sults showed that the protein belonged to Myb-like DNA-binding domain and the subcell was lo‐

cated in the nucleus with a molecular weight of 27 000. The expression of Myb27 changed signifi‐

* 基金项目：国家自然科学基金项目(31870627)，沈阳农业大学引进人才专项基金项目（XLYC2002044）

作者简介：韩静，女，在读硕士，研究方向：林木病害生物防治。

收稿日期：2020-07-18

** 通信作者：刘志华，E-mail：LZHNEFU@126.com

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cantly under the induction of Alternaria toxin, which may be involved in the positive regulation of the

response of Trichoderma against Alternaria toxin stress. The prokaryotic expression vector, pMALEmyb27, was constructed, and the transformant ER2523-Emyb27 was obtained by transforming

E. coli ER2523. The optimal conditions for successful induction of ER2523-Emyb27 were 0.1 mmol/L

IPTG 37 °C for 3 h. A single soluble 69 500 recombinant rMyb27 protein was obtained by eluting the

MBP label with PBS+10 mmol/L maltose chromatography column. This study has provided recombi‐

nant proteins in vitro for the cis-acting elements bound by Myb27 transcription factor to regulate the

expression of disease resistance genes, and theoretical basis for the mechanism of regulating Tricho⁃

derma against toxin stress of Alternaria alternata.

Key words：Trichoderma asperellum； transcription factor；Alternaria alternata； toxin stress； char‐

acteristic analysis； prokaryotic expression

木霉菌（Trichoderma spp.）是优良的病害生物

防治菌［1-4］

。在长期的进化过程中，木霉菌形成了

复杂的基因表达调控系统来应对不同的环境变

化并适应自身生长发育的需要，其中转录因子

发挥着重要的作用。转录因子是转录的基本调控

因子，通常由至少2个域组成，即DNA结合域和激

活/抑 制 域 ，二 者 共 同 调 控 靶 基 因 的 表 达［5］。

THCTF1转录因子在哈茨木霉（Trichoderma harzia⁃

num）T34 中被验证，THCTF1 缺失突变株 ΔD1-38

中无黄色色素沉积，其对尖孢镰刀菌（Fusarium

oxysporum）的生长抑制作用比 T34 降低 33.8%，

ΔD1-38 对尖孢镰刀菌的孢子萌发也无明显抑制

作用，表明 THCTF1 转录因子与次生代谢产物的

产生有关，THCTF1 的缺失会降低哈茨木霉的生

防能力［6］

；哈茨木霉 T34 中过表达 Thmbf1 后处理

灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染的番茄植株与对

照植株的坏死叶面积相似，而 T34 处理的受侵染

番茄植株比对照坏死叶面积减少了 50%，表明哈

茨木霉中 Thmbf1 基因的过表达降低了其对灰霉

病的生物防治能力［7］

；里氏木霉（Trichoderma re⁃

esei）ΔpacC 突变株在 pH≥7 时比野生型的生长速

率显著降低，平板对峙试验显示其突变株对立枯

丝核菌（Rhizoctonia solani）和齐整小核菌（Sclero⁃

tium rolfsii）的竞争能力下降［8］

；深绿木霉（Tricho⁃

derma atroviride）Δste12 突变体菌落发育有所改

变，菌落中心的菌丝数量减少，集中性分生孢子环

形成延迟，对病原真菌的侵染能力和裂解能力也明

显下降，对峙试验显示，与野生型相比突变体14 d

只能部分溶解立枯丝核菌（R. solani）菌丝［9］

；在生

防哈茨木霉Th-33中克隆了1个C2H2型转录因子

编码基因 theam1，敲除该基因显示其铜耐受性比

野生型菌株高 12.9%［10］

；拟南芥（Arabidopsis thali⁃

ana）分别接种深绿木霉（T. atroviride）野生型和

Δxyr1 突变株孢子后，在120 h才能检测到SAR途径

相关基因如PR-1a、PR-2和PR-5转录本的上升，表

明xyr1的缺失会延迟拟南芥防御机制的发生［11］

。

MYB是植物最大的转录因子家族之一，在植

物的抗病性和病原物的致病性中起重要的调控作

用，在植物的抗病机制研究中，能响应病原信号，

调控下游抗病基因的表达，启动防卫反应［12］

。拟

南芥 NtMYB2

［13］在烟草（Nicotiana tabacum）中的

过量表达激活了13-bp基序启动子和苯丙氨酸解

氨酶基因（Pv-PAL2）启动子以诱导 Tol1 和 PAL

基因的表达，在环境胁迫下参与逆转录转座子和

防御相关基因的应激反应；新疆杨（Populus alba

var. pyramidalis）的 2 个 转 录 因 子 PalbHLH1 和

PalMYB90在杨树中共同过表达后，转基因植株中

增强了抗氧化酶的活性和 H2O2的释放，增强了对

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和溃疡病菌（Dothio⁃

rella gregaria）侵 染 的 抵 抗 能 力［14］

；溃 疡 病 菌

（D. gregaria）侵染后，毛白杨转录因子MYB115的

过表达植株病变区域为野生植株的 50%，表明

MYB115过表达增强了转基因杨树对水泡型溃疡

病的抗性［15］

；小麦的 TaMYB4 基因敲除影响其对

条锈病菌（Puccinia striiformis）的防卫反应，防御

相关基因 TaPAL、TaPR1、TaPR2 各时间点转录水

平均降低，而 TaPR5 在 48，120 h 时均降低［16］

；稻

瘟病菌（Magnaporthe oryzae）感染拟南芥 MYB73

突变株，拟南芥突变株PR1、PDF1.2和NPR1的表

达均升高，表明MYB73参与了NPR1介导的SA和

JA 信号通路［17］

；拟南芥转录因子 AtMYB30 异位

表达激活 acyl-coA，改变拟南芥叶片中的 VLCFA

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韩静，等：棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核表达及产物纯化

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

含量，证明 AtMYB30 通过增强 VLCFAs 或 VLCFA

衍生物的合成来调控细胞死亡相关基因［18］

；拟南

芥根部特异性转录因子基因Myb72［19］

调控具有抗

菌活性的莨菪亭（Scopoletin）的生成，可在植物根

际形成相关的微生物群落，促进植物的免疫反应

和生长。

同时，研究人员还发现 Myb 转录因子调控

病原菌的致病性。构建禾谷镰孢菌（Fusarium

graminearum）Myb 转 录 因 子 MYT3 缺 陷 型 菌 株

Δmyt3，该菌株单端孢菌素产量比野生型减少

了 1/10，并且单端孢菌素合成基因 TRI5 和 TRI6

的表达水平也显著下调，可以有效减缓植物的发

病进程［20］

。用链格孢菌（Alternaria alternata）和立

枯丝核菌（R. solani）等 4 种致病性发酵液处理棘

孢木霉后，木霉 TasMYB36 转录因子转录水平上

调，其转入到山新杨后链格孢菌侵染叶片面积较

对照降低了 20%［21］

。但是 Myb 转录因子在真菌

中的报道较少，与植物的抗病性和病原菌的致病

性相比，Myb 转录因子如何调控生防菌抗病原菌

机制的研究较少，因此进一步阐明其抗病机理有

重要的理论和应用价值。

根据前期的转录组测序结果，对14条叶枯病

链格孢菌毒素处理胁迫下木霉 MYB 家族转录因

子进行半定量，结果表明Myb27能响应生物胁迫。

本研究利用聚合酶链式反应（PCR）技术对棘孢木

霉 Myb27 转录因子进行分子克隆，用生物信息学

分析其理化性质等，通过双酶切构建原核表达载

体，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后获

得重组蛋白并进行纯化，以期为进一步研究

Myb27调控抗病基因表达所结合的顺式作用元件

及互作蛋白提供纯重组表达蛋白，为进一步研究

棘孢木霉抗杨树叶枯病链格孢菌（A. alternata）毒

素胁迫的分子机制提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

选 取 棘 孢 木 霉（Trichoderma asperellum）

CGMCC11653菌株（专利号：ZL 2017 1 0192665.0）；

病原菌杨树叶枯病链格孢菌（A. alternata）、蛋白

融合纯化株系 ER2523由沈阳农业大学林学院森

林保护学科林病生防实验室保存；大肠杆菌菌株

（Escherichia coli）DH5α；原 核 表 达 载 体 pMALc5X、限制性内切酶 Nde Ⅰ、Sal Ⅰ和 T4 DNA 连接

酶购自美国NEB公司。

1. 2　棘孢木霉Myb27转录因子基因克隆及生物

信息学分析

用 TRIzol 法提取棘孢木霉菌丝总 RNA，用

1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。取

1 µg RNA 利用反转录试剂盒［宝日医生物技术

（北京）有限公司］进行反转录。以得到的棘孢

木霉 cDNA 为模板，建立 50 µL 反应体系，进行

目的基因的 PCR 扩增。扩增产物用胶回收试剂

盒（广州飞扬生物工程有限公司）回收，将胶回

收产物连接到 pMD19-T 克隆载体上，通过氨苄

（Amp）抗性培养基筛选，挑取单个阳性菌落培养

并提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。

采用 ExPaSy Proteomics Server 提供的在线工

具 Protparam（http：∥www. expasy. ch/tools/prot‐

param. html）预 测 基 因 编 码 蛋 白 的 理 化 性 质 ；

NCBI Conserved Domains Search（https：∥www.

ncbi. nlm. nih. gov/Structure/）预测保守区；PlantmPLoc进行亚细胞定位分析。利用Bioedit软件进

行多序列比对；通过 MEGA7 软件构建 NeighborJoining（NJ）系统进化树，进化距离的计算采用泊

松校正法，Bootstrap重复次数为500次。

1. 3 Myb27转录因子基因对杨树叶枯病链格孢

菌毒素胁迫的响应

在马铃薯液体（PD）培养基28°C 175 r/min振

荡暗培养 10 d 杨树叶枯病链格孢菌菌丝体，超

净台过滤。将滤液加入 MM 培养基中，以加无

菌水的 MM 基本培养基作为对照组。MM 基本

培养基（15 g/L NaH2PO4，600 mg/L CaCl2

·2H2O，

600 mg/L MgSO4

·7H2O，5.0 mg/L FeSO4，2.0 mg/L

CoCl2，1.6 mg/L MnSO4，1.4 mg/L ZnSO4

）和 质量

分 数 为 0.5% 的 葡 萄 糖 和 质 量 分 数 为 0.5% 的

（NH4

）2SO4。经过上述链格孢菌毒素处理后，分别

取样。分别于培养 0，6，12，24，48 h 后收获棘孢

木霉菌丝，并采取 Trizol 方式提取总 RNA［莫纳

（苏州）生物科技有限公司］。之后利用反转录试

剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］反转录获

得杨树链格孢菌毒素胁迫下棘孢木霉 cDNA，为

后续 RT-qPCR 验证试验做好准备。RT-qPCR 反

应引物见表1。

1. 4　原核表达载体构建及诱导表达

根据棘孢木霉Myb27的基因序列设计带有正

51

第57页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

向Nde Ⅰ酶切位点的引物“ATCGCATATGATGGA

TCACAACGGAAGGCGAAG”和反向 Sal Ⅰ酶切位

点的引物“CGATGTCGACATTGTCATTTGCAAAT

GAAAAT”，扩增产物纯化得到目的片段。将得

到的目的片段与原核载体 pMAL-c5X 用 Nde Ⅰ

和 Sal Ⅰ切成双黏性末端，T4 DNA 连接酶连接后

转化到大肠杆菌DH5α感受态中。通过Amp抗性

培养基筛选，随机挑取单个阳性菌落培养并提取

质粒，最后通过双酶切鉴定 Myb27 基因的插入情

况，同时进行测序。

将构建成功的 pMAL-Emyb27 质粒转化到蛋

白融合纯化株系 ER2523 感受态细胞中，Amp 抗

性培养基筛选出阳性单克隆。挑取阳性单克隆

转化子在 LB液体培养基中于 37 ℃，180 r/min过

夜振荡培养后，吸取 50 µL 加入 LB 液体培养基，

将菌液培养至 OD600值约为 0.5 时，加入终浓度为

0.1 mmol/L 的 IPTG，在 37 ℃连续振荡培养 3 h。

吸取 1 mL 菌液于 4 ℃，4 000 r/min 离心收集菌

体，加入 50 µL上样缓冲液重悬，沸水煮沸 20 min

使蛋白质变性，离心收集上清，经质量分数为 8%

的SDS-PAGE电泳检测分析蛋白表达结果。

1. 5　重组rMyb27蛋白诱导表达条件优化

为了得到质量更好的重组rMyb27蛋白，需要

对诱导剂IPTG的诱导温度及诱导时间进行优化。

将 IPTG 诱导浓度设置为 0.1，0.3，0.5 mmol/L 3 个

梯度；诱导温度设为 24，28，37 ℃；诱导时间设为

3，4，5 h；诱导变性处理后进行质量分数为 8% 的

SDS-PAGE 电泳检测，筛选出一组较为合适重组

rMyb27 蛋 白 的 诱 导 条 件 ，为 蛋 白 纯 化 试 验 做

准备。

1. 6　重组rMyb27蛋白的纯化

配制上柱缓冲液（含20 mmol/L Tris-HCl，pH

7.4，0.2 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L

DTT）和 0.5 mmol/L 磷酸钠缓冲液（PBS，pH7.2）；

将诱导好的 ER2523-Myb27 及对照 ER2523-c5X

菌液分别收集菌体，取经超声波破碎离心得到上

清溶液备用；用体积分数为 20% 的乙醇浸泡层析

柱内的垫圈至表面无气泡产生；用体积分数为

70%的乙醇浸泡空柱并冲洗。将垫圈放置在无填

料层析柱内，加入 3 mL Amylose 树脂（美国 NEB

公司），4 ℃静置20 min备用。

用配制好的 PBS过柱 3次后加入超声波破碎

后收集的上清液，保持流速为每秒1滴，用上柱缓

冲液+10 mmol/L 麦芽糖对样品进行洗脱并收集

洗脱液。将收集到的蛋白溶液进行SDS-PAGE电

泳，检测收集到的rMyb27纯化蛋白。

2　结果与分析

2. 1 Myb27基因的克隆及生物信息学分析

以棘孢木霉菌丝总RNA反转录得到的cDNA

为模板，用所设计的引物扩增出单一的 Myb27 基

因条带。在线软件 ProtParam 预测 Myb27 蛋白相

对分子质量 27 000，等电点为 5.78，带正电残基

（Arg+Lys）为 29，负电残基（Asp+Glu）为 35，脂肪

系数为 49.62，总平均亲水性系数为-1.008，说明

Myb27蛋白是亲水的稳定蛋白。Myb27蛋白分析

结果显示其有 2 个 Myb-like DNA-binding 家族保

守结构域。Plant-mPloc 亚细胞预测定位结果表

明该蛋白定位在细胞核中。

通过 BlastP 相似性搜索发现，与 Myb27 相似

的氨基酸序列在GenBank的数据库中有多个匹配

的结果，相似度为 40.00%~88.70%。从中随机选

取 11 个相似度较高的序列进行多序列比对分析

（图 1-A）可见，棘孢木霉（T. asperellum）Myb27基因

与盖姆斯木霉MYB家族基因（Trichoderma gamsii，

XP0186566）的相似性最高，为 88.70%，大丽轮枝

菌MYB家族基因（Verticillium dahliae，XP0096580）

的相似性最低，为51.37%。将搜到的同源性序列进

表 1 RT-qPCR反应的引物

Table 1 Primers of RT-PCR

引物名称

Myb27-5'

Myb27-3'

βtu-5'

βtu-3'

引物序列（5→3）

GCCTTCTTACCATCACCACCGT

GCCTGAATTGCGTCCTGGGAA

TTCTTCCACCTTTGTCGGCAACTCCT

CCTCGTACTCCTCACCATCA

片段长/bp

22

21

26

20

基因

Myb27

β-tubulin-T

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韩静，等：棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核表达及产物纯化

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行进化树分析（图 1-B），棘孢木霉（T. asperellum）

Myb27 基因与盖姆斯木霉（T. gamsii，XP0186566）

在进化上的亲缘关系较近，其他相似度高序列分

布在不同的分支中，说明其亲缘关系较远。

2. 2 Myb27转录因子基因对杨树叶枯病链格孢

菌毒素胁迫的响应

RT-qPCR 结果显示，链格孢菌毒素胁迫 12 h

前，Myb27 基因的表达量呈缓慢下降趋势且在

12 h 时停止下调，此时值最低，其转录峰值是处

理前的 0.89 倍；之后开始上调，在 24 h 上调至最

大值，其转录峰值是处理前的 3.82 倍（图 2），这

表明 Myb27 可能会因为环境等因素使其表达量

前期暂时降低，但受毒素胁迫 Myb27 可能参与

棘孢木霉抗链格孢菌毒素胁迫应答反应的正

向调控，在棘孢木霉抗病应答进程中具有重要

作用。

2. 3　原核表达载体pMAL-Emyb27的构建

经限制性内切酶Nde Ⅰ和Sal Ⅰ切好的pMALc5X 与 Myb27 片段用 T4 DNA 连接酶连接后转入

DH5α 感受态中，挑取阳性单克隆于 37 ℃恒温振

荡过夜培养后提取质粒，双酶切成功得到 2 条条

带，将阳性质粒进行测序。测序结果经比对后结

A. 棘孢木霉 Myb27 与其相似序列的对比，“*”表示同源； XP0186566：盖姆斯木霉 T. gamsii；KKP03036：哈茨木霉 T. harzianum；

RFU79550：苇状木霉 T. arundinaceum；ENH74595：尖孢镰刀菌 F. oxysporum；EQK97424：冬虫夏草菌 Ophiocordyceps sinensis；KYK61829：

圆锥掘式梅里霉 Drechmeria coniospora；XP0080890：禾谷炭疽菌 Colletotrichum graminicola；KXH35935：西蒙氏炭疽菌 C. simmondsii；

ATY65143：XP0085965：球孢白僵菌 Beauveria bassiana；POS71968：向日葵间座壳菌 Diaporthe helianthi；XP0096580：大丽轮枝菌 Verticil⁃

lium dahliae ；B.棘孢木霉Myb27与其相似序列的进化树

图1　棘孢木霉Myb27与其他来源的MYB蛋白氨基酸序列比对及进化树分析

Fig. 1 Comparison of amino acid sequences of Myb27 from T. asperellum and other MYB proteins and analysis of

evolutionary tree

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吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

果正确，可见已成功实现了基因片段与表达载体

的连接，说明原核表达载体 pMAL-Emyb27 构建

成功（图3）。

2. 4　重组蛋白的表达及诱导条件优化

将重组载体 pMAL-Emyb27 转入大肠杆菌表

达感受态（ER2523）中，挑取阳性单克隆 ER2523-

Myb27 转移至 LB 液体培养基（含有 100 µg/mL

Amp）中过夜培养。当培养至菌液 OD600值约为

0.5 时，加入 IPTG 诱导蛋白表达，收集菌体，加入

50 µL上样缓冲液重悬，蛋白质变性后取20 µL进

行SDS-PAGE电泳检测，结果表明rMyb27成功诱

导表达（图4-A）。

为了获得高质量的可溶性目的蛋白，对诱导

剂 IPTG 的浓度，诱导温度及诱导时间进行了优

化。诱导剂浓度梯度设置为 0.1，0.3，0.5 mmol/L

的 IPTG（图 4-B）；温度梯度设为 24，28，37 ℃

（图 4-C）；时间梯度设为 3，4，5 h 分别进行检测

（图 4-D）。以未转入 Myb27 的空载 ER2523-c5X

为对照，诱导收集菌体变性后用质量分数为 8%

的凝胶进行 SDS-PAGE 电泳检测，最终确定用

0.1 mmol/L IPTG，于 37 ℃连续诱导培养 3 h 为最

佳诱导组合条件。

A.pMAL-Emyb27重组载体图；B.Myb27基因的扩增；C.pMAL-Emyb27原核表达载体的酶切验证；M. Marker；M1. DL15000 Marker；

1.目的条带；M2. DL2000 Marker

图3 pMAL-Emyb27原核表达载体构建

Fig. 3 Construction of pMAL-Emyb27 prokaryotic expression vector

图2　链格孢菌毒素胁迫下棘孢木霉Myb27基因表达量

Fig. 2 Myb27 expression of T. asperellum under toxin

stress

A.重组蛋白的小量诱导表达，M.Marker，1. RE2523-c5X IPTG诱导空白对照，2.ER2523-Emyb27 IPTG诱导; B.不同IPTG浓度梯度下蛋白

的表达情况，M.三色蛋白 Marker，1.RE2523-c5X 0.1 mmol/L IPTG，2~4.ER2523-Emyb27 0.1，0.3，0.5 mmol/L IPTG；C.不同温度梯度下蛋

白的表达情况，M.三色蛋白 Marker，1，5.空泳道，2~4.ER2523-Emyb27 24，28，37 ℃，6. RE2523-c5X 37 ℃； D.不同时间梯度下蛋白的表

达情况，M.三色蛋白Marker，1.RE2523-c5X 3 h，2~4.ER2523-Emyb27 3，4，5 h

图4　重组蛋白的小量诱导表达及诱导表达条件的优化

Fig. 4 Small amount induced expression of recombinant protein and optimization of induced expression conditions

54

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韩静，等：棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核表达及产物纯化

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 5　重组木霉转录因子rMyb27的纯化

将上清液上柱后，重组蛋白全部与亲和柱

结合，在流出液中没有相对分子质量为 69 500的

蛋白流出，说明 rMyb27 蛋白与亲和柱结合牢靠。

用上柱缓冲液+10 mmol/L 麦芽糖对样品进行洗

脱并收集洗脱液，每管收集 3 mL，此时蛋白开始

被洗脱下来，并且随着洗脱的进行，大量的杂蛋

白开始被洗去，杂蛋白含量减少。rMyb27蛋白条

带开始变得单一。继续洗脱，杂蛋白被完全洗脱

掉，最后收集到纯度很高的rMyb27蛋白（图5）。

3　讨 论

木霉菌作为重要的生防真菌，新陈代谢活跃，

可以产生大量的酶和次生代谢产物，以达到拮抗

病原菌的作用。经过对前期链格孢菌毒素处理下

MYB 家族基因表达量研究的分析并结合荧光定

量结果显示，棘孢木霉 Myb27 基因在对杨树链格

孢菌毒素胁迫应答过程中起正向调控作用，鉴于

此决定选取此基因进行后续试验。截至目前，许

多MYB家族基因已经在不同的植物物种中得到了

鉴定：在拟南芥（Arabidopsis thliana）中发现鉴定了

198 个 MYB 家族基因［22］

，籼稻（Oryza sativa subsp.

indica）中发现 138 个 MYB 家族基因［23］，陆地棉

（Gossypium hirsutum）中发现 524 个 MYB 家族基

因［24］

。但在真菌中的 MYB 家族基因并未得到广

泛的鉴定与研究，在镰刀菌（F. graminearum）中发

现 19 个 MYB 家族基因［25］，粗糙链孢菌（Neuros⁃

pora crassa）中发现36个MYB家族基因，稻瘟病菌

（Magnaporthe oryzae）中发现13个MYB家族基因，

小麦叶枯病菌（Mycosphaerella graminicola）中发现

37 个 MYB 家族基因［26］

，与植物相比真菌中 MYB

家族基因的种类和功能鉴定具有巨大的潜力。本

研究从棘孢木霉中克隆到了 Myb27 基因，初步分

析表明：Myb27包含2个Myb-like DNA-binding结

构域；系统发育树分析其与多物种的MYB蛋白基

因一致性较高。MYB 家族基因的分子表达特异

性差异与其所调控的生理代谢过程关系密切，在

多种植物特异性过程中发挥作用。在拟南芥中

MYB3R1 和 MYB3R4 证实可能主要通过转录激

活 KN 基因来积极调节胞质分裂［27］

；拟南芥中

MYB58 的过表达调控 LAC4 的表达上调 10 倍，

可 引 起 木 质 素 的 异 位 沉 积［28］。 在 致 病 疫霉

（Phytophthora infestans）中发现 Myb2R4 是一个早

期的孢子调节因子，过量表达 Myb2R4 的转化子

中检测到的孢子囊数量是野生型的 2 倍［29］

；构

巢曲霉（Aspergillus nidulans）中 c-Myb 转录因子

FIbD 的缺失导致孢子的数量比野生型减少了

77.14%［30］

。本研究证实，木霉中 Myb27转录因子

能够响应生物胁迫，可能参与木霉拮抗链格孢菌

毒素的过程以发挥其生防作用。这是对真菌Myb

转录因子功能研究的补充。

在研究蛋白质功能时，常需大量可以纯化的

可溶蛋白质，大肠杆菌作为原核表达系统则提供

了一种经济有效的获得外源蛋白的方法［31］

。在

此过程中选择适当的载体与宿主非常重要，恰当

的载体可以增加外源蛋白的可溶率；采用合适的

融合标签也可以提高宿主中外源蛋白的可溶率，

目前常见的融合标签有 His、GST、MBP、NusA、Trx

等［32］

。甘玉迪等［33］

研究表明，通过对 2 种原核表

达载体——pET32a 载体、pMAL-c5X 载体的构建

和诱导，虽然都可以成功表达茶树多酚氧化酶基

因（CsPPO），但是目的蛋白在使用 pET32a载体表

达时形成包涵体，而pMAL-c5X原核表达载体表达

的Cs PPO出现在上清液中，可得到可溶性Cs PPO，

这与史成颖等［34］

对茶树谷氨酰胺合成酶（Cs GS1-2）

的原核表达分析结果一致。因此，本研究选择

pMAL-c5X 原核表达载体，含有“Ptac”强启动子，

目的基因与 malE 基因（编码 MBP 蛋白）融合表

达，构建了 pMAL-Emyb27 原核表达重组载体，

SDS-PAGE 显示融合蛋白在上清液中表达，可得

到可溶性的 rMyb27。为获得高质量的可溶性目

的蛋白供后续试验，需在原核表达体系中对表达

条件进行优化，其中IPTG诱导浓度，诱导温度，诱

M.Marker；1.纯化下来的与MBP标签融合的rMyb27蛋白目的蛋白

图5　重组Myb27蛋白纯化

Fig. 5 Purification of recombinant Myb27 transcription

factor

55

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吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

导时间是原核表达系统表达外源蛋白的重要条

件。醛酮还原酶AKR7A3进行原核表达时，16 ℃、

20 h、1.00 mmol/L 诱导剂浓度条件下，AKR7A3

可溶性蛋白纯度达到 99.0%［35］

；杜李继等［36］

研究

发现，拟南芥 MYB61在温度为 30 ℃下，用浓度为

1.0 mmol/L 的 IPTG 诱导 2 h，表达的蛋白量最

大。因此，本试验对 IPTG 诱导剂浓度、诱导温度

及诱导时间进行了优化，最终确定 0.1 mmol/L

IPTG，37 ℃诱导 3 h 时 rMyb27 蛋白表达量最高，

确保 rMyb27 蛋白以可溶蛋白的形式得到稳定

表达。

在棘孢木霉中，Myb27 调控木霉对真菌毒素

毒害解毒能力的功能机制尚待进一步研究。酵母

单杂/双杂交可以为完善棘孢木霉 Myb27 的胁迫

应答信号通路提供线索 ；染色体免疫共沉淀

（Chromatin immuneprecipitation，ChIP）等 试 验 可

以用来鉴定转录因子的作用位点和直接调控的下

游基因，但这些方法需要特异性很高的蛋白抗体。

本研究通过优化原核表达试验条件，得到了

Myb27 蛋白稳定表达的方法并将其成功纯化，为

Myb27转录因子调控抗病基因的表达所结合的顺

式作用元件提供体外重组蛋白，也为进一步全面

解析 Myb27 如何调控棘孢木霉解真菌毒素、更好

地发挥生防作用提供了理论依据。

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scriptional activators of the lignin biosynthetic pathway dur‐

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［29］ Xiang Q， Judelson H S. Myb transcription factors and light

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［30］ Garzia A， Etxebeste O， Herrero-García E， et al. The con‐

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［31］ 解庭波. 大肠杆菌表达系统的研究进展［J］. 长江大学学报

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［32］ 张真，汪燕，马振刚 . 提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达

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白表达活性的影响［J］. 茶叶科学，2018，38（4）：396-405.

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［35］ 孙婷婷，孙基丰，周紫薇，等 . 醛酮还原酶 AKR7A3原核表

达条件的优化及酶学活性检测［J］. 长春理工大学学报（自

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2014，37（1）：105-109.

（责任编辑：王希）

57

第63页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：58-63

Journal of Jilin Agricultural University

山兰原球茎途径种苗快繁技术*

张正海，张亚玉**，孙 海，张 悦

中国农业科学院特产研究所，长春130112

摘 要：以1年生球茎产生的原球茎为外植体，以MS为基本培养基，分别研究4种生长素和分裂素对原球茎增殖分

化的影响以及激素组合对原球茎分枝状伸长增殖分化、原球茎分化产生球茎和球茎生根的影响。结果表明：NAA和

ZT利于原球茎分枝状伸长增殖，在NAA 1. 0 mg/L+ZT 1. 0 mg/L时原球茎分枝状伸长增殖系数达到8. 67；IAA和

6-BA利于原球茎分化为球茎，在IAA 2. 5 mg/L+6-BA 2. 5 mg/L时原球茎分化为球茎系数达到5. 14；IAA和6-BA利于

原球茎分化产生的球茎生根，在IAA 2. 5 mg/L+6-BA 0. 1 mg/L时球茎产生根数达到6. 26，每条根重达到9. 90 mg。

关键词：山兰；原球茎；球茎；生长素；分裂素；快繁技术

中图分类号：S682. 31 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0058-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5331

引用格式：张正海，张亚玉，孙海，等 . 山兰原球茎途径种苗快繁技术［J］. 吉林农业大学学报，2024，46（1）：

58-63.

Rapid Propagation Technology of Seedlings from Protocorm of Oreor⁃

chis patens (Lindl.) Lindl.

*

ZHANG Zhenghai，ZHANG Yayu**，SUN Hai，ZHANG Yue

Institute of Special Wild Economic Animals and Plants， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Changchun 130112， China

Abstract：Using protocorm produced by one-year-old corm as explant and MS as basic culture me‐

dium, the effects of four auxins and mitogens on the proliferation and differentiation of protocorm

were studied, and together studied were the effects of hormone combinations on the branching elonga‐

tion, proliferation and differentiation of protocorm, as well as the production of corm and rooting of

corm during protocorm differentiation. The results showed that NAA and ZT were beneficial to the pro‐

liferation of protocorm by branching elongation, and the proliferation coefficient reached 8.67 at NAA

1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L. IAA and 6-BA were beneficial to the differentiation of protocorm into corm, and

the differentiation coefficient reached 5.14 at IAA 2.5 mg/L+6-BA 2.5 mg/L. IAA and 6-BA were ben‐

eficial to the rooting of corm formation from protocorm, and the number of roots reached 6.26 per corm

and the weight reached 9.90 mg per root at IAA 2.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L.

Key words：Oreorchis patens （Lindl.） Lindl.； protocorm； corm； auxin； mitogen； rapid propagation

山兰 Oreorchis patens（Lindl.）Lindl. 是兰科山

兰属多年生阴生草本植物，广泛分布于我国西南、

华中、西北及东北各地，朝鲜半岛至西伯利亚地

区、日本等地也有少量分布［1］

，其干燥球茎入药，

甘、辛、寒，有小毒，具有滋阴清肺、化痰止咳的功

效，用于痈疳疮肿，瘰疬，无名肿毒［2］

，但长期以来

* 基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）

作者简介：张正海，男，在读博士，助理研究员，从事药用植物栽培研究。

收稿日期：2019-09-23

** 通信作者：张亚玉，E-mail：zyy1966999@sina.com

第64页

张正海，等：山兰原球茎途径种苗快繁技术

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

山兰的药用价值并未受到重视，而是被当作山慈

菇伪品对待［3］

，或者作为习用品入药［4］

。近些年，

随着其药用价值的开发，山兰需求量增加，价格暴

涨，导致其野生资源遭到毁灭性破坏，被列为吉林

省三级保护植物［5］

，目前关于山兰的相关研究主

要集中在资源开发［6-7］

、药效成分、药理活性［8-10］

、

野生驯化［11］

以及菌根真菌［12］

等方面，制约山兰大

面积人工栽培的种苗繁育关键技术研究报道极

少［13-14］

。山兰具有兰科植物种子细小、结构简单、

繁殖周期长且球茎分生系数低的共同特点［15］

，因

此，采用组织培养技术进行快速繁殖是解决山兰种

苗稀缺的有效办法。本试验以1年生球茎产生的原

球茎为外植体，分别研究4种生长素和分裂素对原

球茎增殖分化以及激素组合对原球茎分枝状伸长

增殖分化、原球茎分化产生球茎和球茎生根的影

响，形成一个完整的山兰原球茎途径种苗快繁技术

体系，为山兰野生资源保护和开发提供技术支持。

1　材料与方法

1. 1　试验材料

以 1 年生山兰 Oreorchis patens（Lindl.）Lindl.

球茎产生的原球茎（大小约3 mm×3 mm×5 mm）为

外植体。球茎消毒及培养方法参照文献［12］。

1. 2　生长素对原球茎增殖分化的影响

以 MS+6-BA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂粉

4.5 g/L 为基本培养基，分别添加 2，4-D、NAA、

IBA、IAA各0.1，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/L。

1. 3　分裂素对原球茎增殖分化的影响

以 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂粉

4.5 g/L 为基本培养基，分别添加 TDZ、ZT、6-BA、

KT各0.1，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/L。

1. 4 NAA 和 ZT 组合对原球茎分枝状伸长增殖

分化的影响

以 MS+蔗糖 30 g/L+琼脂粉 4.5 g/L 为基本培

养基，以对原球茎分枝状伸长增殖分化效果好的

NAA 和 ZT 进行组合，NAA 质量浓度为 0.1，1.0，

2.0，3.0，4.0 mg/L，ZT 质量浓度为 0.1，1.0，2.0，

3.0，4.0 mg/L。

1. 5 IAA 和 6-BA 组合对原球茎分化产生球茎

和球茎生根的影响

以 MS+蔗糖 30 g/L+琼脂粉 4.5 g/L 为基本培

养基，以对原球茎分化产生球茎和球茎生根效果

好的 IAA和 6-BA进行组合，IAA质量浓度为 0.1，

2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L，6-BA 质 量 浓 度 为 0.1，

2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L。

上述各试验均在温度为 23 ℃、光暗周期为

14 h/10 h、光照强度为 1 500 lx 条件下，培养 55 d

后调查。每处理15个外植体，重复3次。

1. 6　调查项目

原球茎分枝状伸长增殖分化系数=原球茎分

枝状伸长分枝数/接种原球茎数；原球茎分化产生

球茎系数=原球茎分枝状伸长分化产生的球茎

数/原球茎分枝状伸长分枝数；原球茎分化产生球

茎的平均生根数=原球茎分化产生球茎的生根

数/原球茎分化产生的球茎数；平均根重=球茎总

根重/总根数。

1. 7　数据分析处理

试验数据用软件 SAS8.01 进行方差分析，采

用Duncan多重比较法进行显著性检验，检验水平

为P=0.05。

2　结果与分析

2. 1　生长素对原球茎增殖分化的影响

2. 1. 1 生长素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影

响 由表1可知，4 种生长素中，NAA 对原球茎分

枝状伸长增殖效果显著；不同浓度的 NAA 中，

NAA 2.0 mg/L时，原球茎分枝状伸长增殖效果显

著，最大增殖系数达到4.15。

表1　生长素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

Table 1 Effect of auxins on proliferation of protocorm by branching elongation

生长素

2,4-D

NAA

IBA

IAA

ρ/(mg·L-1

）

0.1

1.14b

1.58f

0.50e

1.00c

2.0

0.77c

4.15a

1.92b

0.80d

4.0

1.92a

3.92b

2.18a

1.70a

6.0

1.11b

3.73c

1.50d

1.17c

8.0

1.00b

2.92d

1.77c

1.00c

10.0

0.56d

2.10e

1.50d

1.42b

平均增殖

系数

1.08b

3.07a

1.56b

1.18b

注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下表同

59

第65页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 1. 2 生长素对原球茎分化产生球茎的影响 由

表2可知，4种生长素中，IBA和IAA对原球茎分化

产生球茎效果显著且两者无差异，但 IAA 处理的

原球茎分化产生球茎系数高于IBA，IAA 6.0 mg/L

时原球茎分化产生球茎效果显著，最大分化系数

达到0.75。

2. 1. 3 生长素对原球茎分化产生球茎生根的影

响 由表3可知，4种生长素中，IBA和IAA对原球茎

分化产生球茎生根效果显著且两者无差异，但IAA

对原球茎分化产生球茎的生根数高于 IBA；IAA 在

4.0 mg/L和6.0 mg/L处理的原球茎分化产生球茎

生根数均显著高于其他浓度，且两者无差异，IAA

6.0 mg/L处理的根数高于4.0 mg/L处理，达到1.67。

2. 2　分裂素对原球茎增殖分化的影响

2. 2. 1 分裂素对原球茎分枝状伸长增殖分化的

影响 由表4可知，4种细胞分裂素之间对原球茎

分枝状伸长增殖的效果无显著差异，但ZT处理的

增殖系数最高；ZT 2.0 mg/L时原球茎分枝状伸长

增殖效果显著，最大增殖系数为2.08。

2. 2. 2 分裂素对原球茎分化产生球茎的影响 由

表 5 可知，4 种细胞分裂素中，6-BA 对原球茎分

化产生球茎 效 果 显 著 ；6-BA 6.0 mg/L 处 理 的

原球茎分化产生球茎系数为 0.56，显著高于其

他浓度处理。

2. 2. 3 分裂素对原球茎分化产生球茎生根的影

响 由表6可知，4种分裂素中，6-BA对原球茎分

化产生球茎生根效果显著；6-BA 6.0 mg/L处理的

原球茎分化产生球茎的生根数显著高于其他处

理，最大值为1.81。

表2　生长素对原球茎分化产生球茎的影响

Table 2 Effect of auxins on corm formation from protocorm differentiation

生长素

2,4-D

NAA

IBA

IAA

ρ/(mg·L-1

）

0.1

0.36a

0.08a

0.50a

0.31f

2.0

0.08b

0b

0.46b

0.60c

4.0

0c

0b

0.45b

0.70b

6.0

0c

0b

0.50a

0.75a

8.0

0c

0b

0.46b

0.54d

10.0

0c

0b

0.13c

0.42e

平均分化

系数

0.07b

0.01b

0.42a

0.55a

表3　生长素对原球茎分化产生球茎生根的影响

Table 3 Effect of auxins on rooting of corm formation produced from protocorm differentiation

生长素

2,4-D

NAA

IBA

IAA

ρ/(mg·L-1

）

0.1

0.28a

0.17a

0.90b

0.46d

2.0

0.08b

0b

0.77c

1.10b

4.0

0c

0b

0.73cd

1.60a

6.0

0c

0b

1.33a

1.67a

8.0

0c

0b

0.69d

0.85c

10.0

0c

0b

0.38e

0.58d

平均生

根数

0.06b

0.02b

0.80a

1.04a

表4　分裂素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

Table 4 Effect of mitogens on proliferation of protocorm by branching elongation

分裂素

TDZ

ZT

6-BA

KT

ρ/(mg·L-1

）

0.1

1.75a

1.97b

1.87a

1.46d

2.0

1.36c

2.08a

1.56ab

1.80a

4.0

1.31c

1.99b

1.33b

1.73b

6.0

1.07d

1.77c

1.18b

1.54c

8.0

1.33c

0.83d

1.31b

1.14e

10.0

1.43b

0.57e

0.88b

1.42d

平均增殖

系数

1.38a

1.54a

1.36a

1.51a

60

第66页

张正海，等：山兰原球茎途径种苗快繁技术

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3 NAA 和 ZT 组合对原球茎分枝状伸长增殖

分化的影响

不同浓度 NAA 和 ZT组合处理对原球茎分枝

状伸长增殖分化影响不同。从平均增殖系数看，

NAA和ZT均为1.0 mg/L时，原球茎分枝状伸长增

殖分化系数显著高于其他浓度，在NAA 1.0 mg/L+

ZT 1.0 mg/L时原球茎分枝状伸长增殖系数最高，

达到8.67（表7），生长状态良好（图1）。

2. 4 IAA 和 6-BA 组合对原球茎分化产生球茎

和球茎生根及根重的影响

2. 4. 1 IAA 和 6-BA 组合对原球茎分化产生球

茎的影响 不同浓度 IAA 和 6-BA 组合处理对原

球茎分化产生球茎影响不同。从平均分化系数

看，IAA 和 6-BA 均为 2.5 mg/L 时，原球茎分化产

生球茎的系数显著高于其他浓度，原球茎分化为

球茎分化系数最高，为 5.14（表 8），生长状态良

好（图2）。

2. 4. 2 IAA 和 6-BA 组合对原球茎分化产生球

茎生根的影响 由表 9 可知，在组合条件下，IAA

对原球茎分化产生球茎生根的影响无显著差异，

但 IAA为 2.5 mg/L时球茎生根数高于其他浓度；

6-BA 对原球茎分化产生球茎生根效果不同，

6-BA 为 0.1 mg/L 生根数显著高于其他浓度。

IAA 2.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L 组合处理的球茎生

根数最多，达到6.26，根生长状态见图3。

表6　分裂素对原球茎分化产生球茎生根的影响

Table 6 Effect of mitogens on rooting of corm formation produced from protocorm differentiation

分裂素

TDZ

ZT

6-BA

KT

ρ/(mg·L-1

）

0.1

0.81a

0.14d

0.33d

1.00a

2.0

0.21d

0.08e

0.12e

0.27d

4.0

0.23cd

0.77a

1.67b

0.93a

6.0

0.53b

0.50b

1.81a

0.85ab

8.0

0.27c

0.42c

1.69b

0.71bc

10.0

0.21d

0.07e

1.47c

0.67c

平均生根数

0.38b

0.33b

1.18a

0.74ab

表5　分裂素对原球茎分化产生球茎的影响

Table 5 Effect of mitogens on corm formation from protocorm differentiation

分裂素

TDZ

ZT

6-BA

KT

ρ/(mg·L-1

）

0.1

0.12b

0.07c

0.27c

0.38a

2.0

0.07c

0.08c

0.12d

0.07e

4.0

0.08c

0.23b

0.50ab

0.40a

6.0

0.20a

0.36a

0.56a

0.31b

8.0

0.20a

0.33a

0.53ab

0.14d

10.0

0.14b

0.07c

0.50b

0.25c

平均分化

系数

0.14b

0.19b

0.41a

0.26b

表7 NAA和ZT组合对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

Table 7 Effect of NAA and ZT combination on proliferation of protocorm by branching elongation

ρ（NAA）/(mg·L-1

）

0.1

1.0

2.0

3.0

4.0

均值

ρ（ZT）/(mg·L-1

）

0.1

4.60

7.07

4.25

3.40

0.91

4.05b

1.0

1.56

8.67

6.25

6.84

3.83

5.43a

2.0

1.61

7.91

3.75

2.37

1.28

3.87c

3.0

2.62

2.72

2.73

2.11

2.28

2.49d

4.0

1.67

1.34

2.58

0.75

1.08

1.48e

平均增殖

系数

2.41d

5.54a

3.91b

3.10c

1.87e

图1　原球茎分枝状伸长增殖

Fig.1 Proliferation of protocorm by branching elongation

61

第67页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 4. 3 IAA 和 6-BA 组合对原球茎分化产生球

茎根重的影响 由表 10 可知，在组合条件下，

IAA 对原球茎分化产生球茎根重的影响无显著

差 异 ，但 IAA 2.5 mg/L 时 根 重大于其他浓度；

6-BA 对原球茎分化产生球茎根重的影响不同，

6-BA 0.1 mg/L 时根重显著大于其他浓度，IAA

2.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L组合处理的球茎根重最

大，为9.90 mg。

表8 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎的影响

Table 8 Effect of IAA and 6-BA combination on corm formation from protocorm differentiation

ρ（IAA）/(mg·L-1

）

0.1

2.5

5.0

7.5

10.0

均值

ρ（6-BA）/(mg·L-1

）

0.1

1.88

1.92

0.69

1.72

2.02

1.65d

2.5

4.32

5.14

2.44

3.06

4.50

3.89a

5.0

1.53

3.85

2.50

3.83

1.86

2.71b

7.5

2.67

3.19

1.26

1.75

1.41

2.06c

10.0

1.42

2.00

2.65

1.50

2.19

1.95c

平均分化

系数

2.36b

3.22a

1.91c

2.37b

2.39b

表9 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎生根的影响

Table 9 Effect of IAA and 6-BA combination on rooting of corm formation produced from protocorm differentiation

ρ（IAA）/(mg·L-1

）

0.1

2.5

5.0

7.5

10.0

均值

ρ（6-BA）/(mg·L-1

）

0.1

5.87

6.26

4.71

4.14

4.96

5.19a

2.5

3.62

4.57

3.64

2.62

3.15

3.52b

5.0

2.26

2.12

2.41

3.39

2.13

2.46c

7.5

2.04

1.75

2.31

2.78

1.86

2.15c

10.0

2.08

1.23

2.27

2.50

1.44

1.90c

平均生根数

3.17a

3.19a

3.06a

3.09a

2.71a

图2　原球茎分化产生球茎

Fig. 2 Corm formation from protocorm

图3　球茎分化产生根

Fig. 3 Rooting of corm

表10 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生的球茎根重的影响 mg

Table 10 Effect of IAA and 6-BA combination on root weight of corm produced from protocorm differentiation

ρ（IAA）/(mg·L-1

）

0.1

2.5

5.0

7.5

10.0

均值

ρ（6-BA）/(mg·L-1

）

0.1

9.28

9.90

4.02

6.71

8.92

7.76a

2.5

4.71

4.79

2.36

6.14

3.40

4.26b

5.0

4.07

3.35

4.60

2.72

1.12

3.16b

7.5

1.49

3.64

2.40

3.28

1.92

2.54b

10.0

1.54

3.05

3.26

2.17

1.28

2.26b

平均球茎

根重

4.22a

4.92a

3.34a

4.20a

3.30a

62

第68页

张正海，等：山兰原球茎途径种苗快繁技术

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

3 讨 论

在本研究单因素试验时，使原球茎分化产生

球茎系数最高和原球茎分化产生球茎的生根数最

多的生长素是 IAA，IAA 6.0 mg/L 处理的原球茎

分化产生球茎的系数为 0.75，原球茎分化产生球

茎的生根数为 1.67；使原球茎分化产生球茎系数

最高和原球茎分化产生球茎的生根数最多的分裂

素是 6-BA，6-BA 6.0 mg/L 处理的原球茎分化产

生球茎的系数为 0.56，原球茎分化产生球茎的生

根数为 1.81。相对高浓度 IAA 5.0 mg/L+6-BA

5.0 mg/L组合处理的原球茎分化产生球茎系数为

2.50，原球茎分化产生球茎的生根数为 2.41，IAA

7.5 mg/L+6-BA 7.5 mg/L组合处理的原球茎分化

产生球茎系数为 1.75，原球茎分化产生球茎的生

根数为 2.78；而相对低浓度 IAA 2.5 mg/L+6-BA

2.5 mg/L组合处理的原球茎分化产生球茎系数为

5.14，IAA 2.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L组合处理的原

球茎分化产生球茎的生根数为 6.26。可以看出，

在单因素试验时使原球茎分化产生球茎系数最高

和原球茎分化产生球茎的生根数最多的相对高浓

度的IAA和6-BA，在组合的条件下没有产生协同

作用，在相对低浓度组合时表现出协同作用。这

种现象在大花蕙兰和竹叶兰原球茎分化培养研究

中有报道［16-18］

，认为是植物生长调节物质间存在

交互作用的原因［19］

。

自然条件下，山兰原球茎分枝状伸长增殖缓

慢且只分化出 1 个球茎，繁殖效率低［6］

。在组培

条件下，受激素调控，原球茎以愈伤状和分枝状伸

长 2 种方式增殖，分枝状伸长增殖方式便于生产

操作，适合作为山兰原球茎途径种苗快繁的主要

增殖方式。在本试验中，以 MS为基本培养基，原

球茎在NAA 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L组合处理下呈

分枝状伸长增殖，增殖系数达到8.67，增殖后的原

球茎在 IAA 2.5 mg/L+6-BA 2.5 mg/L组合处理下

分化出球茎，分化系数达到 5.14，原球茎分化产

生的球茎在 IAA 2.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L组合处

理 下 生 根 ，生 根 数 达 到 6.26，平 均 根 重 达 到

9.90 mg，即 1 个大小约 3 mm×3 mm×5 mm 原球茎

经过继代增殖和分化培养后可产生约 45 棵根茎

叶完整的健壮种苗。

参考文献：

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（责任编辑：王希）

63

第69页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

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吉林农业大学学报 2024，46（1）：64-71

Journal of Jilin Agricultural University

猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性*

同政泉1，3

，刘婷婷1，2

，张闪闪1，4

，徐新乐1，3

，王大为1，2**

1. 吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118；2. 农业农村部食用菌加工技术集成科研

基地，长春 130118；3. 吉林省粮食精深加工与高效利用工程研究中心，长春 130118；4. 吉林

省粮食精深加工与副产物高效利用技术创新重点实验室，长春 130118

摘 要：为了探究猴头菇多肽作为降血脂和抗氧化食用菌功能因子的潜力，以猴头菇蛋白为原料，采用超声

波-微波辅助酶法制备猴头菇多肽（Hericium erinaceus polypeptide，HEP），以多肽得率为指标，通过单因素及正

交试验优化其工艺条件；采用体外抗氧化和降血脂试验对超滤分离后的不同分子质量 HEP组分进行活性测

定。结果表明：酶解最佳工艺参数为超声功率300 W，超声时间50 min，酶添加量5 000 U/g，酶解温度50 ℃，多

肽得率为（65.14±0.05）%；HEP-Ⅱ的 DPPH·、·OH 和 O2

-

· 清除率分别为（81.37±0.04）%，（51.17±0.03）%和

（60.51±0.05）%；对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率为（54.98±0.03）%和（57.74±0.01）%，对胰脂肪酶抑制率

为（68.48±0.03）%，IC50为（2.75±0.03） mg/mL，在 pH 2.0 和 pH 7.0 的环境下对胆固醇的结合率分别为（48.08±

0.05）%和（62.89±0.07）%，表明猴头菇多肽有望成为一种天然抗氧化和辅助降血脂的功能因子。

关键词：猴头菇多肽；抗氧化；降血脂；超声波-微波辅助酶解；超滤分离

中图分类号：S646 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0064-08

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1093

引用格式：同政泉，刘婷婷，张闪闪，等.猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性［J］.吉林农业大学学报，

2024，46（1）：64-71.

Preparation of Hericium erinaceus Polypeptide and Its Antioxidation

and Hypolipidemic Activities in Vitro *

TONG Zhengquan1，3

，LIU Tingting1，2

，ZHANG Shanshan1，4

，XU Xinle1，3

，WANG Dawei1，2**

1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，

China；2. Scientific Research Base of Edible Mushroom Processing Technology Integration， Ministry

of Agriculture and Rural Affairs， Changchun 130118， China；3. Engineering Research Center of

Grain Deep-processing and High-efficiency Utilization of Jilin Province， Changchun 130118， China；

4. Key Laboratory of Technological Innovations for Grain Deep-processing and High-efficiency Utiliza⁃

tion of By-products of Jilin Province， Changchun 130118， China

Abstract：In order to explore the potential of Hericium erinaceus polypeptide as a functional factor

for hypolipidemic and antioxidation edible fungi, using Hericium erinaceus protein as raw material,

the Hericium erinaceus polypeptide（HEP）was preopared by the ultrasonic-microwave assisted enzy‐

matic method, and using polypeptide yield as an index, the process conditions were optimized by

single factor and orthogonal test. The activities of HEP components with different molecular weight

after ultra-filtration separation were determined by antioxidation and hypolipidemic tests in vitro.

* 基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFD0400204）

作者简介：同政泉，男，硕士研究生，研究方向：植物蛋白工程及综合利用。

收稿日期：2021-02-20

** 通信作者：王大为，E-mail：xcpyfzx@163.com

第70页

同政泉，等：猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

The results showed that the optimum parameters of enzymatic hydrolysis were ultrasonic power

300 W, ultrasonic time 50 min, enzyme dosage 5 000 U/g, enzymatic hydrolysis temperature 50 ℃,

and polypeptide yield （65.14±0.05）%. The clearance rates of DPPH·,·OH and O2

-

·

of HEP-Ⅱ were

(81.37±0.04)%, (51.17±0.03)% and (60.51±0.05)%, respectively. The binding rate of sodium tauro‐

cholate and sodium glycocholate were (54.98±0.03)% and (57.74±0.01)%, the inhibition rate of pan‐

crelipase was (68.48±0.03)%, and IC50 was (2.75±0.03) mg/mL. The binding rate of cholesterol under

the environment of pH2.0 and pH7.0 were (48.08±0.05)% and （62.89±0.07）%, respectively, indicat‐

ing that HEP is expected to become a natural antioxidation and a functional factor assisting in hypo‐

lipidemic activity.

Key words：Hericium erinaceus polypeptide； antioxidation； hypolipidemic； ultrasonic-microwave

assisted enzymolysis； ultra-filtration separation

猴头菇（Hericium erinaceus）属担子菌纲猴菇

目猴菇科猴菇属，又称猴头菌，是我国珍贵的药食

兼用真菌，素有“山珍猴头，海味燕窝”之说［1-2］

。

猴头菇中营养成分丰富，包括蛋白质、多糖、寡糖、

甾醇类、萜类、酚类等多种活性物质和多种人体必

需的矿物质，其中蛋白质含量高达24.8%，必需氨

基酸与非必需氨基酸比值为 0.69~0.81，均达到了

FAO/WHO 提出的理想蛋白的要求，与植物性和

动物性蛋白质相比，猴头菇蛋白更安全、更全

面［3-5］

。与蛋白质相比，生物活性多肽是一类对生

物体具备特别生理作用的肽类化合物，分子量更

低，生物相容性更好，具有生理调节和生物代谢的

功能，极具发展前景，近年来关于活性多肽的制备

与功效研究已成为研究热点［6-9］

。

随着人们生活水平的提高和饮食结构的改

变，导致高脂血症患者人群比例急剧上升，而目前

临床上常用的药物存在副作用，因此研发出具有

辅助改善人体氧化损伤与血脂水平的功能性食品

变得尤为重要［10］

。目前，关于食用菌多肽在抗氧

化与辅助降血脂方面的活性研究引起了广泛关

注，Dong等［11］

研究了灰树花蛋白酶解产物的抗氧

化能力，胰蛋白酶水解1.5 h的组分具有最高的抗

氧化活性；李小凡［12］

采用碱性蛋白酶与中性蛋白

酶酶解香菇柄蛋白制备得到 2 种香菇柄多肽，发

现2种香菇柄多肽均能显著降低小鼠体质量和血

清的 TC、TG 水平，提高 HDL-C 水平，具有良好的

减肥作用。对于猴头菇的研究主要集中在多糖方

面［13］

，而关于猴头菇多肽的活性研究很少，因此

本研究采用超声波-微波辅助酶法制备猴头菇多

肽（HEP），对最佳工艺条件下的酶解物进行超滤，

并对超滤后的3个HEP组分进行体外抗氧化和降

血脂活性评价，以期对猴头菇的高附加值综合利

用提供参考。

1　材料与方法

1. 1　材料与试剂

猴头菇蛋白是吉林省粮食精深加工与副产物

高效利用技术创新重点实验室自制；碱性蛋白酶

（Alcalase FG 2.4 L，酶活 20×104

U/g，食品级）购

自丹麦诺维信公司；胰脂肪酶（猪胰腺）、胃蛋白酶、

胰蛋白酶、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠购自上海源叶生

物科技有限公司；对硝基苯丁酸酯（P-nitrophenyl

butyrate，PNPP）、对硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）

购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

1. 2　仪器与设备

UV-2300紫外分光光度计（北京普析通用仪

器有限公司）；UWave-1000型微波-紫外-超声波

三位一体合成萃取反应仪（上海新仪微波化学科

技有限公司）；CT15RT 台式高速冷冻离心机（上

海天美科学仪器有限公司）；冷冻干燥机（德国

Ghrist 公司）；Sartorius -切向流超滤系统（德国赛

多利斯公司）。

1. 3 HEP的制备

1. 3. 1 单因素试验 利用碱性蛋白酶在超声波

环境下水解猴头菇蛋白溶液制备 HEP，以多肽得

率为考察指标，用磷酸缓冲溶液调pH至9.0，设定

底物质量分数 3%，分别对超声功率（150，200，

250，300，350 W），超 声 时 间（30，50，70，90，

110 min），加 酶 量（3 000，4 000，5 000，6 000，

7 000 U/g），酶解温度（45，50，55，60，65 ℃）4个影

响因素进行考察。

1. 3. 2 正交试验 在单因素试验的基础上，选

65

第71页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

择超声功率、超声时间、加酶量和酶解温度为影响

因素，以多肽得率为评价指标进行 L（9 34

）正交试

验，研究各因素对 HEP 得率的影响，每组试验重

复3次，正交试验因素与水平表见表1。

1. 3. 3 多肽得率的测定 方法参照文献［14］，

公式：多肽得率=上清液多肽质量

酶解液总蛋白质量

×100%。

1. 4　超滤分离

通过透析方法对酶解液进行脱盐处理，在

4 ℃下透析 24 h，期间液体更换 2~3 次，将透析后

的收集液用切向流超滤系统及 Hydrosart 膜包进

行超滤处理，分别采用膜分子截流分子质量为

10 ku和 5 ku的超滤膜进行分离，得到 3个不同分

子质量的多肽组分，分析各组分的体外抗氧化和

降血脂活性［15］

。

1. 5　体外抗氧化活性的评价

DPPH 自由基清除能力测定方法参照文献

［16］；总还原力的测定方法参照文献［17］；羟自由

基（·OH）清除率的测定参照文献［18］；超氧阴离

子自由基清除能力的测定方法参照文献［19］。

1. 6　体外降血脂活性评价

胆酸盐结合试验方法参照文献［20］；胰脂肪

酶的抑制作用方法参照文献［21-22］；胆固醇结

合能力方法参照文献［23］；以 HEP溶液质量浓度

为横坐标，胰脂肪酶活性抑制率为纵坐标，绘制抑

制曲线。用GraphPad Prism 软件进行多元非线性

拟合，利用回归方程求出 HEP的半抑制质量浓度

（Half inhibitory concentration，IC50）。

1. 7　数据处理

试验应用 GraphPad Prism 5.0 和 Excel 2016、

Spss 8.0.6 软件进行分析作图，各组试验均重复

3 次，试验数据以平均值±标准差（xˉ±S）表示误差。

2　结果与分析

2. 1　超声波-微波辅助酶法制备猴头菇多肽优

化结果

2. 1. 1 单因素试验结果 由图1可见，随着超声

功率的增大，猴头菇蛋白在碱性蛋白酶的作用下，

多肽得率逐步上升，当超声功率>300 W 时，多肽

得率开始下降。原因可能是由于超声波产生的空

化效应趋于饱和，继续增大功率导致气泡过多，出

现散射衰减，空化作用强度减弱，进而使得酶解反

应速率降低［24］

，故选择超声功率 300 W 为正交试

验的水平值。

由图1可见，随着超声时间的延长，多肽得率

呈现上升趋势，当超声时间>70 min 时，多肽得率

开始下降。可能是由于随着酶解反应的进行，大

分子蛋白质被酶解成多肽和氨基酸混合物，酶切

位点会逐渐减少，酶活出现下降，另一方面伴随反

应过程逐渐累积的中间及最终产物会对反应起反

馈抑制作用［25］

，从而会使反应趋于平缓，故选择

70 min为正交试验的超声时间水平值。

由图1可见，随着加酶量的增加，多肽得率呈

现先增大后减小，在加酶量 5 000 U/g 时，达到最

大值为（58.13±1.53）%。碱性蛋白酶是酶切位点

为丝氨酸残基的内切蛋白酶，随着加酶量的增加，

酶与猴头菇蛋白的接触几率增加，具有活性的多

肽也逐渐增多，继续增大加酶量，生成的活性多肽

可能会被蛋白酶水解成为无活性的分子量极小片

段或氨基酸［26］

，综合考量选择5 000 U/g为进一步

试验的加酶量。

由图1可见，随着酶解温度的升高，多肽得率

逐渐升高，温度达到 50 ℃时，多肽得率最高，为

（53.64±0.04）%，随后下降，因为温度升高会使蛋

白质溶解度升高，超声波的空化作用增强，一旦温

度过高，蛋白质空间构象被破坏而变性，疏水基团

暴露从而使分子间相互结合沉淀，溶解度下

降［27］

，最终导致多肽得率大幅下降，所以超声波

辅助酶法水解猴头菇蛋白的酶解温度选择50 ℃。

表1　正交试验因素与水平表

Table 1 Orthogonal test factors and levels

水平

1

2

3

因素

超声功率/W

A

250

300

350

超声时间/min

B

50

70

90

加酶量（/ U·g

-1

）

C

4 000

5 000

6 000

酶解温度/℃

D

45

50

55

66

第72页

同政泉，等：猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 1. 2 正交试验设计及结果 超声波-微波辅

助碱性蛋白酶工艺中，酶解pH具有相对特定的范

围，因此固定pH为9.0，设置底物质量分数为3%，

通过对单因素试验结果分析，采用 L（9 34

）正交试

验。由表 2 可知，不同影响因素对考察指标的

影响程度不同。对多肽得率的影响程度依次为

超声功率>加酶量>超声时间>酶解温度，最佳

组合为 A2B1C3D2，即超声功率 300 W，超声时间

50 min，加酶量 5 000 U/g，酶解温度 50 ℃。最佳

组合不在试验设计内，以此酶解条件进行 3 次验

证试验，最终结果 HEP 得率为（65.14±0.05）%，高

于正交试验中的最高多肽得率。由表3的方差分

析结果可知，超声功率和加酶量对多肽得率的影

响达到极显著水平（P<0.01），与极差分析结果一

致，与王培宇等［28］

研究水浴条件下碱性蛋白酶胰蛋白酶酶解南瓜籽蛋白的工艺参数相比，超声

波-微波辅助碱性蛋白酶法在时间上缩短了，多

肽得率提高了 66.17%。对最佳工艺参数酶解液

的水解度进行测定，水解度为（25.47±0.08）%。

2. 2　超滤分离HEP及体外抗氧化活性对比评价

对正交试验优化的最佳条件得到的 HEP，

采用截留分子质量为 5 ku 和 10 ku 的超滤膜对

HEP 进行分离纯化，收集得到 3 个组分：HEP-Ⅰ

（<5 ku）、HEP-Ⅱ（5~10 ku）和 HEP-Ⅲ（>10 ku），

研究各组分对不同抗氧化指标的影响。由图2可

见，DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由

基清除率，随着 HEP 质量浓度的增加而增强，其

中 HEP-Ⅱ在 5 mg/mL 时，对 DPPH·、·OH 和 O2

-

·

自由基清除率达到最大，分别为（81.37±0.04）%、

（51.17±0.08）%和（60.51±0.05）%，说明 HEP-Ⅱ清

除自由基的效果很好，还原能力（0.58±0.04）显著

高于 HEP-Ⅰ和 HEP-Ⅲ，说明分子质量在<10 ku

的猴头菇多肽抗氧化活性更高。郭善广等［29］

对

罗非鱼内脏蛋白酶解物的超滤分离组分进行抗氧

化活性分析，发现各组分的抗氧化活性大小顺序

依次为<5 ku 组分，5~10 ku 组分，>10 ku 组分，本

研究结果与其一致。

图1　不同因素对HEP得率的影响

Fig. 1 Effect of different factors on yield of HEP

67

第73页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 3　体外降血脂活性评价

2. 3. 1 模拟胃肠道环境对HEP结合胆酸盐的影

响 由表4可知，模拟胃肠道环境条件下HEP结合

胆酸盐结合率和结合量，HEP对2种主要胆酸盐具有

结合作用，其中HEP-Ⅱ结合能力稍大于HEP-Ⅰ，

明显强于 HEP-Ⅲ，且结合能力随 HEP 质量浓度

的增加而增大。HEP-Ⅱ（10 mg/mL）对牛磺胆酸

钠的结合率和结合量分别为（54.98±0.03）%和

（2.58±0.03） mg/g，对甘氨胆酸钠的结合率和结合量

分别为（57.74±0.01）%和（2.71±0.04） mg/g。通过

体外模拟胃肠环境试验，证明了 HEP-Ⅱ可以通

过结合人体胆汁酸池中的胆酸盐，进而降低机体

内胆汁酸肠肝循环的强度，因此可以初步确定：

HEP-Ⅱ中具有较强降血脂作用的功能因子。可

能依赖于肽链氨基酸残基的疏水性，胆汁酸具有

两亲性的疏水骨架结构，可以通过疏水性氨基酸

与极性官能团有效的结合［30］

。

2. 3. 2 HEP对胰脂肪酶的抑制作用 多肽在生

物体内的抑制胰脂肪酶活性作用，必须采用模拟

胃肠道酶水解消化的方法，对多肽水解后活性的

保留程度进行测定，避免多肽因为不能到达体内

目标靶点而无法发挥其抑制胰脂肪酶的作用。由

图 3 可见，HEP 在胃蛋白酶和胰蛋白酶长时间消

化水解之后，仍然具有对胰脂肪酶的抑制活性，在

一定范围内，HEP 质量浓度越大，抑制效果越好，

而且抑制率曲线随着HEP质量浓度的增大而趋于

平缓；其中HEP-Ⅱ的抑制活性最高，可达（68.48±

0.03）%，用 GraphPad Prism 软件进行多元非线性

拟合，利用回归方程求出 HEP-Ⅰ IC50 为（2.90±

0.06）mg/mL，HEP-Ⅱ IC50为（2.75±0.03）mg/mL，

HEP-Ⅲ IC50为（3.27±0.04）mg/mL，且在不同质量

浓度下，HEP-Ⅱ的抑制率均明显高于其他 2 组

HEP，表明 HEP-Ⅱ对胰脂肪酶具有很好的抑制

作用。

表2 L9

（34

）正交试验设计及结果

Table 2 L9（34

） orthogonal test design and results

水平

1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

k3

R

A

1

1

1

2

2

2

3

3

3

49.31

57.43

56.55

8.12

B

1

2

3

1

2

3

1

2

3

56.62

53.00

53.67

3.62

C

1

2

3

2

3

1

3

1

2

50.48

54.74

58.06

7.58

D

1

2

3

3

1

2

2

3

1

52.96

55.85

54.48

2.89

多肽得率/%

46.09±0.24

49.61±0.22

52.23±0.16

59.98±0.04

58.16±0.03

54.14±0.04

63.80±0.12

51.22±0.11

54.64±0.05

最优组合A2

B1

C3

D2

影响顺序A>C>B>D

表 3 正交试验方差分析结果

Table 3 Results of orthogonal test anova

变异来源

A.超声功率

B.超声时间

C.加酶量

D.超声温度

误差

总变异

偏差平方和

201.41

26.44

179.03

23.86

5.032

136 445.07

自由度

2

2

2

2

9

18

均方

110.75

57.83

98.63

11.38

F值

180.10

23.64

160.09

21.33

显著性

**

*

**

*

注：“*”表示差异显著（P<0.05）；“**”表示差异极显著（P<0.01）

68

第74页

同政泉，等：猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3. 3 HEP 结合胆固醇胶束能力 由图 4 和

图5可见，随着HEP的质量浓度的增加，其对蛋黄

液中的胆固醇结合率也逐渐增大，原因为在一定

质量浓度范围内，相同大小的空间内多肽分子越

多，与胆固醇胶束的接触几率就越大，使得更多的

胆固醇胶束被破坏。

图2　不同质量浓度HEP超滤组分体外抗氧化活性

Fig. 2 Antioxidation activity of HEP ultrafiltration components at different mass concentrations in vitro

表4　模拟胃肠道环境对HEP结合胆酸盐结合率和结合量的影响

Table 4 Simulated gastrointestinal environment for HEP binding effect of binding rate and binding amount of cho⁃

late

组分

HEP-Ⅰ

（<5 ku）

HEP-Ⅱ

（5~10 ku）

HEP-Ⅲ

（>10 ku）

ρ（/ mg·mL-1

）

2

5

10

2

5

10

2

5

10

牛磺胆酸钠

结合率/%

44.88±0.02

50.78±0.03

52.27±0.02

46.57±0.05

51.57±0.08

54.98±0.03

41.09±0.04

43.93±0.07

44.36±0.02

结合量（/ mg·g

-1

）

1.95±0.02

2.21±0.01

2.35±0.01

2.02±0.02

2.44±0.05

2.58±0.03

1.21±0.02

1.29±0.02

1.31±0.01

甘氨胆酸钠

结合率/%

45.97±0.03

51.56±0.02

53.19±0.01

48.39±0.02

54.90±0.02

57.74±0.01

41.95±0.03

44.58±0.01

45.27±0.02

结合量（/ mg·g

-1

）

1.98±0.04

2.20±0.03

2.30±0.01

2.10±0.02

2.59±0.03

2.71±0.04

1.18±0.02

1.37±0.01

1.39±0.02

69

第75页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

由图4和图5可见，在相同质量浓度5 mg/mL

下，HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ和HEP-Ⅲ在pH 2.0环境下，

对蛋黄液中胆固醇结合率分别为（43.58±0.03）%，

（48.08±0.05）%和（24.68±0.05）%，在 pH 7.0 环境

下 分 别 为（57.39±0.03）% ，（62.89±0.07）% 和

（37.64±0.05）%，试验发现，HEP-Ⅰ和 HEP-Ⅱ的

胆固醇结合率高于 HEP-Ⅲ，且在 pH 7.0 时显著

强于 pH 2.0 时。表明了超滤后<10 ku 的 HEP 结

合胆固醇活性更强，并且主要发生在 pH 7.0的小

肠环境中。可能是由于多肽分子的两亲性增强了

其与游离胆固醇胶束溶液相互作用的能力，从而

达到降低膳食胆固醇的乳化和溶解性［31］

。总体

来说，本试验证明了 HEP-Ⅱ在体外具有较强的

抗氧化活性，也在调节体内胆固醇生物合成方面

有巨大潜力。

3　讨论与结论

本研究以猴头菇蛋白为原料，采用超声波微波辅助酶法制备HEP并对其工艺进行优化，得

到最佳工艺参数为超声功率 300 W、超声时间

50 min、酶添加量5 000 U/g、超声温度50 ℃，在此

条件下 HEP 得率为（65.14±0.05）%。钱磊等［32］

采

用超声波预处理以及分步水解的方法制备滑菇多

肽，发现超声波预处理有助于提高多肽的抗氧化

活性；程湛等［33］

用复合蛋白酶水解菇柄蛋白，发

现 5~10 ku分子量的肽段抗氧化活性最高。本研

究对猴头菇蛋白酶解液超滤分离后的 3 组 HEP

进行体外抗氧化和降血脂活性对比评价，发现

HEP-Ⅱ的 DPPH·、·OH 和 O2

-

· 自由基清除率分

别 为（81.37±0.04）% ，（51.17±0.08）% 和（60.51±

0.05）%，还原力为（0.58±0.04），证实了食用菌多

肽具有良好的抗氧化活性。多肽降血脂活性主要

有对胆酸盐的吸附作用，抑制胆汁酸和胆酸盐的

重吸收，与胆固醇竞争进入胶束，使得胶束中的胆

固醇含量降低和多肽直接抑制胰脂肪酶等3种途

径，Yoshi等［34］

发现蛋白酶解物对胆酸盐的效果强

于降血脂药物。本研究在体外模拟胃肠道消化环

境中，发现HEP-Ⅱ对牛磺胆酸钠的结合率和结合

量分别为（54.98±0.03）%和（2.58±0.03）mg/g，对甘

氨胆酸钠为（57.74±0.01）%和（2.71±0.04）mg/g；对

在 pH 2.0 和 pH 7.0 环境下，胆固醇结合率分别

为（48.08±0.05）% 和（62.89±0.07）% ；胰 脂 肪 酶

抑制率为（68.48±0.03）%，HEP-Ⅱ IC50 为（2.75±

0.03）mg/mL，且 其 体 外 活 性 皆 强 于 HEP-Ⅰ 和

HEP-Ⅲ。表明了猴头菇多肽在抗氧化和降血脂

方面具有一定潜力，且在超声波处理和分离纯化

后活性更加明显，为其进一步进行体内动物试验

奠定基础，也为猴头菇精深加工和创新产品的研

制提供理论依据。

图5 pH 7.0 HEP结合胆固醇能力

Fig. 5 pH 7.0 HEP binding cholesterol ability

图4 pH 2.0 HEP结合胆固醇能力

Fig. 4 pH 2.0 HEP binding cholesterol ability

图3 HEP对胰脂肪酶活性的抑制效果

Fig. 3 Inhibitory effect of HEP on pancreatic lipase

activity

70

第76页

同政泉，等：猴头菇多肽的制备及体外抗氧化、降血脂活性

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

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（责任编辑：王希）

71

第77页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：72-77

Journal of Jilin Agricultural University

罗汉果根的生物活性及化学成分*

扈芷怡1，2，3

，卢凤来2**，赵立春1**，颜小婕2

，徐祥林2

，李典鹏2

1. 广西中医药大学药学院，南宁 530011；2. 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，桂

林541006；3. 广西中医药大学第一附属医院，南宁530023

摘 要：以受根结线虫危害的罗汉果根为研究对象，研究不同极性部位的生物活性及化学成分。罗汉果根粗

提物过HPD-100大孔树脂层析柱，依次用不同浓度甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，得到Fr1，Fr2，Fr3，Fr4部位，利

用传统分离方法和反相制备色谱技术进行分离纯化，采用ESI-MS，NMR对化合物进行结构鉴定；以抑制α-葡

萄糖苷酶和HepG2肿瘤细胞能力为指标，研究各极性部位和部分化合物的生物活性。结果表明：Fr4部位具有

最强的抑制α-葡萄糖苷酶和HepG2肿瘤细胞增殖活性。从Fr4中分离得到4种葫芦素，分别为双氢葫芦素E

（1），葫芦素E（2），二氢异葫芦素B-25-乙酸酯（3），葫芦素B（4），化合物均为首次从罗汉果属中分离得到 ，且

化合物4有较好的抗肿瘤活性。

关键词：罗汉果根；生物活性；葫芦素；α-葡萄糖苷酶；HepG2肿瘤细胞

中图分类号：S567 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0072-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5596

引用格式：扈芷怡，卢凤来，赵立春，等.罗汉果根的生物活性及化学成分［J］.吉林农业大学学报，2024，46（1）：

72-77.

Chemical Constituents from the Root of Siraitia grosvenorii and Their

Biological Activities *

HU Zhiyi1，2，3

，LU Fenglai2**，ZHAO Lichun1**，YAN Xiaojie2

，XU Xianglin2

，LI Dianpeng2

1. College of Pharmacy ， Guangxi University of Chinese Medicine ， Nanning 530011 ， China ；

2. Guangxi Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， China；3. The First Af⁃

filiated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， China

Abstract：To study the biological activities and chemical constituents of Siraitia grosvenorii roots,

the crude extracts of S. grosvenorii roots were loaded to HPD-100 column and eluted by gradient

methanol-water solutions to obtain Fr1, Fr2, Fr3 and Fr4 fractions. Traditional separation methods

and reversed-phase preparative chromatography techniques were used for separation and purifica‐

tion, and ESI-MS and NMR were used for identifying their structure. α-glycosidase and HepG2 tu‐

mor cell inhibition activity of different polar parts and partical compounds were determined. The re‐

sults indicate that Fr4 has the highest α-glycosidase and HepG2 tumor cell inhibition activity. Four

compounds were isolated from Fr4, and their structures were identified as dihydrocucurbitacin E, cu‐

curbitacin E, dihydroisocucurbitacin B-25-acetate and cucurbitacin B, and they are isolated from

* 基金项目：广西自然科学基金项目（2017GXNSFAA198098），广西中医药大学“岐黄工程”高层次人才团队培育项目（2018002），

桂林市重大专项（20170303），广西重点研发计划项目（桂科 AB16380108），国家自然科学基金项目（21562009），广西

植物研究所基本业务费（桂植业18003）

作者简介：扈芷怡，女，硕士，研究方向：中药化学及药理活性。

收稿日期：2020-01-07

** 通信作者：赵立春，E-mail：37473690@qq.com

第78页

扈芷怡，等：罗汉果根的生物活性及化学成分

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

S.grosvenorii for the first time.

Key words：Siraitiae grosvenorii root； biological activity； cucurbitacin；α-glycosidase； HepG2 tu‐

mor cell

罗汉果（Siraitia grosvenorii）根为葫芦科植物

罗汉果的块根，其味苦，性微寒，具有清热祛湿、通

络止痛之功效，是广西民间一种习用药材［1］

。研

究发现，罗汉果块根粗提物具有抗氧化、抗癌、抑

菌、抗炎等生理活性［2-5］

。目前关于罗汉果根的研

究报道较少，文献中已报道罗汉果根的次生代谢产

物仅8种，均为葫芦烷型四环三萜类，分别为6个三

萜酸：罗汉果酸甲（Siraitic acid A），罗汉果酸乙

（Siraitic acid B），罗汉果酸丙（Siraitic acid C），罗

汉果酸丁（Siraitic acid D），罗汉果酸戊（Siraitic

acid E）和 Siraitic acid F；2 个三萜酸苷罗汉果酸

乙 苷 Ⅱ（Siraitic acidⅡB）和 罗 汉 果 酸 丙 苷Ⅱ

（Siraitic acidⅡC）［6-10］

。因此罗汉果根的成分及

药理作用有待进一步阐明。

罗汉果产业已成桂林地区重要的经济与扶贫

支柱产业，近年来得到快速发展，从2012年4 000 hm2

发展到 2016 年 8 000 hm2

。根结线虫是为害罗汉

果的重要病害，因根结线虫为害而被淘汰的成龄

种薯占>15%，一般受害果园减产 15%~30%，严重

时60%~70%［11-12］

。为减少根结线虫为害，目前罗

汉果主要是一年一栽，每年挖掉的块根通常被丢

弃，造成很大的资源浪费。为充分开发利用罗汉

果块根资源，延长罗汉果产业链，课题组在前期研

究基础上［6-8］

进一步对其化学成分及生物活性进

行研究。本研究主要比较罗汉果块根不同极性部

位的抑制 α-葡萄糖苷酶和 HepG2 肿瘤细胞增殖

活性，进而对活性较强的部位进行化学成分分离

与鉴定，并测试单体成分抑制 HepG2肿瘤细胞增

殖的活性，为罗汉果块根的开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1. 1　仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent）；

Brucker Avance 500 MHz型超导核磁共振仪（瑞典

Brucker 公司）；LCMC-IT-TOF 型高效液相色谱质谱（日本 Shimadzu 公司）； SP-Max 3500FL 多功

能荧光酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；

YA28X-4T 立式压力蒸汽灭菌锅（日本 Hirayama

公司）；SW-CJ-1D 单人净化工作台（苏州净化设

备有限公司）；DMil 442514倒置显微镜（德国徕卡

公司）；Agilent XDB-C18制备柱（9.4 mm×250 mm，

5 µm）；HPD-100大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科

技有限公司）。色谱乙腈、甲醇（美国Fisher Scien‐

tific 公司）；二氯甲烷（上海泰坦化学有限公司）；

分析甲醇（西陇科学股份有限公司）；胰蛋白酶（美

国Invitrogen公司）；DMEM培养基（美国Invitrogen

公司）；噻唑蓝 MTT（美国 Sigma 公司）；磷酸盐缓

冲溶液（天津市大茂化学试剂厂）。

1. 2　供试材料

罗汉果根采自广西桂林永福县，经广西壮族

自治区中国科学院广西植物研究所蒋水元研究员

鉴定为葫芦科植物罗汉果（Siraitia grosvenorii）的

块根。

1. 3　提取分离方法

罗汉果块根采集后，洗净泥土，切成薄片，室

温阴干，粉碎。罗汉果块根粉末 4.75 kg，75% 乙

醇浸提 3 次，每次 7 d，合并提取液，减压浓缩至

1 000 mL，过 HPD-100 大孔树脂层析柱，依次用

纯水，20%，40%，60%，80%，100%甲醇梯度洗脱，收

集洗脱液。40%~100%的甲醇洗脱液分别减压浓

缩，得到 Fr1（18.60 g），Fr2（6.76 g），Fr3（30.88 g），

Fr4（20.86 g）不同极性部位。Fr4 再过 MCI 层析

柱，采用相同洗脱方法，经薄层层析硅胶板检测，

收 集 60%~80% 甲 醇 洗 脱 液 并 浓 缩 干 燥 得 到

4.59 g 样品（Fr41），Fr41 加入少量甲醇溶解，然后

称取与样品等质量的硅胶进行干法搅拌，干法上

样，依次用二氯甲烷，二氯甲烷∶甲醇（16∶2）梯度

洗脱，根据薄层层析硅胶板检测，收集洗脱液，减

压浓缩得到 Fr411部分（0.10 g）。Fr411用色谱甲

醇 溶 解 ，经 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 ，超 声 振 荡

3 min 上制备液相制备纯品。以乙腈∶水（47∶53）

为流动相，进行等度洗脱，得到化合物1（4 mg），化

合物2（5 mg），化合物3（6 mg），化合物4（5 mg）。

1. 4　生物活性测定

1. 4. 1 抑制α-葡萄糖苷酶活性试验 将得到的

粗提物，Fr1，Fr2，Fr3，Fr4不同部位采用二倍稀释

法，用磷酸缓冲液（PBS）依次配成质量浓度不同

的（3.13，1.56，0.78，0.39，0.20，0.10 mg/mL）样品

73

第79页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

液。按照李波等［13］

的方法，适当修改，以 96 孔板

为反应载体，依次加入 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液

100 µL，1 U/mL 葡 萄 糖 苷 酶 液 15 µL，样 品 液

30 µL，于 37 ℃水浴 10 min，加入已经预热好的

5 mmol/L PNPG 15 µL，37 ℃水浴 20 min，立即加

入 1 mol/L Na2CO3 30 µL 溶 液 终 止 反 应 ，测 定

405 nm波长下的吸光值（A）。试验分别设置空白

对照组，空白背景组，样品组，样品背景组，其中空

白对照组不加样品溶液、空白背景组不加样品溶

液和 PNPG 溶液，样品背景组不加 PNPG 溶液；每

组设 3个平行，结果取平均值。样品对 α-葡萄糖

苷酶活性抑制率按公式计算：

活性抑制率=［1-（A2-A3

）/（A0-A1

）］×100%，

式中：A0为空白对照组吸光值，A1为空白背景组吸

光值，A2 为样品组吸光值，A3 为样品背景组吸

光值。

1. 4. 2 抑制HepG2肿瘤细胞增殖试验 将对数

生长期的 HepG2 细胞，用胰蛋白酶消化，制成

5×104

~1×105

个/mL的单细胞悬浮液，用多道移液

枪接种于 96 孔板中，每孔 100 µL，并置于培养箱

中，待细胞贴壁后，弃去 10 µL 培养液，依次加入

10 µL不同浓度的样品液，使终浓度为6.25，12.5，

25，50，100 µg/mL，另设阴性对照组，每组设 3 个

平行孔。继续培养24 h后，弃去10 µL培养液，加

入 10 µL 5mg/mL 的 MTT 溶液，于培养箱中反应

4 h 后，取出上清液并加入 100 µL 的 DMSO 溶液，

充分振荡后，于 570 nm 下测吸光度值（OD），并重

复3次试验。样品对HepG2癌细胞抑制率按公式

计算：

癌细胞抑制率=（1-药物组 OD/对照组 OD）×

100%。

2　结果与分析

2. 1　不同部位对α-葡萄糖苷酶活性的影响

抑制 α-葡萄糖苷酶活性试验表明，在质量

浓度为 18.3~585.9 µg/mL，罗汉果根提取物抑制

活性强度与浓度呈量效关系，随着浓度的增加，

抑制 α-葡萄糖苷酶活性能力逐渐增强（图 1）。

在相同质量浓度下，Fr4 部位抑制 α-葡萄糖苷酶

活性能力最强，其次是 Fr3部位，Fr1部位的抑制

能力最弱，且在质量浓度为 585 µg/mL 时，Fr4 部

位对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到100%，Fr4和Fr3

部位半数有效抑制浓度IC50分别15.2，28.6 µg/mL。

以上结果说明，具有抑制 α-葡萄糖苷酶的活

性成分主要集中在 Fr4 部位和 Fr3 部位，在分

离纯化罗汉果根成分过程中可重点分离这 2 个

部位。

2. 2　不同部位对 HepG2 肿瘤细胞的抑制增殖

作用

由图 2 可见，HepG2 肿瘤细胞对 Fr4 和 Fr3 部

位较敏感，这 2 个部位对 HepG2 细胞的抑制作用

最强，其中 Fr4 部位的半数有效抑制浓度 IC50<

50 µg/mL，而粗提物，Fr1 和 Fr2 部位对 HepG2 细

胞的抑制作用较弱，IC50>100 µg/mL，抑制作用差

异的原因可能与各部位的成分种类或含量有关。

从图中可以看出，随着浓度的递增，药物对HepG2

肿瘤细胞的抑制作用增强，抑制作用具有浓度依

赖性。

图1 罗汉果根不同部位对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

Fig. 1 Inhibitory effect of different parts of S. grosve⁃

norii roots on α-glucosiade enzyme activity

图2　罗汉果根不同部位对 HepG2肿瘤细胞增殖的抑制

作用

Fig. 2 Inhibitory effects of S.grosvenorii roots on pro⁃

liferation of HepG2 cells

74

第80页

扈芷怡，等：罗汉果根的生物活性及化学成分

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3 Fr4部位化学成分分离与结构鉴定

Fr4部位通过MCI、硅胶柱层析以及半制备液相

制备等分离纯化，得到化合物 1（4 mg），化合物 2

（5 mg），化合物 3（6 mg），化合物 4（5 mg）。采用

ESI-MS，NMR对化合物进行结构鉴定，其结果如下。

化合物 1 为白色粉末，高分辨 IT-TOF-ESIMS 给出准分子离子峰（m/z）：603.3［M+HCOO］-

，

确 定 分 子 式 为 C32H46O8。 在1

H-NMR（C5D5N，

500 MHz）中，高场处显示 9 个甲基信号，分别为

δH1.14（3H， s， H-18），1.23（3H， s， H-19），1.33

（3H， s， H-29），1.47（3H， s， H-28），1.50（3H， s，

H-26），1.52（3H， s， H-27），1.58（3H， s， H-21），

1.64（3H， s， H-30），1.93（3H， s， COCH3

），其中

9 个甲基质子为单峰，结合化学位移数据，可知其

中的 8 个甲基与季碳相连，1 个与极性官能团相

连。13C-NMR 和 DEPT（C5D5N，125 MHz）谱中共

显示 32 个碳信号，其中 9 个甲基信号（δC18.8，

20.5，20.8，21.1，22.6，26.0，26.3，26.4，28.4），5 个

亚甲基信号（δC24.3，32.6，35.7，46.9，49.9），6个次

甲基信号（δC35.5，42.4，59.5，70.7，116.2，120.9），

12 个 季 碳 信 号（δC49.0，49.1，49.6，51.3，80.5，

82.0，138.1，147.7，170.5，199.2，214.0，215.5），其

中羰基信号 4 个（δC170.5，199.2，214.0，215.5），

2 个 sp2

季碳信号（δC138.1，147.7），2 个 sp2

烯碳信

号（δC116.2，120.9），结合δC22.6，170.5表明分子内

可能存在乙酰基，综上可判断化合物为四环三萜

类的苷元结构，以上数据与文献报道一致［14］

，鉴

定该化合物为双氢葫芦素 E（dihydrocucurbitacin

E），结构式见图3。

化合物 2 为白色结晶，高分辨 IT-TOF-ESIMS 给出准分子离子峰（m/z）：601.3［M+HCOO］-

，

分子式 C32H44O8。1

H-NMR（C5D5N，500 MHz）谱

高场区显示有 9 个甲基信号，分别为 δH1.14（3H，

s， H-18），1.22（3H， s， H-19），1.32（3H， s， H29），1.47（3H， s， H-28），1.54（3H， s， H-26），

1.57（3H， s， H-27），1.62（3H， s， H-30），1.74

（3H， s， H-21），1.92（3H， s， COCH3

）。13C-NMR

和 DEPT（C5D5N，125 MHz）谱共显示 32 个碳信

号，包括 9 个甲基信号（δC18.8，20.5，21.0，21.2，

22.1，26.0，26.6，26.9，28.4），3 个 亚 甲 基 信 号

（δC24.3，46.9，49.7），8 个 次 甲 基 信 号（δC35.5，

42.5，60.3，71.1，116.2，120.9，122.9，150.4），12 个

季 碳 信 号（δC49.0，49.0，49.6，51.4，80.1，80.2，

138.1，147.7，170.2，199.3，204.8，214.1），其中 2个

sp2

季碳信号（δC138.1，147.7），4 个 sp2

烯碳信号

（δC116.2，120.9，122.9，150.4），结合 δC21.2，170.2

数据表明母核中可能含有乙酰基。综上可判断，

化合物为四环三萜类的苷元结构，以上数据与文

献报道一致［15］

，鉴定该化合物为葫芦素 E（cucur‐

bitacin E），结构式见图3。

化合物 3 为白色针晶，高分辨 IT-TOF-ESIMS 显示分子离子峰（m/z）：605.3［M+HCOO］-

，分

子式 C32H48O8。1

H-NMR（C5D5N，500 MHz）显示

有 9 个甲基信号，分别为 δH1.09（3H， s， H-18），

1.20（3H， s， H-19），1.23（3H， s， H-29），1.47

（3H， s， H-28），1.50（3H， s， H-26），1.52（3H， s，

H-27），1.58（3H， s， H-21），1.61（3H， s， H-30），

1.92（3H， s， COCH3

），其中 9 个甲基质子为单峰，

结合化学位移数据，可知其中的8个与季碳相连，

1 个 与 极 性 官 能 团 相 连 。 13C-NMR 和 DEPT

（C5D5N，125 MHz）谱显示32个碳信号，甲基信号

9个（δC19.2，20.3，20.7，22.3，22.6，24.9，25.8，26.3，

26.4），次甲基信号 6 个（δC36.9，43.4，59.3，70.6，

81.3，121.8），亚甲基信号 6 个（δC24.5，32.5，35.7，

40.1，46.6，49.6），季 碳 信 号 11 个（δC47.2，48.9，

49.1，51.3，80.4，82.0，139.7，170.5，211.2，213.0，

215.4）。其中，δC22.3，170.5数据表明母核中可能

含有乙酰基。综上可判断，化合物为四环三萜类

的苷元结构，以上数据与文献报道一致［16］

。鉴定

该化合物为二氢异葫芦素 B-25-乙酸酯（Dihy‐

droisocucurbitacin B-25-acetate），结构式见图3。

化合物 4 为淡黄色针状结晶，高分辨 ITTOF-ESI-MS 显 示 分 子 离 子 峰（m/z）：603.3

［M+HCOO］-

，分子式C32H46O8。1

H-NMR（C5D5N，

500 MHz）高场区显示 9 个甲基信号，分别为 δH

1.13（3H， s， H-18），1.21（3H， s， H-19），1.3（3H，

s， H-29），1.45（3H， s， H-28），1.53（3H， s， H26），1.56（3H， s， H-27），1.60（3H， s， H-30），

1.71（3H， s， H-21），1.92（3H， s， COCH3

），其中

9 个甲基质子为单峰，结合化学位移数据，可知其

中的 8 个与季碳相连，1 个与极性官能团相连。

13C-NMR和DEPT（C5D5N，125 MHz）谱显示32个

碳信号，其中 9 个甲基信号（δC19.3，20.4，21.0，

22.1，22.2，25.4，26.6，26.9，29.8），4 个亚甲基信号

75

第81页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

（δC24.6，37.3，46.7，49.5），8 个 次 甲 基 信 号（δC

34.6，43.3，60.3，71.1，72.8，120.6，122.9，150.4），

11 个季碳信号（49.0，49.2，51.3，51.4，80.1，80.2，

141.7，170.2，204.8，213.3，213.6），其中 δC170.2，

δH1.92数据表明母核中可能含有乙酰基。综上可

判断，化合物为四环三萜类的苷元结构，以上数据

与文献报道一致［17］，鉴定该化合物为葫芦素 B

（cucurbitacin B），结构式见图3。

2. 4　化 合 物 对 HepG2 肿 瘤 细 胞 的 抑 制 增 殖

作用

MTT 试验结果表明，从 Fr4 中分离得到的单

体成分可以抑制HepG2肿瘤细胞的增殖。由图4

可见，化合物 1~4 对 HepG2 肿瘤细胞的生长均有

一定的抑制作用，且抑制强度呈现一定的浓度依

赖性，半数有效抑制浓度为分别为 81.7，33.2，

22.9，27.3 µg/mL。

3　讨 论

罗汉果果实含丰富的葫芦烷三萜成分，广泛

的体内及体外试验证明罗汉果三萜成分具有降血

糖、抗氧化、抗炎、抗癌、保肝和改善生理机能等药

用活性［18-19］

。罗汉果块根的主要活性成分为结构

新颖的失碳葫芦烷三萜［7-8］

，但由于研究较少，目

前获得的成分数量有限。本试验首次发现，罗汉

果块根中含有双氢葫芦素 E，葫芦素 E，二氢异葫

芦素B-25-乙酸酯，葫芦素B成分。

研究表明，葫芦素具有广泛的抗肿瘤活性、保

肝功能［20-22］

，本试验对罗汉果根甲醇提取物及不

同极性部位进行体外 α-葡萄糖苷酶和 HepG2 肿

瘤细胞抑制研究，结果表明：具有最强生理活性的

是 100% 甲醇洗脱部位（Fr4），可初步确定罗汉果

根中具有较强生理活性的化学成分集中在 Fr4部

位。进一步对Fr4部位进行分离纯化，得到4种葫

芦素，这 4 个成分表现出较显著的抑制 HepG2 肿

瘤细胞增殖作用，表明葫芦素成分是 Fr4 部位的

主要活性成分。单体化合物之间的生物活性具有

明显的差异，可能与分子结构有关；由于单体成分

图3　化合物结构式

Fig. 3 Chemical structures of four compounds

图4　化合物对HepG2肿瘤细胞增殖的抑制作用

Fig. 4 Inhibitory effects of the compounds on prolif⁃

eration of HepG2 cells

76

第82页

扈芷怡，等：罗汉果根的生物活性及化学成分

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

不足，故只做了抑制肿瘤细胞方面的试验，后面可

加大提取量，继续研究罗汉果根相关的药理活性。

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［20］ 郑倩，宋冠华，张斌 . 葫芦素 B 抑制神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞增殖机制的初步研究［J］. 实用药物与临床，

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［21］ 李丽，随何欢，黄家君 . 葫芦素 E对人结肠癌细胞 Caco-2

增殖与迁移的影响及其作用机制［J］. 第三军医大学学

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［22］ 何佳怡，卫旭东，何健，等 . 葫芦素 E 对人喉癌干细胞生

理活动的影响及分子机制探究［J］. 中国现代药物应用，

2019，13（9）：232-234.

（责任编辑：王希）

77

第83页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：78-85

Journal of Jilin Agricultural University

西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织

表达特异性分析及PqOSC2基因的克隆*

邸 鹏1，2，3

，闫 艳3

，王英平3**

1. 中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700；2. 中国中医科学院中药资源中心道地药

材国家重点实验室培育基地，北京 100700；3. 人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究

中心，长春 130118

摘 要：氧化鲨烯环化酶是催化三萜类皂苷合成的关键酶，通过全长转录组分析鉴定西洋参中氧化鲨烯环化

酶，利用生物信息学方法对西洋参全装转录组数据库中OSC（氧化鲨烯环化酶）基因家族进行鉴定并对其进行

蛋白基序、理化性质、表达特征分析。结果表明：从西洋参中共鉴定到15个西洋参OSC基因家族，系统发育分

析将其分为 7个亚族，组织特异性表达分析表明，OSC基因家族在不同部位具有 4种表达模式，OSC与人参皂

苷积累共表达分析表明，OSC基因家族与不同类型皂苷合成相关。试验还克隆得到与原人参三醇和人参皂苷

Re合成正调控的PqOSC2基因全长序列，为进一步揭示氧化鲨烯环化酶家族在西洋参三萜皂苷合成作用机制

提供依据。

关键词：西洋参；氧化鲨烯环化酶；PqOSC2基因；人参皂苷；生物信息学

中图分类号：S567. 53 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0078-08

DOI：10.13327/j.jjlau.2022.1916

引用格式：邸鹏，闫艳，王英平.西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织表达特异性分析及PqOSC2基因

的克隆［J］.吉林农业大学学报，2024，46（1）：78-85.

Identification and Tissue-specific Expression Analysis of Oxidosqua⁃

lene Cyclase Gene Family and Cloning of PqOSC2 Gene in Panax

quinquefolium *

DI Peng1，2，3

，YAN Yan3

，WANG Yingping3**

1. Center for Post-doctoral Research， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700，

China；2. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs of the National Resource Center for

Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700，China；

3. State Local Joint Engineering Research Center of Ginseng Breeding and Application， Jilin Agricul⁃

tural University， Changchun 130118， China

Abstract：Oxidosqualene cyclase is the key enzyme that catalyzes biosynthesis of triterpenoid sapo‐

nins, and the identification of oxidosqualene cyclase in Panax quinquefolium is carried out by fulllength transcriptome analysis, which provides a basis for the analysis of biosynthesis mechanism of

triterpene saponins in P. quinquefolium. In this study, bioinformatics methods were used to identify

* 基金项目：吉林省自然科学基金项目（20210101190JC），国家重点研发计划项目（2021YFD1600900），吉林省重大科技专项

（20200504001YY）

作者简介：邸鹏，男，博士，副教授，研究方向：中药资源学，分子生药学。

收稿日期：2022-08-02

** 通信作者：王英平，E-mail：yingpingw@126.com

第84页

邸鹏，等：西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织表达特异性分析及PqOSC2基因的克隆

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

oxidosqualene cyclase gene family in the transcriptome database of P. quinquefolium and analyze

their protein motif, physicochemical properties, and expression characteristics. A total of 15 OSC

genes were identified from P. quinquefolium. Phylogenetic analysis grouped them into 7 subfamilies,

tissue-specific expression analysis showed that OSC gene family had four expression patterns in dif‐

ferent tissues, and co-expression analysis of OSC and ginsenosides accumulation showed that OSC

family gene was associated with different types of saponins. The full length of PqOSC2 which was

positively correlated to the accumulation of ginsenoside Re and Protopanaxatriol was also cloned.

This study provides a basis for further revealing the mechanism of the oxidosqualene cyclase family

in P. quinquefolium triterpene saponins biosynthesis.

Key words：Panax quinquefolium； oxidosqualene cyclase；PqOSC2 gene; ginsenoside； bioinfor‐

matics

西洋参（Panax quinquefolium L.）是五加科人

参属多年生草本植物，原产于北美，具有补气养

阴、清热生津的功效，用于气虚阴亏、内热、咳喘痰

血、虚热烦倦等症。西洋参中主要的生物活性成

分是人参皂苷，具有治疗心血管疾病，神经系统疾

病，抗炎症和抗衰老等作用［1-2］

。

氧化鲨烯环化酶（Oxidosqualene cyclase，OSC，

EC 5.4.99.7）是植物中甾醇和三萜类合成途径中

的关键酶，能够催化2，3-氧化鲨烯环化转化为甾

醇和三萜类物质前体［3］

。在 OSC 作用下，2，3-氧

化鲨烯经过质子化、环化、重排和去质子化转化为

甾醇和三萜类的前体物质，此催化过程又是决定

三萜类产物多样性的关键步骤［4-6］

。目前，以此步

骤催化产物为骨架的三萜类化合物已有 100 余

种［7］

。由于 OSC 基因家族的功能差异，催化 2，3-

氧化鲨烯环化过程中会产生“椅-椅-椅”和“椅船-椅”这2种不同的构象。三萜类化合物主要通

过“椅-椅-椅”构象形成，甾醇类化合物主要通过

“椅-船-椅”构象形成［8］

。OSCs 是一个超基因家

族，该家族成员具有 DCTAE和 QW 等高度保守序

列 ，其 中 的 DCTAE 保 守 序 列 与 底 物 结 合 相

关［9-11］

，QW（QXXXXXW）特征序列是带有负电性

的芳香族氨基酸区域，在2，3-氧化鲨烯环化反应

中起到稳定碳阳离子的作用［12］

。随着植物次生

代谢途径的不断解析，越来越多的 OSC 基因被分

离和克隆并进行功能验证。截至目前，已从植物

中克隆得到了 80 余个 OSC 基因，如拟南芥［13-14］

、

人参［15-17］

、甘草［18-19］

等，并且部分进行了功能鉴

定。在已鉴定的OSC中，约1/3为甾醇合成酶，如

环戊烯醇合酶以及几种羊毛甾醇合酶，羊毛甾醇

合酶在植物中的功能尚不清楚，这些酶可能参与

植物甾醇的合成［16，20］

。植物中的OSC能够产生多

样的三萜骨架，一部分产生常规的三萜骨架，如

β-香树脂醇和羽扇豆醇，另外一些OSC则产生单

个或多个 2，3-氧化角鲨烯环化产物［21-22］

。氧化

鲨烯在植物中多环化酶以基因家族形式存在，家

族中不同类型酶的结构以及其催化 2，3-氧化鲨

烯发生环化反应的机理尚不完全清楚，需要对其

进行深入的研究。因此，利用基因组及转录组数

据对药用植物中 OSC 基因家族进行鉴定和分析，

解析不同类型 OSC 催化机制是该基因家族的研

究趋势。

试验对西洋参全长转录组数据进行深度挖

掘，获得 15 个 OSC 基因，对其进行系统的生物信

息学分析，检测其在不同组织的表达模式，结合代

谢组学结果构建共表达网络，建立OSC基因家族

与人参皂苷积累的关联，为进一步揭示西洋参中人

参皂苷等三萜类成分的合成机制提供理论依据。

1　材料与方法

1. 1　供试材料

西洋参采自抚松县万良镇（北纬42°26′9.22″，

东经127°17′21.00″），采集时间为2021年6月9日，

经吉林农业大学田义新教授鉴定为 4 年生西洋

参。采根、叶、花蕾，液氮中速冻后-80 ℃保存，用

于提取总RNA，进行转录组测序。

1. 2 OSC基因家族鉴定

西洋参转录组数据由课题组测序获得（https：∥

db.cngb.org， CNP0002014， CNP0001680）。共拼接

组装获得 241 213 个 unigenes，利用拟南芥的 At‐

LUP1（At1g78970），AtCAS1（At2g07050），AtLAS1

（At3g45130）为查询条件（Query），利用本地 Blast

79

第85页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

软件在西洋参转录组数据中进行Blast搜索比对，

初步筛选到拟南芥 OSC 基因家族在西洋参中的

同源基因，最后除去所得全部序列中的重复序列。

利用 NCBI的 CCD 数据库对蛋白保守结构域进行

鉴定，并删除不含特征结构域的基因。

1. 3 OSC蛋白结构和保守基序分析

西洋参OSC基因家族开放阅读框（ORF）分析

使用 ORF finder 在线分析（https：∥www.ncbi.nlm.

nih.gov/orffinder/），计算西洋参 OSC 基因家族各

成员的蛋白等电点、分子量等基本理化性质，分析

使用 ProtParam 在线分析（http：∥web.expasy.org/

protparam/）；使 用 Cell-PLoc（http：∥www. csbio.

sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行亚细胞定位

预测。利用 MEMEsuit（http：∥meme-suite.org/in‐

dex.html）在线分析西洋参 OSC 蛋白的保守基序。

运用SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）对

得到的保守基序进行功能注释，并参照拟南芥命

名模式对西洋参保守基序命名。

1. 4 OSC基因家族序列比对与系统进化分析

利用ClustalX对15个西洋参OSC基因的保守

域进行比对。利用在线软件 Web Logo 3（http：∥

weblogo.threeplusone.com/）分析OSC保守结构域，

利用 MEGA X 进行系统进化分析，系统进化分析

参数使用Neighbor-joining（NJ）法则的P-距离（Pdistance）模型构建，并进行1 000次Bootstrap抽样。

1. 5 OSC基因组织表达差异分析

根 据 已 完 成 的 西 洋 参 RNA-seq 测 序 数 据

（https：∥db.cngb.org，CNP0002014，CNP0001680）

对 OSC 基因进行表达特征分析。转录组数据包

括西洋参根、叶及花蕾中的基因表达量。将

FPKM值作为转录本丰度，均一化处理数据后，利

用TBtools工具绘制表达热图。

1. 6 OSC与人参皂苷的共表达网络构建

利 用 皮 尔 逊（Pearson）相 关 系 数 确 定 不 同

OSC基因家族在不同部位的表达量与22种人参皂

苷积累［23］

的相关性，利用Cytoscope软件构建西洋

参OSC基因家族与人参皂苷积累的共表达网络。

1. 7 PqOSC2的克隆

将西洋参叶片总 RNA 反转录成 cDNA，利用

Primer-BLAST（https：∥www. ncbi. nlm. nih. gov /

tools/ primer-blast/index.cgi）在线软件设计克隆

载体的引物（上游引物：5'-TGGAAGCTTAAGA

TAGCGGAAG-3'；下游引物：5'-GGTGCCTAGGG

ACGGTGATG-3'），以西洋参叶片 cDNA 为模板，

进行PCR扩增，PCR反应体系为50 µL：Mix 25 µL，

cDNA 1 µL，上 游 引 物 2 µL，下 游 引 物 2 µL，

ddH2O 20 µL。PCR扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；

变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，

35次循环；后延伸72 ℃ 10 min。将扩增的目的片

段回收纯化，并连接到pEASY-T1克隆载体上，连

接体系为 5 µL：模板（DNA）4 µL，pEASY-T1 Vec‐

tor 1 µL，连接产物转化 DH5α 菌株，选取单菌落，

送至生工生物工程（上海）有限公司测序。

2　结果与分析

2. 1　西洋参OSC基因家族的鉴定及序列分析

利用 Blast 本地比对筛选和对 OSC 结构域的

鉴定（表1），确定了15个西洋参OSC家族成员，命

名为 OSC1~OSC15。15个 OSC基因编码的蛋白长

为156~824氨基酸；蛋白分子量为19.36~88.44 ku，

其中 11个蛋白等电点<6.5，显酸性。对得到的西

洋参 OSC蛋白进行定位分析显示，OSC1、OSC7定

位于细胞膜上，OSC12定位于细胞核，其他定位于

叶绿体上。

2. 2　西洋参OSC家族的基因结构和进化分析

通过在线软件 MEME 和 TBtools 软件对西洋

参的OSC蛋白进行保守motif分析（图1）。OSC基

因家族中含有 5 个保守 motif，不同 OSC 基因家族

成员之间所包含的 motif 不同。OSC 家族成员具

有 DCTAE 和 QW 等高度保守序列，motif4 包含

DCTAE序列，motif1，motif5包含QW（QXXXXXW）

序列。每个 OSC 基因家族的成员都含有数量不

等的 DCTAE 和 QW，且不同的 OSC 基因家族之间

的保守结构域的氨基酸存在变异。

为进一步解析西洋参中 OSC 基因家族的进

化，对西洋参及其他双子叶植物如拟南芥、人参、

百脉根和单子叶的水稻中已报道的 OSC 基因进

行了进化分析。结果显示（图 2），所有 OSC 被分

为7个亚族。通过对系统进化树各个分支进一步

分析发现，编码催化环戊烯醇，羊毛甾醇和葫芦二

烯合酶的基因都被分在1组，西洋参OSC1、OSC3、

OSC8、OSC9、OSC13 聚在此类。编码催化产物为

β-香树脂醇合成酶的基因都聚在第 5 组，OSC2、

OSC4、OSC5、OSC6 聚 在 此 类 ，OSC14、OSC15、

OSC10与PgPNA聚在一类，在第3组。

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表1 西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族鉴定

Table 1 Identification of OSC gene family in P. quinquefolium

基因名称

OSC7

OSC5

OSC8

OSC10

OSC4

OSC6

OSC3

OSC13

OSC2

OSC1

OSC14

OSC9

OSC15

OSC12

OSC11

转录组编号

i2_LQ_Pq_c2573/f1p0/2919

i2_LQ_Pq_c11281/f1p0/2564

i2_LQ_Pq_c7608/f1p0/2302

i3_LQ_Pq_c9124/f1p0/3642

i2_HQ_Pq_c9511/f2p0/2737

i2_LQ_Pq_c12393/f1p0/2650

i2_HQ_Pq_c757/f6p0/2538

i2_HQ_Pq_c15415/f4p0/2527

i2_HQ_Pq_c11885/f3p0/2694

i1_LQ_Pq_c80190/f1p0/1027

i2_HQ_Pq_c41434/f100p0/2616

i3_LQ_Pq_c25546/f1p7/3667

i2_LQ_Pq_c23290/f1p0/2710

i5_LQ_Pq_c3737/f1p4/5333

i5_LQ_Pq_c3396/f1p0/5842

定位

细胞膜

叶绿体

叶绿体

叶绿体

叶绿体

叶绿体

叶绿体

叶绿体

叶绿体

细胞膜

叶绿体

叶绿体

叶绿体

细胞核

叶绿体

氨基酸

371

507

702

299

761

708

758

758

763

229

769

314

707

824

156

分子量/ku

42.25

58.22

79.92

34.08

87.87

81.47

86.08

86.08

87.95

25.86

88.44

35.83

55.5

9038

19.36

等电点

5.18

5.74

5.85

5.89

5.92

5.99

6.05

6.05

6.09

6.15

6.40

6.52

6.55

8.01

9.50

A.保守基序分布；B.保守基序序列

图1　氧化鲨烯环化酶基因家族的保守域分析

Fig. 1 Conservative domain analysis of OSCs identified from P. quinquefolium

81

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吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

2. 3 OSC基因家族在不同部位的表达情况及与

人参皂苷积累的共表达分析

对西洋参根、叶、花蕾中基因表达情况进行分

析，将15个OSC基因在不同部位的表达情况进行

聚类并绘制成表达模式聚类热图（图 3）。OSC 基

因 家 族 在 不 同 部 位 的 表 达 模 式 有 4 种 类 型 ，

OSC9、OSC8、OSC13 在 叶 中 表 达 最 高 ，OSC14、

OSC15、OSC7、OSC10、OSC11 在叶和花蕾中高表

达，OSC1 在根中表达最高，其他 OSC 基因都在叶

中表达最高。不同的表达模式可能与 OSC 基因

家族参与不同类型皂苷合成有关。为进一步解释

OSC 基因家族与人参皂苷积累的关系，利用人参

皂苷积累与 OSC 基因表达情况进行共表达网络

分析（图 4）。结果显示，人参皂苷 Rb3、Rb2 与

OSC8、OSC9 相关，人参皂苷 Rk1与 OSC1、OSC13、

OSC5、OSC3、OSC2 相关，人参皂苷 Rd 与 OSC2、

OSC12 相 关 ，人 参 皂 苷 Rf 与 OSC11、OSC15、

OSC14相关。

图2　氧化鲨烯环化酶基因家族的进化分析

Fig. 2 Phylogenetic analyses of OSC family gene family in P. quinquefolium

R.根；L.叶片；F.花蕾

图3　西洋参不同部位OSC基因表达模式聚类热图

Fig. 3 Clustering heatmap of OSC gene exression

patterns in P. quinquefolium

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邸鹏，等：西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织表达特异性分析及PqOSC2基因的克隆

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 4 PqOSC2基因的克隆

以西洋参叶片 cDNA 作为模板，根据转录组

测 序 结 果 设 计 3'端 和 5'端 的 特 异 性 引 物 ，对

PqOSC2 基因进行 PCR 扩增（图 5-A），PqOSC2 基

因开放阅读框（ORF）为2 289 bp，编码763个氨基

酸，包括 203 bp 5' UTR 和 199 bp 3' UTR（图 5-

B）。利用ProtScale软件进行亲疏水性分析（图5-

C），显示其为亲水蛋白，第 379 位亮氨酸（Leu）峰

值最高，为 2.644，疏水性最强；第 362 位谷氨酸

（Glu）峰值最低，为-2.789，亲水性最强。PqOSC2

蛋白的二级结构中 α-螺旋（Alpha helix）、β-转角

（Beta turn）、延伸带（Extended strand）和无规则卷

曲（Random coil）的氨基酸残基所占比例分别为

45.09%，6.55%，13.37%，34.99%（图5-D）。

3　讨 论

三萜类是最具多样性的植物次生代谢产物之

一。截至目前，已经鉴定出约 200 种不同的骨

架［24］。三萜和甾醇一样，是由氧化鲨烯环化

酶（OSC）家族的成员环化 2，3-氧化鲨烯合成

的［7，25-29］

。目前，对植物中 OSC 家族的功能研究

已有相关报道，但药用植物中对 OSC 家族的功能

研究还不深入，由于 OSC 是三萜类成分多样性形

成的关键步骤，因此对于 OSC 基因家族的研究具

重要的意义。

本研究中鉴定发现的15个西洋参OSC基因，

均没有跨膜结构且不存在信号肽，多数为叶绿体

定位。保守结构域预测表明，西洋参 OSC 都有环

氧鲨烯环化酶特征保守结构域。保守位点预测发

现 ，15 个 西 洋 参 OSC 蛋 白 质 都 存 在 DCTAE、

QXXXXXW 2种保守基序。DCTAE被认为与底物

结合相关［11］

，QXXXXXW 重复序列被认为与蛋白

质结构的稳定性和功能相关［12］

。

橙色连线代表正相关；蓝色连线代表负相关

图4　氧化鲨烯环化酶基因家族与人参皂苷合成的共表达分析

Fig. 4 Co-expression analysis of OSC gene family and ginsenosides in P. quinquefolium

83

第89页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

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聚类分析结果表明，OSC8、OSC13 与环阿屯

醇合成酶（PgOSCPNX1）聚类在一起，同时 OSC8

与 OSC13 具有相同的表达模式，均在叶中高表

达 ，OSC8 与 OSC13 可 能 为 环 阿 屯 醇 合 成 酶 ；

OSC14、OSC15、OSC7与达玛烷合成酶（PgPNA）聚

类在一起，且具有相同的表达模式，即在叶与花蕾

中高表达，这 3 个基因可能为达玛烷合成酶；

OSC6、OSC5、OSC2 与 β - 香 树 脂 醇 合 成 酶 1

（PgOSCPNY1）聚类在一起，且具有相同表达模

式，在花蕾中表达最高，这 3 个基因可能为 β-香

树脂醇合成酶 1；OSC4 与 β-香树脂醇合成酶 2

（PgOSCPNY2）聚类在一起，并有特殊的表达模

式，即在根中表达最高，可能为 β-香树脂醇合

成酶2。

利用 Pearson 相关系数构建代谢产物与基因

之间的共表达网络，研究 OSC 基因家族在西洋参

不同部位的表达情况与 22 种人参皂苷积累的关

联性，进而揭示 OSC 基因家族与人参皂苷合成的

关联。在共表达网络中 OSC4、OSC7 与多种人参

皂苷积累均有相关性，OSC7在地上部分高表达且

聚类为达玛烷合成酶，OSC4在根中高表达且聚类

为 β-香树脂醇合成酶 2，可能与不同人参皂苷在

西洋参不同部位特异积累有关。其他 OSC 基因

也表现出与不同人参皂苷积累的相关性，这些关

联为进一步揭示 OSC 基因家族在西洋参中人参

皂苷合成调控的作用机制奠定了基础。

本试验利用生物信息学的手段鉴定了西洋参

中 15 个 OSC 基因，并对其保守结构域、基因结构

及系统进化等方面进行了分析，分析了 OSC 基因

家族在西洋参不同部位的表达情况，并利用共表

达网络构建了 OSC 基因家族与不同类型人参皂

苷积累的关联，为深入研究该基因家族的表达调

控、结构和功能等提供参考，为揭示该基因家族在

西洋参植物生长、发育及皂苷积累等方面的调控

机制解析提供了理论依据。

A. PqOSC2基因的克隆；B. PqOSC2基因的全长序列；C. PqOSC2蛋白的亲疏水分析；D. PqOSC2蛋白的二级结构分析

图5 PqOSC2基因的克隆与分析

Fig. 5 Cloning and analysis of PqOSC2 gene

84

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邸鹏，等：西洋参氧化鲨烯环化酶基因家族的鉴定、组织表达特异性分析及PqOSC2基因的克隆

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

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（责任编辑：林海涛）

85

第91页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

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吉林农业大学学报 2024，46（1）：86-91

Journal of Jilin Agricultural University

红参水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响*

张 娇1，2

，侯 微2

，王英平1**

1. 吉林农业大学中药材学院，长春130118；2. 中国农业科学院特产研究所，长春 130112

摘 要：通过对秀丽隐杆线虫各项生理指标及衰老相关基因的测定，观察红参水提物（RGWE）对线虫寿命的

影响，并初步探索其作用机制。将秀丽隐杆线虫分别培养在普通培养基以及添加了不同质量浓度 RGWE

（0. 8，1. 4，2. 0 mg/mL）的培养基中，观察RGWE对线虫寿命、热应激、氧化应激、ROS含量、脂褐素含量的影响；

通过qRT-PCR测定抗衰老相关基因的表达水平，初步探索RGWE抗衰老作用机制。结果表明：RGWE能极显

著延长秀丽隐杆线虫的寿命，提高其抗应激能力，降低脂褐素水平及 ROS含量，显著上调 daf-16、sir2. 1表达

水平。

关键词：红参；秀丽隐杆线虫；衰老；寿命

中图分类号：S567. 5 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0086-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2024.5336

引用格式：张娇，侯微，王英平.红参水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响［J］.吉林农业大学学报，2024，46（1）：

86-91.

Effect of Red Ginseng Water Extract on Senescence Index of Cae⁃

norhabditis elegans *

ZHANG Jiao1，2

，HOU Wei2

，WANG Yingping1**

1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，

China；2. Institute of Special Wild Economic Animals and Plants， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Changchun 130112， China

Abstract：Through the determination of various physiological indicators and aging related genes, the

effect of water extract of red ginseng (RGWE) on the lifespan of Caenorhabditis elegans（C. elegans）

and its possible mechanism were observed. C. elegans was cultured in the normal media containing

different concentrations (0.8, 1.4 and 2.0 mg/mL) of RGWE medium, and explored the effect of

RGWE on life, heat stress, oxidative stress, ROS content and lipofuscin content. qRT-PCR was used

to determine the expression level of anti-aging related genes, and the anti-aging mechanism of

RGWE was initially explored. RGWE can significantly prolong the life-span of nematodes, improve

anti-stress ability, reduce lipofuscin levels and ROS levels, and up-regulate significantly the expres‐

sion level of daf-16 and sir2.1 genes.

Key words：red ginseng；Caenorhbditis elegans；aging； lifespan

* 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20220204070YY）

作者简介：张娇，女，硕士，研究方向：中药药理学。

收稿日期：2019-07-26

** 通信作者：王英平，E-mail：yingpingw@126.com

第92页

张娇，等：红参水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

人参是五加科植物人参（Panax ginseng C.A.

Mey.）的干燥根及根茎［1］

。人参对中枢神经、心血

管、内分泌、免疫系统等具有广泛的作用，早在《神

农本草经》中就有记载：“人参，味甘微寒，主补五

脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益

智。久服，轻身延年”［2-3］

。红参是由人参经过浸

润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干炮制而成，皂苷

的种类和含量都发生了变化［4-5］

。红参具有多种

生物活性，如增强免疫、缓解疲劳、抗氧化、抗抑

郁、抗肿瘤［6-8］

等。还有研究表明，红参可能具有

潜在的减肥作用和神经保护作用［9-10］

。

秀丽隐杆线虫是一种存在于土壤中非寄生的

低等生物，从死去的动物或植物中获取食物。由

于秀丽隐杆线虫的生命周期较短，且其与人类的

同源基因为60%~80%，因此成为良好的寿命遗传

模型之一［11-12］

。胰岛素信号通路、TOR信号通路、

AMPK信号通路、NF-κB信号通路、沉默信息调节

因子等均与秀丽隐杆线虫的衰老机制有密切的关

系。在秀丽隐杆线虫中，转录调节因子 SKN-1对

于抗氧化应激反应很重要，并且在多种抗衰老信

号通路中起作用［13］

。其中明显的是胰岛素信号通

路，该通路由daf-2、age-1、pdk-1、sgk-1、akt-1/2、

daf-16 等转录因子组成，是目前衰老机制研究中

最广泛认可的一条途径［14］

。本试验通过对各项

生理指标及衰老相关基因表达水平的测定，观察

红参水提物（RGWE）对秀丽隐杆线虫寿命的影响

并初步探索其作用机制。

1　材料与方法

1. 1　材料与设备

红参水提物（Red ginseng water extract，RGWE）：

红参经水煮沸 3次，浓缩至浸膏。红参为 5年生，

购自长白山皇封参业股份有限公司，经中国农业

科学院特产研究所许世泉研究员鉴定。HPLCMS/MS分析主要成分：人参皂苷Re 1.4%，人参皂

苷 Rg1 0.77%，人参皂苷 Rf 0.39%，人参皂苷 Ro

1.27%，人参皂苷 Rb1 3.95%，人参皂苷 Rc 2.88%，

人参皂苷Rb2 2.75%，人参皂苷Rb3 0.39%，人参皂

苷 Rd 1.50%；人参多糖 1.1%，蛋白质 2.43%。野

生型秀丽隐杆线虫（N2）由吉林大学生命科学学

院研究室惠赠。

琼脂粉（OXOID），5-氟尿嘧啶（Dimethyl sulf‐

oxide，5-FU），胡桃醌（Juglone）（Sigma公司），ROS

试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他均为分

析纯。

恒温恒湿培养箱（上海博讯实业有限公司），

SMZ745 体视显微镜（尼康），超净工作台（上海智

城仪器有限公司），高压灭菌锅（上海申安医疗器

械厂），多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），

荧光显微镜（美国AMG EVOS FL）。

1. 2　方法

1. 2. 1 线虫的培养及同期化 采用固体 NGM

培养基培养线虫，线虫同期化方法：挑取产卵高峰

期的秀丽线虫于线虫生长培养基（NGM）培养板

中，使其产卵 2 h 后，移走成虫，置于 20 ℃培养箱

中倒置培养，便可以得到同期化的线虫［15］

。

1. 2. 2 线虫的给药方式 空白组线虫培养在不

含 RGWE 的培养板上，以大肠杆菌 OP50 为食。

给药组线虫培养在含不同质量浓度 RGWE（0.8，

1.4，2.0 mg/mL）的 NGM 培养基中，并以含有与培

养基相同浓度 RGWE 的大肠杆菌 OP50 为食物。

各组均从受精卵开始给药［16］

。

1. 2. 3 寿命试验 取20条产卵期的秀丽线虫于

含或不含 RGWE 的 NGM 培养板中，待其产卵 2 h

后移走成虫，此时记为寿命试验第 0 天。待成虫

后，每天转板到新的培养板上，并详细记录线虫生

存、死亡的条数，直至线虫全部死亡。每组线虫

100条，试验重复3次［17］

。

1. 2. 4 热应激试验 分别取 20 条产卵期线虫，

于空白板和给药板上，产卵 1 h后移走，培养至成

虫后，转移至新的试验板中，给药 5 d 后，置于

35 ℃培养箱中培养，直至线虫全部死亡。每隔1 h

统计线虫死亡的数量，并详细记录。每组线虫

60 条，试验重复3次［18］

。

1. 2. 5 氧化应激试验 同期化的线虫暴露培养

5 d 后，挑取一定数量于含有 400 µmol/L 胡桃醌

的 96孔板中，每孔挑入 2条线虫，每隔 1 h记录线

虫死亡数，连续观察 12 h。每组线虫 60 条，试验

重复3次［19］

。

1. 2. 6 线虫体内ROS含量的检测 采用荧光探

针 DCFH-DA 进行线虫体内活性氧的检测。取各

组暴露培养5 d的线虫于含有75 µL M9缓冲液的

96 孔板中，35 ℃放置 2 h，然后每孔加入 25 µL

的 DCFH-DA，避 光 放 置 30 min。 在 485 nm 和

535 nm 下，用多功能酶标仪测定各组荧光强度。

87

第93页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

每组线虫60条，试验重复3次［20］

。

1. 2. 7 线虫的脂褐素含量 挑取各组线虫至含

适量5%琼脂糖及1%叠氮化钠溶液的载玻片上，

盖上盖玻片，置于荧光倒置显微镜下观察，拍摄荧

光图片，通过空白组与给药组荧光强度大小进行

判断。每组试验30条，试验重复3次［21］

。

1. 2. 8 线虫体内有关衰老基因的表达 线虫培

养方法同寿命试验，取给药 5 d 后的线虫于 EP 管

中，用M9缓冲液冲洗数次，总RNA的提取使用柱

式动物总 RNA 纯化提取试剂盒。RNA 纯度及完

整性鉴定后，进行 cDNA 的合成，利用 qRT-PCR

对线虫抗衰老相关基因的表达水平进行监测，结

果用 ΔΔCT 法计算。相关引物，由上海生物工程

有 限 公 司 合 成 ：daf-16 上 游 引 物 CAAGCCAA

TGCCACTACCG，下游引物 GCCGATGAAGAAGC

GACAG；age-1 上游引物 ATGGAAACCGCCGAG

TG，下 游 引 物 TTCGTACTTCAACGCCTGTA；

sir2.1 上游引物 CAGAAGATGACGATGATACAC，

下游引物GATGAGCAAGACGAACCA；skn-1 上游

引物 CCACCAGCATCTCCATTC，下游引物 CTTCT

CCATAGCACATCAATC；β-actin 上游引物 ACCT

GACCGACTACCTCA，下游引物 GTTGCCGATGG

TGATGAC。

1. 3　数据统计

数据采用 GraphPad软件进行统计分析，数值

以平均值±标准差表示，采用Student's T-test 进行

差异显著性分析，P<0.01表示差异极显著，P<0.05

表示差异显著，P>0.05表示无统计学意义。

2　结果与分析

2. 1 RGWE对线虫寿命的影响

RGWE组线虫的平均寿命均高于空白组。由

图 1 可见，空白组线虫在 20 ℃的平均寿命为

（18.4±0.5）d。相比于空白组，0.8 mg/mL 组线

虫 的 平 均 寿 命 为（20.4±0.6）d，延 长 了 10.93%

（P<0.05）；1.4 mg/mL 组线虫的平均寿命为（21.4±

0.5） d，延长了 16.49%（P<0.01）。与空白组相比，

2.0 mg/mL 组无统计学意义（P>0.05）。试验数据

表明，RGWE 可以有效地延长线虫的寿命，延缓

衰老。

2. 2 RGWE对线虫热抵抗能力的影响

在35 ℃热应激条件下，红参水提物对线虫的

保护作用见图 2。RGWE 组线虫抗热激能力均有

所提高。相比于空白组［（8.3±0.3） h］，0.8 mg/mL

组线虫平均寿命为（9.9±0.3） h，存活率延长了

18.6%（P<0.01）；1.4 mg/mL 组平均寿命为（10.4±

0.3） h，存活率延长24.56%（P<0.01）。

2. 3 RGWE对线虫抗氧化损伤能力的影响

统计分析胡桃醌损伤条件下线虫的存活情

况，线虫生存曲线见图3。与空白组［（6.2±0.4） h］

相比，1.4 mg/mL RGWE给药组［（9.1±0.7） h］在胡

桃醌损伤条件下对线虫有极显著保护作用，生存

率延长 45.2%（P<0.01）；0.8 mg/mL RGWE给药组

［（7.8±0.5） h］同样具有保护作用，生存率延长了

25.02%（P<0.05）。

图1　红参水提物对线虫寿命的影响

Fig. 1 Effect of red ginseng water extract on lifespan

of C.elegans

图2　红参水提物对线虫热抵抗能力的影响

Fig. 2 Effect of red ginseng water extract on heat re⁃

sistance of C.elegans

88

第94页

张娇，等：红参水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

2. 4 RGWE对线虫体内ROS含量的影响

红参水提物对线虫体内 ROS 含量的影响见

图 4。由图 4 可见，与对照组相比，0.8 mg/mL 组、

1.4 mg/mL 组 线 虫 体 内 ROS 含 量 分 别 下 降 了

5.94%（P<0.05），6.94%（P<0.01）。

2. 5 RGWE对线虫体内脂褐素含量的影响

肠道自发荧光反映了脂褐素的积累，其积累

随着年龄增长而增多，可以作为线虫机体衰老的

有效生物指标。在荧光显微镜下可见线虫体内脂

褐素自发蓝色荧光。由图 5-A 与 5-B 比较，可以

发现，给药组线虫的脂褐素含量明显低于空白组，

1.4 mg/mL组线虫最明显。

2. 6 RGWE对线虫体内有关寿命基因表达水平

的影响

由图6可见，与空白组比较，RGWE组线虫体

内的 daf-16、sir2.1 基因 mRNA 水平显著增加，且

呈现量效关系；而 RGWE 对 age-1，skn-1 基因的

表达无明显影响。

图3　胡桃醌损伤条件下红参水提物对秀丽线虫生存率

的影响

Fig. 3 Effect of red ginseng water extract on survival

rate of C.elegans under juglone damage condi⁃

tion

图4　红参水提物对线虫体内ROS含量的影响

Fig. 4 Effect of red ginseng water extract on ROS

content in C.elegans

A.空白组；B. 0.8 mg/mL组；C. 1.4 mg/mL组

图5　红参水提物对线虫体内脂褐素含量的影响（×10）

Fig. 5 Effect of red ginseng water extract on content of lipofuscin in C.elegans（×10）

图6　红参水提物对线虫体内抗衰老基因转录水平的影响

Fig. 6 Effect of red ginseng water extract on antiaging gene transcription level in C.elegans

89

第95页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

3　讨 论

寿命是线虫衰老过程中最直观的评价指

标［22］

。本试验结果发现，培养在 RGWE培养基中

的线虫平均寿命以及最长寿命均得到有效延长，

1.4 mg/mL RGWE组效果最好。2.0 mg/mL RGWE

组无统计学意义，因此不做深入研究。

线虫的许多生理反应与寿命有关，如应激反

应、ROS 含量等。压力应激状态下生存率的提高

与寿命的延长具有很强的正相关性，压力应激能

力提高是线虫寿命延长的解释之一［23］

。本研究

发现，RGWE 组可显著延长线虫在热应激状态下

以及胡桃醌诱导氧化应激下的寿命，提高线虫压

力应激条件下的存活率。生物系统中活性氧

（ROS）的产生和消除之间的不平衡会导致对细胞

和组织的氧化损伤，同时伴随着形态和功能的改

变，从而导致衰老和与年龄相关的疾病［24］

。人参

可以通过 Klotho 抗衰老基因抑制 PI3K/AKT 通

路，激活 FOXO3，对线粒体 ROS 的产生起抑制作

用，从而减轻他克莫司诱导的氧化应激［25］

。Lith‐

gow［26］

在自由基老化理论中提出，老化是由活性

氧（ROS）引起分子损伤的累积而成，RGWE 可以

显著降低线虫体内 ROS 的含量。通过 qRT-PCR

结果显示，RGWE 能够显著提高 daf-16、sir2.1 基

因的表达量。sir2.1 是另一种进化保守的长寿调

节因子，可通过调节胰岛素/胰岛素生长因子信号

传导（IIS）途径直接激活 daf-16 来延长秀丽隐杆

线虫的寿命。综上，RGWE可以延缓线虫的衰老，

增强线虫的各项生理指标，其作用机制可能是通

过胰岛素/IGF-1 信号通路调控相关抗衰老基因

的表达水平。

现代研究发现，人参及人参皂苷有明显的抗

衰老作用［27-29］

。有研究表明，红参多糖也具有较

强的抗氧化作用［30-33］

。刘佳维等［34］

通过测定小

鼠脏器系数、各组织中 MDA 含量、SOD 活性以及

谷胱甘肽还原酶的活力，发现红参多糖具有良好

的体内抗氧化能力。人参浆果提取物中的丁香脂

素对人黑素瘤细胞具有抗黑色素的作用，同时可

以延长秀丽线虫的寿命，减少皮肤成纤维细胞中

脂褐素的积累，这些作用可能是由于激活长寿因

子FOXO3导致的有效抗氧化作用［35］

。由此推测，

红参水提物延缓线虫衰老可能是由人参皂苷和多

糖共同作用，其作用机制有待进一步探究。

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（责任编辑：王希）

91

第97页

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E⁃mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林农业大学学报 2024，46（1）：92-97

Journal of Jilin Agricultural University

不同参膜下人参叶片光合相关参数和产量的差

异分析*

方 平，杨 鹤，佐 月，王轶晗，卫宝瑞，张誉荠，巩金壮，许永华**

吉林农业大学中药材学院，长春 130118

摘 要：以4年生人参为试验材料，选择6种处理条件对其进行栽培，探究不同参膜和遮荫处理下人参光合效

率及产量变化，旨在寻找最佳的参膜材料和遮荫方法，为人参的优质、高产提供理论依据和技术指导。试验

6个处理分别为黄膜（1号膜），生产用蓝膜（2号膜），转光纳米膜（3号膜），黄膜+75% 黑色聚乙烯遮阳网（4号

膜），生产用蓝膜+75%黑色聚乙烯遮阳网（5号膜），转光纳米膜+75%黑色聚乙烯遮阳网（6号膜），其中生产用

蓝膜（2号膜）为对照组。在不同生育期测定光合参数，最后采收测产量，检测有效成分积累量。总的来看，人

参在黄膜+75%黑色聚乙烯遮阳网处理下净光合速率最大，转光纳米膜下气孔导度较小，胞间CO2浓度在每个

处理间差异不显著。从产量和有效成分来看，1号膜的总产量和总平均产量最高；5号膜人参叶中总皂苷含量

最高，1号膜人参根中总皂苷含量最高。综上，生产上推荐使用1号黄膜，其对提高产量和增加有效成分的积

累有一定帮助，原因可能是黄膜的透光率高，增加了人参的光合作用，提高了产量，而皂苷含量的提高可能是

人参为适应强光胁迫而积累了更多的皂苷。但是对于使用黄膜是否会带来人参植株早衰问题还有待研究。

关键词：人参；参膜；光合作用；产量

中图分类号：S567. 51 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2024）01-0092-06

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.6111

引用格式：方平，杨鹤，佐月，等 .不同参膜下人参叶片光合相关参数和产量的差异分析［J］.吉林农业大学学

报，2024，46（1）：92-97.

Differences of Photosynthetic Related Parameters and Yield of Gin⁃

seng Leaves under Different Ginseng Films *

FANG Ping，YANG He，ZUO Yue，WANG Yihan，WEI Baorui，ZHANG Yuqi，GONG Jin⁃

zhuang，XU Yonghua**

College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China

Abstract：Four-year-old ginseng was used as the experimental material. Six treatments were se‐

lected for cultivation, and changes in photosynthetic efficiency and yield of ginseng under different

ginseng film and shading treatments were explored. This experiment aims to find the best ginseng

film material and shading methods to provide theoretical basis and technical guidance for high qual‐

ity and high yield of ginseng cultivation. Six treatments were set up in the experiment, namely film

No. 1 (yellow film), film No. 2 (blue film for production), film No. 3 (light-transfer nano film), film No. 4

(yellow film + 75% black polyethylene shading Net), No. 5 film (blue film for production + 75%

black polyethylene shading net), No. 6 film (light conversion nano film + 75% black polyethylene

* 基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFC1702101），吉林省重点科技研发项目（20180201006YY）

作者简介：方平，男，硕士在读，研究方向：药用植物。

收稿日期：2020-12-17

** 通信作者：许永华，E-mail：xuyonghua777@yeah.net

第98页

方平，等：不同参膜下人参叶片光合相关参数和产量的差异分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

shading net), of which No. 2 film (blue film for production) was the control treatment. Photosynthetic

parameters were measured in different growth periods, and finally ginseng was harvested and yield

was measured to analyze the accumulation of active ingredients. Net photosynthetic rate of ginseng

under the treatment of yellow film + 75% black polyethylene shading net was the largest, stomatal

conductance under the treatment of light-transmitting nano film was small, and intercellular CO2 con‐

centration had no significant difference between each treatment. In terms of yield and active ingredi‐

ents, total yield and total average yield of No. 1 film were the highest; total saponin content in the 5th

film ginseng leaves wass the highest, while total saponin content in No. 1 film ginseng roots was the

highest. In summary, No.1 yellow film recommended for production can help improve the yield and

increase the accumulation of active ingredients. The reason may be that high transparency of the yel‐

low film increases photosynthesis and yield of ginseng, and the increase in saponin content may be

due to the accumulation of more saponins in ginseng in order to adapt to strong light stress. However,

it remains to be studied whether the use of yellow film can lead to premature aging of ginseng plants.

Key words：ginseng； ginseng film； photosynthesis； yield

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）是名贵中药，

为五加科人参属多年生宿根性草本植物，具有滋

补强壮、补气养血等多种功效。人参产地主要分

布于朝鲜、俄罗斯及中国东北地区的森林地带，

辽宁和吉林有大量栽培。在中国已有 2 000多年

的应用史和栽培史，也是第三纪幸存下来的极其

珍贵的植物活化石［1］

。

人参是喜阴凉气候的药用植物，常生长于林

下环境，对光照条件有严格的要求，所以生产上常

用遮阳网和参膜调节光照的强度和光质，从而进

行人参的人工栽培。植物叶片光合作用的变化，

是评价植株光合生产能力的重要理论依据，研究

表明，生育期中叶片光合作用与作物产量密切相

关［2-3］

。人参生长光环境的研究对于人参高产稳

产以及改变种植方式具有重要意义。目前，中国

学者在人参光照环境领域已经有颇多研究，而对

参膜颜色和遮荫调节复合研究较少。徐克章等［4］

研究了人参在不同光质环境下的光合特性，并认

为在低光强下，蓝光和红光的光合作用和光合效

率最高；韩国学者 Jang 等［5］

对人工栽培人参的不

同透光率进行了研究，发现人工栽培人参的最佳

透光率在13%~17%，这些研究都为人工栽培人参

提供了理论基础。目前，人参的遮荫材料主要以

蓝膜加聚乙烯黑色网为主，至于其他颜色的参膜

效果鲜见报道。本试验以 4 年生人参为材料，选

择不同参膜培养，设置6个处理，研究人参的光合

效率和产量，期望能找到最佳的参膜材料和遮荫

方法，为生产提供技术指导。

1　材料与方法

1. 1　试验材料

4 年生农田人参由抚松参王植保有限公司

提供。

1. 2　试验设计

于 2019 年 在 吉 林 省 白 山 市 抚 松 县（东 经

127°01′~128°06′，北纬41°42′~42°49′）抚松参王

植保有限公司参场中进行，作物生长期间（5—

10 月）的降雨量约 524 mm，最高气温 27 ℃，最低

气温 0 ℃，平均气温 18.4 ℃。试验设置 6个处理，

分别为黄膜（1 号膜），生产用蓝膜（2 号膜），转光

纳米膜（3 号膜），黄膜+75% 黑色聚乙烯遮阳网

（4 号膜），生产用蓝膜+75% 黑色聚乙烯遮阳网

（5 号膜），转光纳米膜+75% 黑色聚乙烯遮阳网

（6 号膜），其中以生产用蓝膜（2 号膜）为对照组。

参棚分为等长等宽2列，均为南北走向，单列棚长

20 m，宽1.5 m，每6 m 1个处理组，每2 m为1个重

复处理，共设置 3 次重复处理组。单列棚内不同

处理组之间相隔 1 m，一列棚内设置 3 个处理组。

田间管理按照一般的农田栽参管理。

1. 3　测定项目与方法

1. 3. 1 光合参数的测定 在每个处理组棚下选

取生长良好且大小一致的植株 3 株进行标记，每

1 个重复的植株生长位置都在棚下的中间位置，

且每个重复之间等距排开，即每个处理选择 3 株

进行生物学重复测定，测定时选择掌状复叶中间

小叶进行测定，每株叶片进行技术重复测定3次。

93

第99页

吉林农业大学学报 2024 年 2 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，February

用 ADC BioScientific LCpro-SD System Serial

便携式光合测定系统，配以开放式气路测定人参

生长绿果期、生长红果期和衰老期叶片的净光合

速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间 CO2浓度（Ci）等

参数。测定天气选择天气晴朗的 09：00~11：00

进行［6］

。

1. 3. 2 产量测定 在生长当年秋季，将处理棚

下的人参按照处理组全部起出，按照人参根重量

分别统计其鲜重和人参支数，并计算其单支平均

质量。总平均产量=总产量/总支数。

1. 3. 3 皂苷含量测定 （1）材料。每个处理组

选取9株人参，每个重复组选取3株。地上部分与

地下部分分开，经烘箱 50 ℃烘干 48 h，用粉碎机

打成粉末，过 0.250 mm（60 目）筛，备用。（2）对照

品溶液制备。精密称取人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、

Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 标准品2.96，3.54，2.18，2.34，

4.34，4.46，3.49，1.66，3.86 mg，分别置于 10 mL 容

量瓶中进行定容，加甲醇配置成不同浓度的混合

对照品溶液。（3）供试品溶液制备。取 1.0 g 的样

品粉末，精密称定，置于 50 mL 具塞磨口三角瓶

中，加入 25 mL 氨-水-甲醇溶液，密塞，超声提取

30 min（功率500 W，频率40 kHz），静置48 h，取上

清液，过 0.2 µm 微孔滤膜，待测。（4）色谱条件。

ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 ×50 mm，

1.7 m），流动相：乙腈-0.000 5%磷酸水溶液（梯度

洗 脱 ：0~3 min，17%~19% 乙 腈 ；3~4 min，19%~

21% 乙腈；4~4.5 min，21%~24% 乙腈；4.5~5 min，

24%~28% 乙 腈 ；5~6.5 min，28% 乙 腈 ；6.5~

7.5 min，28%~30% 乙腈；7.5~9.5 min，30%~36% 乙

腈；9.5 ~11 min，36%~40%乙腈），流速0.5 mL/min，

柱温35 ℃，进样量2 µL

［7］

。

1. 4　数据处理

先用 Microsoft Excel 2013 系统进行数据处

理，然后用 Graphpad prism8.0 和 Spss22 软件进行

差异显著性分析。

2　结果与分析

2. 1　不同参膜下人参叶片净光合速率的变化

由图1可见，在绿果期，75%遮阳网处理4，5，

6号膜的净光合速率明显高于没有遮阳网的处理

1，2，3 号膜，说明在绿果期需要适当遮阳以提高

光合作用；再从参膜来看，1 号膜和 2 号膜的净光

合速率显著高于 3 号膜，说明在绿果期不适合用

转光纳米膜进行遮荫，并且 4 号膜的净光合速率

显著高于其他组，说明在绿果期最佳的遮荫方式

是黄膜+75%遮阳网。在红果期，2号膜的光合速

率显著高于其他组，说明红果期 2 号膜蓝膜的遮

光效果最好，且 2号膜与 5号膜对比来看，差异显

著，说明此时在生产上使用蓝膜遮荫，应撤去遮阳

网，避免光强不足带来的生长缓慢，适当增加光强

有利于提高人参生长的光合速率。在衰老期，除

3号膜明显低于其他处理之外，1，2，4，5，6号膜光

合速率相对稳定，并且有遮阳网处理和无遮阳网

处理光合速率差异不明显，说明此时光强对人参

的净光合速率影响较小；从参膜来看，1 号膜和

4 号膜的净光合速率差异不显著，但是从光合速

率来看，却比其他膜处理净光合速率高，因此可以

看出，在人参生长后期，光质对人参的光合作用虽

然影响不显著，但还是有一定的影响，并且黄膜的

光合效率较高。从人参整个生育期来看，绿果期

的光合速率高于红果期和衰老期，但是需要添加

遮阳网减小光强，而红果期和衰老期对光强的敏

感度降低，可能需要适当增加光照来提高光合速

率。总的来看，4号膜的光合效率较好，与其他组

处理有显著差异，因此，黄膜+75% 遮阳网对提高

人参的净光合速率有较好作用。

2. 2　不同参膜下人参叶片气孔导度的变化

由图 2 可见，人参在不同生育期叶片的气孔

导度有明显差异，综合来看，表现为绿果期叶片的

气孔导度最高，红果期次之，衰老期最低。从生育

期来看，在绿果期，有遮阳网处理的4，5，6号膜叶

片气孔导度均比对应的无遮阳网的1，2，3号膜显

著高；在红果期，无遮阳网处理的1，2，3号膜叶片

图1　不同参膜下人参叶片的净光合速率

Fig. 1 Net photosynthetic rate of ginseng leaves un⁃

der different ginseng films

94

第100页

方平，等：不同参膜下人参叶片光合相关参数和产量的差异分析

吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University

气孔导度均比对应加遮阳网的 4，5，6 号膜高，由

此可以看出，绿果期需弱光强，红果期需要提高光

照度；在衰老期，气孔导度普遍较低，光强光质影

响较小，估计与人参衰老、植株生理活动降低有

关。总的来看，1，2，4，5号膜叶片气孔导度与3，6号

膜有显著差异，说明转光纳米膜处理下的人参叶片

气孔导度较小，其他参膜处理下气孔导度的差异不

明显。造成这种现象的原因可能是转光纳米膜下透

光率低，光照不足，引起人参叶片气孔开放度低。

2. 3　不同参膜下人参叶片胞间CO2浓度的变化

由图3可见，从整个生育期来看，人参叶片的

胞间CO2浓度变化趋势在每个处理间不明显。从

光强来看，在绿果期，未加遮阳网处理的1，2，3号

膜叶片胞间CO2浓度显著高于4，5，6号膜，原因可

能是绿果期人参植株生命力强，未加遮阳网处理

组的光照强度高，光合速率大，从而导致植株对

CO2的需求量大，所以叶片的胞间 CO2储存量大，

胞间CO2浓度高；在红果期，2号膜与5号膜比差异

显著，其他处理差异不明显。在衰老期，光强影响

较小，各处理组间差异不明显。从参膜来看，在衰

老期，1号膜和4号膜的胞间CO2浓度低，与其他组

处理有显著性差异，说明此时黄膜对人参的胞间

CO2浓度影响较大，其他组处理间差异不显著。

2. 4　不同参膜下人参产量的差异

由图 4 可见，1 号膜的人参总产量最高，为每

处理组8 580 g，分别比2号膜高10.96%，比3 号膜

高 14.22%，比 4 号膜高 3.38%，比 5 号膜高 0.35%，

比 6 号膜高 18.88%。6 号膜总产量最低，为每处

理组 6 960 g。1 号膜人参总平均产量最高，每支

为 67.03 g，分别比 2 号膜高 18.41%，比 3 号膜高

16.81%，比 4 号膜高 7.70%，比 5 号膜高 5.52%，比

6号膜高21.93%。6号膜总平均产量最低，每支为

52.33 g。在不同的参膜下，1 号膜的人参产量最

高，5号膜次之，6号膜最低。

图2　不同参膜下人参叶片的气孔导度

Fig. 2 Stomatal conductance of ginseng leaves under

different ginseng films

图3　不同参膜下人参叶片胞间CO2浓度

Fig. 3 Intercellular CO2 concentration of ginseng leaves

under different ginseng films

图4　不同参膜下人参的总产量和总平均产量

Fig. 4 Total yield and total average yield of ginseng under different ginseng films

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