文献解读：转录因子CmbHLH16在不同光照条件下调控菊花花瓣花青素稳态
一、研究背景
植物对光照条件的响应是其适应环境的关键机制之一。光照不仅影响植物的生长和发育，还对植物的代谢过程起到调控作用。特别是在光信号的作用下，植物能够调节花青素等次生代谢产物的积累，以应对外界的环境压力。花青素不仅是植物花朵颜色的重要决定因素，还在抗氧化、抗UV辐射等方面具有重要生理功能。因此，研究植物如何在不同光照条件下调控花青素的合成和积累，不仅有助于理解植物光适应的机制，还为植物育种提供了重要的理论支持。
二、研究目的
该研究旨在探讨菊花在不同红光/远红光比例下，如何通过转录因子CmbHLH16调控花青素的稳态。特别是，研究关注在低红光/远红光比和高红光/远红光比条件下，菊花的花青素含量如何受到调控，以及背后的分子机制。
三、研究方法
1. **实验材料**：选用了菊花“南农粉翠”品种，作为实验材料，以确保实验结果的稳定性和重复性。
2. **光照处理**：实验设计了三种光照条件：白光（R/FR比约为1.09）、低R/FR比（约为0.22）和高R/FR比（约为7.18），模拟不同的自然光照环境。
3. **花青素含量测定**：通过光谱分析法测定不同光照条件下菊花花瓣中花青素的积累量。
4. **基因表达分析**：利用RT-qPCR技术，检测与花青素合成相关的结构基因（如CmCHS、CmCHI等）和调控基因（如CmMYB6、CmbHLH2、CmbHLH16等）的表达变化。
5. **蛋白质稳定性分析**：通过Western blot方法检测关键转录因子在不同光照条件下的蛋白质稳定性。
四、研究结果
1. **光照条件对花青素积累的影响**：
- 在低R/FR比下，菊花花瓣的花青素含量显著减少，表明低R/FR比抑制了花青素的合成。
- 在高R/FR比条件下，菊花花瓣的花青素含量显著增加，说明高R/FR比促进了花青素的合成。
- 这些结果与之前的研究一致，表明红光/远红光比例是影响花青素积累的重要环境因素。
2. **相关基因表达的调控**：
- 低R/FR比诱导了转录因子CmMYB4的表达，CmMYB4通过与CmTPL形成复合体，抑制了花青素合成相关基因的表达，如CmbHLH2。这导致了花青素合成的减少。
- CmbHLH16在低R/FR比条件下的表达受到抑制，无法有效干扰CmMYB4-CmTPL复合体的形成，从而进一步抑制花青素的合成。
- 在高R/FR比条件下，CmbHLH16的表达被上调，CmbHLH16通过与CmMYB4竞争性结合，阻止了CmMYB4-CmTPL复合体的形成，从而解除对CmbHLH2的抑制，促进了花青素的合成和积累。
3. **蛋白质稳定性分析**：
- 研究还表明，CmMYB6和CmbHLH2的蛋白质稳定性并未受到不同光照条件的显著影响，这意味着它们的表达调控主要发生在转录水平，而非蛋白质降解水平。
五、结论与讨论
研究结果揭示了在不同光照条件下，菊花通过转录因子CmbHLH16调控花青素稳态的机制。在低R/FR比条件下，CmMYB4通过与CmTPL结合抑制了花青素合成，而CmbHLH16的抑制作用进一步加强了这一过程；在高R/FR比条件下，CmbHLH16通过阻止CmMYB4-CmTPL复合体的形成，解除对CmbHLH2的抑制，从而促进了花青素的合成。
六、研究的意义与展望
该研究为理解光信号如何通过转录因子调控植物次生代谢提供了新的见解，特别是在非模式植物菊花中的应用。这不仅有助于揭示光适应机制，还为通过调控光照条件改良菊花的观赏特性提供了理论支持。未来的研究可以进一步探讨CmbHLH16的作用机制，尤其是其在不同环境条件下的功能多样性，以及在其他植物中的应用潜力。
通过这些详细的分析，可以深入理解该文献的研究内容、方法和科学意义，为后续相关研究提供参考。
Figure 2展示了低红光/远红光（R/FR）比率如何通过诱导转录因子CmMYB4抑制CmbHLH2，从而负向调控花青素的生物合成。这个图由五个子图组成，每个子图分别展示了不同实验方法下的结果：
A. ChIP-PCR实验结果
- 该子图显示了在CmbHLH2启动子上，CmMYB4结合的DNA片段的富集情况。选取了两个特定位点（AC-II元素），分别是从 -1702 到 -1695 bp 和从 -859 到 -852 bp 的片段。另一个位点（-1328 到 -1193 bp）作为对照。
- 实验结果表明，CmMYB4在这两个AC-II元素位置上富集，表明CmMYB4直接结合CmbHLH2的启动子来调控其表达。
B. 酵母单杂交实验
- 此子图展示了CmMYB4与CmbHLH2启动子及其突变体CmbHLH2pro(mut)在酵母细胞中的相互作用。pGADT7-GUS被用作阴性对照。
- 酵母生长在缺乏Trp、His、Leu的合成缺失培养基（SD/-T/-H/-L）上，同时使用80 mM 3-AT作为选择性抑制剂。
- 结果显示，CmMYB4能够与CmbHLH2启动子发生相互作用，而对突变启动子CmbHLH2pro(mut)的结合能力显著降低，说明CmMYB4对CmbHLH2的调控具有序列特异性。
C. EMSA实验
- 电泳迁移率变动实验（EMSA）显示了CmMYB4与标记的CmbHLH2启动子AC-II元件DNA探针的相互作用。His蛋白作为阴性对照。
- 当加入未标记的野生型（WT）探针作为竞争对手时，CmMYB4与标记探针的结合减少，说明CmMYB4特异性地与AC-II元件结合。
- 与突变型（MT）探针的结合能力相比，野生型探针的结合能力更强，进一步证实了CmMYB4对特定序列的高亲和力。
D. 基因瞬时过表达和抑制实验的花朵表型
- 该子图展示了在植物中瞬时过表达或抑制图中所标注基因后，花朵颜色的变化。
- 图中的刻度尺为1 cm。结果表明，CmMYB4的过表达抑制了花青素的积累，导致花朵颜色变浅，而抑制CmMYB4表达则增强了花青素积累，花朵颜色变深。
E. 花青素含量测定
- 该子图展示了射线花瓣中花青素含量的测定结果。误差棒表示三次生物重复的标准差。
- 使用不同字母标注的样本表示它们之间有显著性差异（P ≤ 0.01, ANOVA, Tukey’s校正）。
- 结果显示，CmMYB4的过表达显著降低了花青素的含量，而抑制CmMYB4的表达则显著提高了花青素的含量。
Figure 3 展示了CmMYB4与CmTPL的相互作用，如何通过影响CmbHLH2的组蛋白H3乙酰化水平来抑制花青素生物合成的分子机制。该图包含五个子图，每个子图分别揭示了不同实验中的关键发现。
A. 组蛋白H3乙酰化水平的ChIP qPCR分析
- **实验内容**：该子图展示了在转基因花射线花瓣中，CmbHLH2转录起始位点（TSS）处组蛋白H3乙酰化水平的变化。ChIP qPCR分析用于量化这一乙酰化水平，空载体pSAK277被用作对照。
- **结果解读**：结果表明，与对照相比，CmMYB4的表达显著降低了CmbHLH2 TSS处的组蛋白H3乙酰化水平。这表明CmMYB4可能通过与CmTPL相互作用，降低了CmbHLH2的乙酰化水平，从而抑制了其基因的转录活性。误差棒表示三次生物重复的标准差，显著性差异用星号表示（**P ≤ 0.01，ANOVA，Tukey’s校正）。
B. LUC/Renilla活性比率分析
- **实验内容**：此子图展示了LUC对Renilla（REN）活性比率的测定，这是通过双荧光素酶报告基因分析（Dual-Luciferase Assay）完成的。
- **结果解读**：CmMYB4表达显著降低了LUC/REN的活性比率，表明CmMYB4能够通过抑制CmbHLH2的启动子活性来降低其转录水平。六次生物重复的标准差以误差棒表示，显著性差异用星号表示（**P ≤ 0.01，ANOVA，Tukey’s校正）。
C. CmMYB4和CmTPL在酵母细胞中的相互作用
- **实验内容**：该子图展示了CmMYB4或其突变体CmMYB4mEAR与CmTPL在酵母细胞中的相互作用。CmMYB4mEAR是CmMYB4的一个突变体，其中EAR基序的核心Leu残基被替换为Ala残基，以检测该区域对蛋白质相互作用的影响。
- **结果解读**：在酵母双杂交实验中，CmMYB4能够与CmTPL相互作用，而CmMYB4mEAR由于关键残基的突变，几乎失去了与CmTPL的相互作用能力。这表明CmMYB4的EAR基序在与CmTPL的结合中起着至关重要的作用。
D. CmMYB4和CmTPL在pull down实验中的相互作用
- **实验内容**：此子图展示了CmMYB4或CmMYB4mEAR与CmTPL在体外拉下实验中的相互作用。GST标签蛋白被用作阴性对照，拉下实验用于验证在体外条件下两种蛋白质之间的直接相互作用。
- **结果解读**：结果显示，CmMYB4能够有效拉下CmTPL蛋白，而CmMYB4mEAR由于EAR基序的突变，拉下效率显著降低。这一结果进一步确认了EAR基序在CmMYB4与CmTPL结合中的关键作用。
E. BiFC实验中的CmMYB4和CmTPL相互作用
- **实验内容**：该子图展示了双分子荧光互补实验（BiFC）中CmMYB4或CmMYB4mEAR与CmTPL的相互作用。BiFC是一种用来研究活细胞中蛋白质相互作用的实验技术。空载体pSPYCE和pSPYNE被用作阴性对照，mRFP-NLS为核标记，YFP通道用于观察黄荧光信号。
- **结果解读**：在CmMYB4和CmTPL共同表达的细胞中，检测到了显著的YFP荧光信号，表明这两种蛋白质在细胞核中相互作用。然而，在CmMYB4mEAR与CmTPL共表达的细胞中，YFP信号显著减弱，表明突变后的CmMYB4无法有效与CmTPL结合。这进一步证明了EAR基序在CmMYB4与CmTPL相互作用中的重要性。
Figure 5展示了CmbHLH16与CmMYB4的相互作用如何破坏CmMYB4–CmTPL蛋白复合物的稳定性，从而调节菊花花青素合成过程。这个图由六个子图组成，每个子图分别揭示了在不同实验条件下的重要发现。
A. 不同光照条件下CmbHLH16在射线花瓣中的相对表达
- **实验内容**：该子图展示了野生型植物在不同光照条件下，射线花瓣中CmbHLH16基因的相对表达水平。CmEF1a和CmActin作为内参基因。
B. CmMYB4或CmTPL与CmbHLH16在酵母双杂交的相互作用
C. CmMYB4与CmbHLH16在pulldown实验中的相互作用
D. BiFC实验中的CmMYB4与CmbHLH16相互作用
E. CmbHLH16在酵母三杂竞争性地与CmTPL争夺与CmMYB4的结合
- **实验内容**：此子图展示了CmbHLH16在酵母细胞中竞争性地与CmTPL争夺与CmMYB4结合的实验结果。Met代表蛋氨酸（Methionine）。
- **结果解读**：实验结果表明，CmbHLH16能够有效竞争CmTPL与CmMYB4的结合，这表明CmbHLH16可能通过破坏CmMYB4–CmTPL复合物的稳定性来调节花青素合成。
F. CmTPL和CmbHLH16对CmMYB4的竞争性结合实验
- **实验内容**：此子图展示了CmTPL和CmbHLH16对CmMYB4的竞争性结合实验结果，反应体系中逐步增加His-CmbHLH16的浓度以观察其竞争效果。
- **结果解读**：随着His-CmbHLH16的加入量增加，CmTPL与CmMYB4的结合逐渐被CmbHLH16取代。这一实验结果进一步确认了CmbHLH16能够竞争性地干扰CmMYB4与CmTPL的相互作用。
原文链接：ps://doi.org/10.1093/plphys/kiac342
相关知识
一种新型转录因子CmMYB012抑制高温下菊花黄酮和花青素的生物合成
光调控花青素苷合成及呈色的机理
光照调节菊花花青素合成的分子机理
文献解读（一）：植物基因组文献
植物花青素合成与调控研究进展
光照对月季‘光谱’花青素合成及其 CHS 和 DFR 基因表达的影响
垂花百合花色变异机制的转录组学分析
光照对菊花花青素苷合成与呈色的作用
菊花花部类胡萝卜素差异积累的转录调控机制
特别推荐 | 一文解析调控花青素合成的R2R3-MYB基因研究发展
网址: 文献解读：转录因子CmbHLH16在不同光照条件下调控菊花花瓣花青素稳态 https://m.huajiangbk.com/newsview732801.html
| 上一篇: 食用菌栽培学课程论文专业理论.d |
下一篇: 为什么多数花要散光照射 |
