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光可控的基因表达系统的制作方法

花匠小妙招
2024-08-29 11:03

专利名称：光可控的基因表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的遗传工程或合成生物学领域。具体的说，本发明涉及基因表达领域。更具体的说，本发明涉及新的基于光调控蛋白的可诱导基因表达系统和采用该表达系统调控宿主细胞中基因表达的方法。
背景技术：
在遗传工程领域，准确控制基因的表达可为研究和控制发育及其他生理过程提供有价值的工具。基因表达是复杂的生物学过程，包括许多蛋白-蛋白之间的特异性相互作用。基因表达的第一步是DNA转录为RNA，须将转录因子递送到控制基因转录的启动子附近。转录因子，也称为序列特异性DNA结合蛋白，是一种能够特异性结合启动子DNA序列导致下游基因DNA序列转录成RNA的蛋白质。转录因子可以是单一蛋白质或蛋白质复合体，它与启动子的识别/结合能启动或阻止RNA聚合酶将DNA转录为RNA，可分为转录激活因子或转录阻遏因子。通常，转录因子至少含一个DNA结合结构域，并能募集协同因子(或称辅激活蛋白)共同作用而结合启动子区的正确位点从而启动基因转录。转录因子除含DNA结合结构域外一般还含转录激活结构域或转录阻遏结构域，转录激活结构域可相距DNA结合域适当距离。传统的转基因方法采用通用性或细胞类型特异性启动子启动转基因的转录表达。用含目的基因和相应启动子的DNA构建物(也称为靶转录元件)转染宿主细胞进入细胞质或整合到宿主细胞基因组中，当加入相应的转录因子与启动子结合后，即可引发目的基因在给定细胞类型中转录然后翻译表达为相应的蛋白质。调节外源基因在细胞中转录表达的另一种方法是采用可诱导型启动子。这种可诱导型启动子具体包括两大类(I)化学物质可诱导的启动子和基因表达系统，和
(2)物理方法可诱导的启动子和基因表达系统。化学诱导物质包括小分子药物，其典型的例子是抗生素如四环素[Gossen, M.和H. Bujard等，Proc Natl Acad Sci USA,1992. 89(12) :5547-5551 ；Gossen, M 等，Science, 1995. 268(5218) :1766-1769]和链霉素[Fussenegger,M.等.,NatBiotechnol, 2000. 18(11) 1203-1208.];激素[Wang, Y.等.，Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91 (17) :8180-8184]及其类似物；金属离子(典型的例子是铜离子)[Mullick, A.等，BMCBiotechnol, 2006. 6 :43.]及其他诱导物如乙醒[Weber,W.等.Nat Biotechnol, 2004. 22(11) :1440-1444. ;Weber，W.，等，Metab Eng, 2005. 7 (3)174-181.]。物理方法可诱导的启动子和基因表达系统主要包括，紫外线(UV)调控的“囚笼(caged) ”技术[Keyes,ff. M.和 A. A. Mills, Trends Biotechnol, 2003. 21 (2) :53-55.];远红外光控制热激效应介导的基因表达系统[Kamei，Y.等,Nat Methods, 2009. 6 (I) :79-81.]。以上方法中化学物质可诱导的启动子和基因表达系统虽已获得较广泛应用，但存在一些缺点，如(1) 一些诱导物具有多效性，会影响其它内源基因的表达，从而使结果分析复杂化。如重金属离子诱导的基因表达系统，重金属离子不仅能诱导目的基因表达，还会引起细胞内其它重金属离子诱导的基因的表达；(2) —些诱导物有潜在毒性从而影响其它基因的功能，例如重金属离子对细胞有毒性，因而不能用于动物或人体；(3)许多启动子体系在非诱导状态下启动表达的活性很高，不能彻底关闭被调节基因，加入诱导剂前后的基因表达量比值(本文中也称为诱导表达倍数)较低，如激素表达系统[Wang，Y.等.，ProcNatl Acad Sci U S A，1994. 91(17) :8180-8184]，这类启动子体系不适合用于表达毒性基因以及低表达量即可引起显著生物学效应的基因；(4)有些化学物质所诱导的基因表达系统的转录因子由两种或两种以上蛋白质共同构成，例如基于FKBP-FRAP的基因表达系统[Rivera, V. M.等，Nat Med, 1996. 2 (9) :1028-1032.]，其转录因子由两种融合蛋白构成，导入细胞两种不同蛋白的基因构建物比导入一种蛋白基因构建物困难更大或导入效率差；
(5)化学诱导物只能在时间上调节基因的表达，不能在空间上特异性调控某些细胞及组织的基因表达。而如上所述，现有的大部分物理方法可诱导的基因表达系统对细胞的毒性高，如UV诱导的囚笼技术可能造成对细胞的不可逆性损伤；或远红外激光控制热激效应的诱导表达系统可能激活其他内源基因的表达，其设备操作复杂且昂贵[Kamei，Y.等，NatMethods,2009. 6(I) :79-81.]。然而，光是一种易于时间和空间操作的诱导物，一般对细胞无上述毒性，可采用的方法是把远源进化物种的光可调节蛋白(也称为光敏蛋白)引入高等真核细胞内，将它们改造成为光调节的转录因子，便于光照调控目的基因的表达。预期这些蛋白质不会干扰真核细胞的生理过程，在真核细胞中不会引起多重效应或非特异效果。目前这方面的报道很少。Shimizu-Sato等人报道了适用于酵母细胞的光控基因表达系统[Shimizu-Sato,S 等，NatBiotechnol，2002. 20(10) : 1041-1044.]、美国专利 US6858429 叙述了通过基因工程技术将植物蛋白(植物色素phytochrome，简写为Phy)和植物色素相互作用因子(phytochromeinteracting factor,简写为PIF3)分别与双杂交系统的酵母菌Gal4蛋白的DNA结合结构域或Gal4的转录激活结构域(GAD)相连，构成Gal4_Phy和PIF3-GAD两种融合蛋白，当用红光照射时Gal4-Phy与PIF3-GAD两个融合蛋白分子相互作用而结合，其中Gal4的转录激活结构域(AD)被带到启动子附件从而启动下游基因转录；而用远红外光刺激可使相互作用的这两种融合蛋白解离，其中Gal4的AD不再结合于启动子从而终止下游基因的转录。虽然这个光诱导的启动子系统具有可逆性、诱导表达水平较高等优点，但其缺点是植物色素Phy需在其生色团藻青素(Phycocyanobilin)存在下才能与PIF3相互作用，而酵母细胞及哺乳动物细胞不含这种物质，必需外源加入宿主细胞中；而且此系统基于双杂交原理，转录因子由两种完整融合蛋白共同构成，操作复杂。而且其基因构建物较大导入细胞相对困难，限制了此系统的广泛应用。目前已知的其它光敏蛋白还有以黄素类物质为生色团的光敏蛋白(亦称为黄素蛋白家族蓝光受体)，分为三类一是含光-氧-电压(light-oxygen-voltage, L0V)结构域的光受体蛋白，如光敏色素；二是类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-likecryptochromes);第三类是近些年来才发现的利用FAD的蓝光蛋白(blue light usingFAD, BLUF)。光敏色素是含LOV结构域的光受体蛋白质最多的一类，研究较多的有向光素 I (phototropin I)、白领-I (WC-I)、白领-2 (WC-2)、PYP (光敏黄色蛋白，photoactive yellow protein)、Phy3、VIVID等。光敏色素通常是膜偶联激酶蛋白，在蓝光照射下发生自磷酸化改变激酶活性而调控相关的生理过程。大多数光敏色素的C端为丝氨酸/苏氨酸激酶结构域N端为结合黄素分子的两个LOV结构域，蓝光照射时LOV结构域与黄素分子共价结合生成黄素-半胱酰胺加成产物引起黄素结合口袋空间构象变化，导致C端激酶结构域改变其激酶活性，但此过程完全可逆。此外，两个LOV结构域中，L0V2光敏性比LOVl更高。Masayuki Yazawa 等利用拟南芥的 FKFl (flavin-binding, kelch repeat, fbox I)与GI (GIGANTEA)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用的原理，将FKFl和GI分别与双杂交系统酵母菌Gal4的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒颗粒蛋白16(VP16)的转录激活结构域(AD)相连，组成 Gal4_FKFl 和 VP16-GI 双转录因子[Yazawa, M.,等,NatBiotechnol,2009. 27(10) :941-945. ] Gal4_FKFl因其中的Gal4含有DNA结合结构域可先结合启动子但单独不能启动转录，用蓝光刺激时VP16-GI即与Gal4-FKF1相互作用(具体是FKFl与GI相互作用)方才启动下游基因转录。这个系统的缺点是FKFl和GI蛋白基因构建物较大导入细胞较难和诱导目的蛋白表达提高的倍数较低，最高仅为5倍左右。来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的隐花色素是第一个被分离得到的植物蓝光光敏蛋白，研究比较多的有隐花色素 I (Cryptochromes I, CRYI)、隐花色素 2 (Cryptochromes 2, CRY2)、光敏色素A (phytochrome A, phyA)和光敏色素B (phytochrome B, phyB)等,主要功能是接受昼夜节律光调节高等植物的生长和运动。隐花色素的氨基酸序列和生色团组成与光裂解蛋白很相似，多数隐花色素的大小为70kD-80kD，包含相对保守的N端PHR(光裂酶相关)结构域和长度差异较大的C端未知结构域，其PHR结构域可非共价结合黄素。有研究利用拟南芥CRY2(隐花色素2)与CIBl (隐花色素2相互作用的螺旋环螺旋I)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用，将CRY2和CIBl分别与双杂交系统的酵母菌Gal4的DNA结合结构域和Gal4的转录激活结构域(GAD)相连，组成Gal4_CRY2和CIBl-GAD双转录因子，用蓝光刺激时CIBl-GAD与已与Gal4反应元件结合的Gal4_CRY2相互作用(具体是CRY2与CIBl相互作用)在酵母细胞中可启动下游基因表达[Kennedy,M. J.，等.，Nat Methods, 2010. 7 (12)973-975]。该系统无需加入外源生色团，但此系统也是基于双杂交原理，转录因子由两种完整融合蛋白共同构成，操作复杂。而且在非诱导状态下目的基因也有一定的表达，因而应用有限。包含BLUF结构域的蓝光受体蛋白和包含LOV结构域的光受体蛋白与隐花色素不同的是，前者光照激活后不会与黄素生色团反应生成共价产物，而是导致生色团构象变化引起黄色吸收光发生IOnm红移。包含BLUF结构域的光受体蛋白研究最多的是AppA，它是球状红杆菌(Rhodobactersphaeroides)的一种转录抗阻遏蛋白，黑暗时AppA与细胞中的一种PpsR转录因子结合形成AppA-PpsR2复合物，使PpsR不能结合DNA ;强蓝光照射可使AppA从复复合物上解离而释放PpsR形成四聚体结合于特定DNA序列导致阻遏相关基因的转录。如上所述，目前已有的广泛用于生命科学领域的基因表达系统大多数采用化学诱导剂调控，虽然其诱导效果较好，背景低、表达强度高，但缺点是许多系统具有多效性因而副作用广泛和有潜在的细胞毒性等。更为重要的是，化学诱导剂不能在空间上精确调控基因的表达；而物理方法调节基因表达的系统目前很少，虽能在空间上一定程度调控特定细胞或组织的基因表达，但细胞毒性强可能造成不可逆损伤或实际的操作困难。少数几种基于光敏蛋白的基因表达系统，由于诱导目的蛋白表达水平低、需要加入外源化学物质、转录因子由多种蛋白构成其基因构建物较大难以导入细胞等原因限制了其应用。本申请人认为可以通过新思路创造出一种新的，更优秀的光调控转录表达系统。这个系统可以克服前人研究的缺陷，并可被广泛用于生物医药科学与技术研究中。经过潜心研究，本申请人发明了一种新型的光可控基因表达系统，它由重组光敏转录因子及其对应的靶转录单元两部分组成，具有良好的基因表达调控能力，可以在时间和空间上共同调控基因的表达。因此，本发明的第一个目的是提供一种新型的光可控基因表达系统。本发明的第二个目的是提供用所述光可控基因表达系统调节宿主细胞中基因表达的方法。本发明的第三个目的是提供含有所述光可控基因表达系统的真核表达载体。本发明的第四个目的是提供装有所述光可控基因表达系统各组分的试剂盒。发明概述
本发明涉及一种光可控基因表达系统，包括两个部分a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽；b)靶转录单元，包括识别/结合所述第一多肽的至少一个反应元件、与之连接的启动子和待转录核酸序列。按照本发明的光可控基因表达系统，第一部分中重组光敏转录因子的第一多肽为DNA结合结构域,它能够特异性地识别反应元件,单独不能够结合到反应元件上或者是结合能力很弱，需要第二多肽来辅助其结合到反应元件。第一多肽可选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3 DNA结合结构域。第二多肽为光敏结构域，通常来自以黄素类为生色团的光敏蛋白；第三多肽为转录调节结构域，包括转录激活结构域和转录阻遏结构域。第一多肽、第二多肽和第三多肽之间可以直接连接，也可操作性地通过接头肽连接。接头肽的氨基酸个数是可变的(如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更多)。第一多肽、第二多肽可构成一种光可控的DNA结合蛋白融合蛋白(简称为光可控DNA结合蛋白)，可以用于体外研究重组光敏转录因子的DNA结合特点。本发明的光可控基因表达系统中，第二部分靶转录单元中的反应元件、启动子和待转录核酸序列之间也可直接连接，或操作性连接。按照本发明的光可控基因表达系统，第一部分中的重组光敏转录因子还可进一步包含附加的多肽，如促进重组光敏转录因子融合蛋白向细胞核运输的第四多肽(即细胞核定位信号肽)。第四多肽与第一、第二、第三多肽可直接连接或通过接头肽连接。本发明还涉及含有本发明的光可控基因表达系统的真核表达载体。所述表达载体可以是单独含有重组光敏转录因子编码基因的载体，也可以是单独含有靶转录单元的真核表达载体，所述祀转录单元中含有反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺。或者,也可以是同时含有重组光敏转录因子编码基因和靶转录单元中的反应元件-启动子的真核表达载体。本发明也涉及用本发明的光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括以下步骤a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中；b)引入含被调控基因的宿主细胞；和c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。本发明的在宿主细胞中调控基因表达的方法，所涉及的光照方法，包括光源的选择和光源的控制。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光；光照方法包括光照量、光照时间、光照强度及光照频率的选定。用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。本发明进一步涉及一种试剂盒，该试剂盒装有含本发明光可控基因表达系统的真核表达载体或/和转染了所述转录因子的真核表达载体的哺乳动物细胞，及相应的说明书。本发明的试剂盒还可装有含反应元件-启动子、但待转录核酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。发明详述本发明提供一种基于光敏多肽的、光可控基因表达系统，用于在时间和空间上调节目的基因在真核生物宿主细胞中的表达。本发明的光可控基因表达系统涉及至少两个部分第一部分是能够在宿主细胞中表达的重组光敏转录因子融合蛋白的编码核苷酸序列，该融合蛋白由三个或四个多肽组成，其中第一多肽是其DNA结合结构域，第二多肽为光敏结构域，第三多肽为转录调节结构域，第四多肽为核定位信号片段；第二部分是由反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的祀转录单元核苷酸序列，其中的反应元件为上述重组光敏转录因子融合蛋白第一多肽所识别/结合的DNA核苷酸基序，启动子通常为最小启动子，也可以是其他完整的启动子。第一部分的三个或四个多肽优选采用有关蛋白的截短的功能活性片段(即结构域)。可通过基因工程技术将本发明的光可控基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个真核表达载体中或分别构建在二个真核表达载体中。针对特定的宿主细胞类型采用不同的常规方法将其导入宿主细胞，使之表达本发明的重组光敏转录因子融合蛋白，用适当波长的光照射可导致其第二光敏多肽二聚化能力改变，使重组光敏转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子可结合于本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列中的反应元件，并通过该融合蛋白的第三多肽的转录激活/阻遏结构域和募集的宿主细胞本身的其它转录辅因子，一起协同作用于该靶转录单元中的启动子，从而调节(启动或阻遏)目的基因的转录和表达。本发明提供的这种光可控基因表达系统，可利用几乎不会损伤细胞或机体的光照射，在时间上和空间上调节目的蛋白基因在真核宿主细胞中的表达。本发明的这种光可控基因表达系统，可利用不同的光源和光照条件在空间上调节目的蛋白基因在真核宿主细胞中的表达。所用的光廉价、易于获得、对细胞没有毒性。本文所用术语的定义和解释“光可控”，“光敏”和“光诱导”的蛋白在本文中含义相同，可互换使用，指对光照敏感的、可用相应波长的光以不同强度或不同频率照射，调节该蛋白的构象或构型从而影响其活性，包括激活、增强或阻遏其活性。“宿主”指真核生物，包括单细胞真核生物如酵母菌，和多细胞真核生物，如植物和动物，尤其是哺乳动物，包括人。“宿主细胞”指构成真核生物组织的细胞和已建立的真核生物细胞系，只要这些细胞或细胞系与待表达的目的蛋白质、所用的筛选体系或发酵培养体系相容。包括单细胞真核生物细胞，如培养的BY4741和AH109酿酒酵母菌细胞、裂殖酵母菌、P. pastoris酵母菌、乳酸克雷伯氏菌、H. polymorpha菌(其综述见Fleer等人Curr Opin Biotechnol,1992.3(5) :486-496和真菌细胞。已建立的可体外传代培养永生不死的哺乳动物细胞系，其非限制性的例子包括人胚肾上皮细胞(HEK293)、非洲绿猴肾成纤维细胞C0S-7、人宫颈癌细胞(Hela)、小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)等。宿主细胞也包括正常细胞，如出于基因治疗目的离体转基因或同源重组的动物胚胎细胞，对基因治疗目的有特殊价值的细胞类型，包括造血干细胞、成骨细胞、肝细胞、白细胞、神经元细胞和皮肤上皮及气管上皮细胞；离体转基因或同源重组的动物胚胎干细胞和受精卵细胞。。宿主细胞还包括非哺乳动物的真核细胞，如昆虫(例如Sp. frugiperda)细胞，和植物细胞，如；转基因植物细胞。所谓转基因细胞包括转入了本发明重组光敏转录因子基因和/或含目的蛋白基因的靶转录单元的细胞，本发明的重组光敏转录因子通过可控的光照射能很好地调节目的基因在这些细胞中的表达。在昆虫细胞中的表达可采用杆状病毒表达载体(见例如0' Reilly等人(1992)《杆状病毒表达载体实验手册》，Stockton出版社)，可用的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith，G. E.，M. D. Summers，和 M. J. Fraser，Mol Cell Biol, 1983. 3(12) :2156-2165)和 pVL 系列((Luckow, V. A.和 M. D. Summers, Virology, 1989. 170 (I) :31-39)。
“目的蛋白”也可称为“感兴趣蛋白”指任何有用的蛋白，例如可用于预防或治疗目的或其他用途的、需要在真核宿主细胞中表达的有用真核生物蛋白质，包括天然的或人工修饰或突变的有用蛋白质，特别是必须经翻译后修饰(如糖基化、酰胺化等修饰)才有活性的蛋白质，它们在真核细胞中表达才能获得这种修饰。“报告蛋白”为目的蛋白的一种，指其表达容易被检测的有用蛋白质。为便于检测本发明基于光敏多肽的、光可诱导的目的蛋白基因表达系统的效果，可以选择以下已知的广泛应用的报告蛋白萤火虫荧光素酶(Flue)、绿色荧光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)、￠-半乳糖苷酶(LacZ)等。但本发明的光可诱导目的蛋白基因表达系统不限于表达报告蛋白，而可用于表达任何有用的目的蛋白。“基因”，蛋白质的“编码核苷酸序列”，“待转录核苷酸序列”在本文中含义相同可互换使用，指天然或重组的携带蛋白质氨基酸序列信息密码子的DNA序列，也指编码功能性RNA，如反义RNA的DNA序列。“目的蛋白基因”、“目的蛋白的编码核苷酸序列”或简称为“目的基因”在本文中含义相同，可互换使用，指编码目的蛋白的基因，通常为脱氧核糖核酸DNA双链序列。这种基因可包含在宿主细胞的染色体DNA序列中或包含在人工构建的表达载体中，如本发明的靶转录单元序列中。同样，“报告基因”指编码报告蛋白的基因。“转录”在本文中专指真核生物宿主细胞中通过RNA聚合酶将目的基因转录产生携带该基因信息RNA的过程。真核生物基因的转录比原核生物复杂得多，真核生物的三类RNA聚合酶I、II和III分别转录三类真核基因DNA，产生三类RNA(rRNA、mRNA、tRNA)及反义RNA。文中的转录因子调节的转录过程为RNA聚合酶II启动的转录，即DNA转录为mRNA。“转录调节”本文指真核基因转录的调节，包括启动或阻遏转录，增强或抑制转录，上调或下调转录。“表达”、“目的蛋白基因表达”、“基因表达”在本文中含义相同可互换使用，指目的基因的DNA序列转录产生携带该基因信息的RNA(mRNA或反义RNA)和该RNA携带的信息在核糖体中被翻译产生目的蛋白二者，即转录产生信息RNA和翻译产生目的蛋白都叫做表达。本文包括这二种含义，主要指产生目的蛋白。“转录因子”或“转录因子融合蛋白”在本文中含义相同可互换使用，指真核生物的转录因子，它不是一个蛋白质，而是多个相互作用的蛋白或多肽的统称，可以是天然的或人工改造的或人为融合的，包括能识别/结合靶转录单元核苷酸序列中的反应元件的多肽和能募集其它转录激活/阻遏辅因子的多肽，通过与靶转录单元中反应元件的结合和相互作用，与募集的其它转录激活或阻遏辅因子一起作用于待转录核酸序列上游的启动子，从而启动并调节目的蛋白基因的转录。转录因子视其组成的不同可分为“转录激活因子”或“转录阻遏因子”，二者统称“转录因子”。
“靶转录单元”指人造的由反应元件、启动子和待转录核酸序列组成的DNA序列(不是蛋白质)，其中反应元件通常位于启动子上游，有时也可位于启动子下游，待转录核酸序列位于反应元件和启动子的下游，三者可直接相连或操作性(即可隔开若干个核苷酸)相连。“反应元件”指转录因子特异性识别/结合的一个或多个顺式DNA基序，不同的转录因子有与其相对应的不同的反应元件，转录因子包含能与这种DNA基序结合的结合结构域。当转录因子与其相对应的反应元件特异性结合后，转录因子的第三多肽募集的辅因子协同作用于启动子，激活或阻遏其下游目的基因转录产生相应的RNA。在本发明中，反应元件指能够与重组光敏转录因子的第一多肽特异性识别/结合的DNA基序，例如Gal4的反应元件为长17bp的DNA基序(序列67)。“启动子”指启动和导致其下游基因转录产生RNA的DNA序列。启动子可以是天然基因的启动子或人工修饰的启动子。不同的启动子可指导基因在不同发育阶段的不同类型的组织或细胞中转录，或对不同环境或生理条件反应时的基因表达。启动子通常可分为“组成型启动子”、“可诱导启动子”或“可调控启动子”；按组织和细胞划分可分为“细胞特异性启动子”、“组织特异性启动子”、“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。可表达的天然细胞结构蛋白基因上游都有与其相配的启动子，不同的基因DNA片段可以有相同的启动子。可用于表达本发明重组光敏转录因子的常用组成型启动子的非限制性例子有来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒CMV和猿病毒40 (SV40)的启动子。可用于表达本发明重组光敏转录因子的组织特异性启动子的非限制例子还包括清蛋白启动子(肝特异性，Pinkert, C. A.等，Genes Dev, 1987. 1(3) :268-276),淋巴特异性启动子(Calame,K.和 S. Eaton, Adv Immunol, 1988. 43 :235-275.)，特别是 T 细胞受体的启动子(ffinoto,A.和 D. Baltimore, EMBO J, 1989. 8(3) :729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji, J.，L. Olson，和 W. Schaffner，Cell, 1983. 33(3) :729-740. ；Queen, C.和 D. Baltimore, Cell,1983. 33(3) :741-748)。神经元特异性启动子(例如，神经纤维启动子，Talbott, R. L.，etal. , Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(15) :5743-5747)，胰特异性启动子(Edlund,T.等.，Science, 1985. 230(4728) :912-916)和哺乳动物腺特异性启动子(例如，牛乳乳清启动子，美国专利4873316号)。发育调节的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel，M.和 P. Gruss, Science, 1990. 249(4967) :374-379)和 a -胎蛋白启动子(Camper, S. A.和 S. M. Tilghman, Genes Dev, 1989. 3 (4) :537-546)。多数真核基因转录起始点上游大约-25于-30位核苷酸处有富含AT的区域称为TATA盒，本文称为“最小启动子”，它确定了目的基因的转录起始位点，但本身不足以有效地启动基因转录。在TATA盒上游还有其它转录必须的核苷酸基序，即本文所述的转录因子其特异性识别/结合的反应元件，该反应元件被其相应的转录因子结合后向最小启动子传达反应性，并在转录因子募集的辅因子协同作用下激活最小启动子引起下游目的基因转录产生相应的RNA。
“载体”、“表达载体”、“基因表达载体”、“重组基因表达载体”或“质粒”在本文中含义相同可互换使用，指能在真核细胞中表达重组目的蛋白的载体，这种真核表达载体可以是人工构建的质粒或重组病毒载体“转染”指宿主细胞经物理或化学方法，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质转染胺或DEAE-葡聚糖介导的转染、DNA粒子轰击和显微注射等处理，使细胞摄入外源加入的携带基因的表达载体，或通过生物学媒介，如逆转录病毒载体、腺病毒载体、受体介导的DNA摄取等将携带基因的表达载体递送入宿主细胞中。这些载体进入宿主细胞后可作为游离体形式存在于胞质中，或整合入细胞染色体中，在适当条件下该细胞可瞬时表达或长期表达载体所携带的基因编码的蛋白质或功能性RNA。这种宿主细胞就叫做被载体转染的细胞。用表达载体转染宿主细胞的方法可参见Sambrooka等人(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社(1989))，和其它有关教材。本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统第一部分的重组光敏转录因子是由三种或四种功能性多肽片段直接通过肽键串联连接或通过接头肽串联连接形成的融合蛋白。在适当波长的光照射下，该融合蛋白能结合于本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列的反应元件，并通过其转录激活/阻遏结构域和募集宿主细胞本身的转录辅因子，一起协同作用于靶转录单元中的启动子，从而启动或阻遏靶转录单元中目的蛋白基因的表达。本文中，“重组光敏转录因子融合蛋白”与“重组光敏转录因子”含义相同，可互换使用。本发明的重组光敏转录因子含有第一多肽，该多肽虽能特异性识别所述靶转录单元核苷酸序列中的反应元件但不能与其结合或结合能力弱，只有在第二多肽的协助下转录因子发生同质二聚化后第一多肽方能结合反应元件；第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3 DNA结合结构域。分析相关文献，可用作本发明的第一多肽优选包括但不限于Gal4蛋白的DNA结合结构域、LexA蛋白的DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、噬菌体cl阻遏蛋白的DNA结合结构域、四环素阻遏蛋白TetR的DNA结合结构域、色氨酸阻遏蛋白TrpR的DNA结合结构域等，更优选Gal4的DNA结合结构域和LexA的DNA结合结构域。Gal4是酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的转录激活蛋白，能识别/结合基因启动子的上游反应元件-UAStj基序(序列67)。Gal4的N末端第1-94位氨基酸为DNA结合结构域，此DNA结合结构域是一种锌簇DNA结合结构域，其中第1-65位氨基酸用于DNA特异性识别，第66-94位氨基酸用于二聚化，Gal4需形成同质二聚体才能结合反应元件发挥其作用[Marmorstein, R.等.，Nature, 1992. 356 (6368)408-411]。基于Gal4/UAS的双杂交系统是用于研究基因表达的一种有效工具。例如，普洛麦格公司(Promega)公司生产的哺乳动物双杂交系统(CheckMate Mammalian Two-HybridSystem)就采用了此Gal4/UAS系统。LexA蛋白是存在于大肠杆菌细胞内的一种转录阻遏蛋白，能调控20多种基因的转录，它二聚化后能识别/结合基因启动子上游的反应元件(序列68)回文结构阻止RNA聚合酶对后面基因的转录。LexA含有202个氨基酸，其DNA结合结构域是一种翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，其中第1-87位氨基酸用于DNA特异性识别，第88-202位氨基酸用于二聚化，只有二聚化的LexA才能特异性结合相应的反应元件，单体LexA则不能。正常情况下细胞内存在的LexA是二聚体形式，当细胞受到内部或外部SOS信号刺激时，二聚化的LexA被体内某些酶切断分开并从DNA上解离，使得原来被LexA 阻遏的基因激活[Fogh，R.H.等,EMBO J, 1994. 13 (17)，3936-3944]。基于 LexA 的双杂交系统也被用于研究基因表达与蛋白质相互作用。例如，Clontech公司生产的酵母双杂交系统(MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System)就是基于此系统。Lac阻遏蛋白LacI能特异性识别/结合大肠杆菌乳糖系统操纵子而调节相关基因的转录。LacI的DNA结合结构域是一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，其中第1-62位氨基酸用于DNA的特异性识别，其特异性识别/结合的DNA保守序列见序列69，只有二聚化或者四聚化的LacI才能与之结合，单体 LacI 蛋白几乎不能结合[Lewis, M.等，Science, 1996. 271 (5253)，1247-1254]。 Cl蛋白是噬菌体Cl基因编码的一种转录阻遏蛋白，它可以阻止左、右两个早期起动子的转录导致不能进行复制及细胞分裂的蛋白。Cl蛋白含有236个氨基酸，其DNA结合结构域一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，第1-102位氨基酸用于DNA特异性识别，第132-236位氨基酸用二聚化，只有二聚化的Cl才能特异性结合相应的反应元件。Cl蛋白同质二聚体识别/结合匕和Pk两个操纵子序列上，每个操纵子各含有Cl三个识别结合位点，分为Pl的OLU 0L2和0L3以及Pe的ORU 0R2和0R3。cl与ORl的结合能力相对强些，ORl的保守DNA序列见序列71,单体cl蛋白几乎无这种结合能力[Burz, D. S. , Beckett, D.,Benson, N.，和 Ackers, G. K.，Biochemistry, 1994. 33 (28)，8399-8405, Hu, J. C. , 0' Shea,E. K.，Kim, P. S.和 Sauer, R. T.，Science, 1990. 250 (4986)，1400-1403]。四环素阻遏蛋白(TetR)是存在于很多革兰阴性菌中的一种转录因子，通过结合特定DNA基序阻遏相关基因的转录。TetR蛋白的DNA结合结构域是一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，单体TetR蛋白可形成同质二聚体而识别/结合含有特定DNA序列(序列70)的操纵子上，单体TetR几乎无结合能力[Wissmann, A 等，EMBO J, 1991. 10 (13)，4145-4152，Ramos, J. L.等，Microbiol Mol BiolRev,2005. 69(2),326-356] 在本发明一优选实施方式中，第一多肽为Gal4蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列I和序列2)的1-65位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为LexA蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列5和序列6)的1-87位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为LacI蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列9和序列10)的1-62位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为TetR蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列13和序列14)的1_63位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为Cl蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列17和序列18)的1-102位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。本发明重组光敏转录因子融合蛋白中的第二多肽是光敏多肽，该多肽来自以黄素类(FMN或FAD)为生色团的光敏结构域。如含有光-氧-电压(LOV)结构域的光敏蛋白；类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-like cryptochromes);利用？六0的蓝光蛋白(bluelight using FAD,BLUF)。优选含LOV结构域的光敏蛋白，经适当波长光照射后,第二多肽的二聚化能力发生改变，使转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子结合于相对应的反应元件，从而调节目的基因的表达水平。本发明包括但不限于以下所述的几种优选光敏蛋白或其功能活性截短体。本发明第一个优选的第二多肽是粗糙链孢霉菌的VIVID蛋白的光敏结构域及其突变体。VIVID是存在于粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)细胞内参与蓝光调控细胞信号传导通路的一种光敏蛋白质。在蓝光照射下它能与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，FlavinAdenine Dinucleotide)发生蛋白分子间反应形成二聚体。全长VIVID蛋白含有186个氨基酸，只含一个对光敏感的LOV结构域。研究表明VIVID蛋白缺失了 N端36个氨基酸的截短体蛋白(VIVID-36)稳定性比全长蛋白更好，而蓝光照射后形成的VIVID-36 二聚体不光照恢复其单体形式的半衰期为18000s，含点突变C71V的VIVID-36 二聚化能力更强。在本发明一优选实施方式中，第二多肽是含一个点突变的删除前1-36个氨基酸的 VIVID (C71V)、VIVID (N56K)、VIVID (Y50W)突变蛋白(核酸序列分别为23、25、29，氨基酸序列分别为24、26、30)。在本发明一个更优选实施方式中，第二多肽是含二个点突变的删除前1-36个氨基酸VIVID(N56K+C71V)突变蛋白(其核酸和蛋白质序列分别为序列27和序列 28)。本发明第二个优选的第二多肽是燕麦(Avena sativa)光敏色素I基因的L0V2结构域(简写为 AsL0V2) [Peter, E.，B. Dick, and S. A. Baeurle, Nat Commun, 2010. 1(8)122]。燕麦细胞光敏色素I的N端为LOVl和L0V2光氧电压(LOV)结构域，在蓝光照射下均能与黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)结合生成一种加成产物。本发明将燕麦光敏色素I的L0V2结构域连接于第一多肽，成功导致可用光照调控转录因子的第一多肽与对相应的反应元件的结合能力。本发明含有AsL0V2(其核酸和蛋白质序列分别为序列41和序列42)第二多肽的转录因子GALP在黑暗时可以结合其对应的反应元件导致目的基因表达，而在光照下这种结合减弱导致目的基因表达水平下调。本发明第三个优选的第二多肽是无隔藻(Stramenopile algae Vaucheriafrigida)金色素I (aureochromel)蛋白C端的LOV结构域(简写为AuLOV,其核酸和蛋白质序列分别为序列45和序列46) [Takahashi, F.等，Proc Natl Acad Sci USA,2007. 104(49) :19625-19630]。本发明含有AuLOV第二多肽的重组转录因子GAAP光照后二聚化能力增强使目的基因的表达水平上调。以上所述的第二光敏多肽中，VIVID和AuLOV用适当波长光照射可使由其构成的重组光敏转录因子二聚化增强，导致结合反应元件而启动或上调转录；而AsL0V2构成的重组光敏转录因子，在黑暗时二聚化而结合反应元件，光照反使其解二聚成为单体减弱与反应元件的结合或不再结合，从而阻遏或下调转录。对来自光敏蛋白的6种不同的LOV结构域进行用Accelry Discovery Studio 2.1进行同源性分析，这几种LOV结构域分别来自VIVID (Nc_VVD)、白领-I (Nc_ffcl)、FKFl (At_FKFI)、金色素 I (Vf_Aureol_L0V)、燕麦向光素 I (As_phot_L0Vl 和 As_phot_L0V2)。结果显示，这几种蛋白完全相同的氨基酸约为15%，具有相似性的序列约为36% (图47)。第一多肽和第二多肽可构成一种光可控的DNA结合蛋白融合蛋白(简称为DNA结合蛋白)。光可控的DNA结合蛋白可用于研究本发明各种重组光敏转录因子的DNA结合能力，尤其是在体外研究重组光敏转录因子的第一多肽和第二多肽构成的完整的具有DNA结合能力的DNA结合结构域及其结合特性的分析，例如结合常数、由二聚化恢复成单体的动力学等，优选出的DNA结合蛋白与第三多肽连接即可构成转录因子。在一个具体的实施方式中，光可控的DNA结合蛋白的第一多肽是Gal4 (1-65)，第二多肽是野生型VIVID-36，组成的融合蛋白Gal4-VIVID (WT)(简称为GAV (WT)，其核酸和氨基酸序列84和序列85)与VIVID蛋白的光谱性质相似、且DNA结合能力受光调控，光照前后DNA结合水平具有明显差异，即高浓度水平时黑暗状态的融合蛋白能结合探针、但结合能力弱；光照后在所用到的蛋白浓度范围内对探针都具有结合能力。本发明的重组光敏转录因子含有第三多肽，该多肽是一种转录调节结构域，可以是转录结构激活域(简写为AD)或转录结构阻遏域。可用作本发明第三多肽的转录结构激活域或转录结构阻遏域包括但不限于富含酸性氨基酸的转录激活结构域(如VP16和Gal4的AD)、富含脯氨酸的转录激活结构域(如CTF/NF1的氨基酸残基399-499)、富含丝氨酸/苏氨酸的转录激活结构域(如ITFl的氨基酸残基1-427)和富含谷氨酰胺的转录激活结构域(Octl的氨基酸残基175-269)，Seipel等公开了它们的氨基酸序列和其他有用的转录激活结构域[Seipel, K.，Georgiev, 0.和 Schaffner, ff.，EMBO J, 1992. 11(13)，4961-4968(1992)]。还有已报导了的Kruppel相关盒(KRAB)转录阻遏结构域[Peng，H.等，J Biol Chem, 2000. 275(24) :18000-18010]的序列。在本发明的实施方案中，第三多肽为VP16转录激活结构域(简写为VP16，其核酸和蛋白质序列分别为序列51和序列52)、Gal4转录激活结构域(简写为Gal4AD，其核酸和蛋白质序列分别为序列53和序列54))、通用控制蛋白(Gcn4)的转录激活结构域(其核苷酸和蛋白质序列分别为序列95和序列96)、NF- K B p65转录激活结构域(简写为p65AD，其核酸和蛋白质序列分别为序列49和序列50))，或锌指蛋白354A的KRAB转录阻遏结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列55和序列56)。NF-k B的二类亚基常形成同质或异质二聚体，最常见p65/p50或p65/p65 二聚体，p65亚基的转录激活结构域已被广泛应用于构建诱导基因表达的各种系统效果良好[Wang，Y.等，Gene Ther, 1997. 4 (5), 432-441] 0Gal4蛋白的转录激活结构域(AD)位于其C-末端768-881位，在这114个氨基酸中有很多酸性氨基酸，能招募酿酒酵母细胞中的其他转录辅助蛋白一起激活启动子导致相关基因的转录[Shimizu-Sato, S.，Huq, E.，Tepperman, J. M.,和 Quail, P. H.，NatBiotechnol,2002. 20 (10)，1041-1044]。酵母Gcn4的转录激活结构域主要位于Gcn4蛋白的N-末端第1-144位氨基酸，它可以招募酿酒酵母细胞中的其他转录辅助蛋白一起激活启动子导致相关基因的转录[Drysdale,C. M.等.，Mol Cell Biol, 1995. 15(3) :1220-1233] VP16 为单纯疱疹病毒HSV-I的UL48结构基因表达的含490个氨基酸残基的病毒间层蛋白，其羧基端富含酸性氨基酸残基为转录激活结构域。VP16的转录激活结构域已成功用于多种基因表达系统中效果良好[Gossen，M.和 H. Bujard 等，Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12)5547-5551]。在本发明一优选实施方式中，第三多肽采用VP16的转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用NF-k B p65转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用锌指蛋白354A的KRAB转录阻遏结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用Gal4转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用Gcn4转录激活结构域。本发明的重组光敏转录因子融合蛋白还可包括第四多肽，该多肽是核定位信号肽用以促进融合蛋白向细胞核运输。如果第一、第二和第三多肽不含核定位信号(NLS)时，可融合加入第四多肽。核定位信号肽典型地包括一段碱性氨基酸。本发明优选的核定位信号肽为猿猴空泡病毒40核定位信号肽(SV40NLS) [Fanara, P.，等.，J Biol Chem,2000. 275(28) :21218-21223.]。在一个具体实施方案中，本发明的重组光敏转录因子第一多肽为含有核定位信号的Gal4蛋白，故融合蛋白不含第四多肽。在另一个具体的方案中，第四多肽与第一、第二、第三多肽直接或通过接头相连。如上面所述，本发明的重组光敏转录因子所含的三种或四种多肽各自可以有多种选择，将三种或四种多肽连接成融合蛋白又可以有多种组合选择，本发明优选具有良好活性的各多肽的功能结构域片段制备重组光敏转录因子融合蛋白，通过在哺乳动物细胞和酵母细胞中表达优选的转录调节能力强的，即光照和黑暗时导致目的基因表达量差异大的该重组光敏转录因子，用于调节待转录核酸序列的表达，但不论如何何种选择与组合，只要能实现本发明所设想的光调控基因表达性能的的重组光敏转录因子各种组合都属于本发明的范围。本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统的第二部分是由转录因子特异性识别/结合的反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的祀转录单元(核苷酸序列)，具体来说，其中反应元件的核苷酸基序视本发明不同实施方式所选的重组光敏转录因子融合蛋白的第一多肽不同而不同。换句语说，反应元件是第一多肽的特异性反应元件，必须根据所选择的第一多肽来选择与其相对应的反应元件。例如，第一多肽为Gal4蛋白的DNA识别/结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列67”基序；第一多肽为LexA蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列68”基序；第一多肽为LacI蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列69”基序；第一多肽为TetR蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列70”基序；第一多肽为Cl蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列71”基序。祀转录单元中的反应元件至少为一个或可以有多个，在具体的实施方式中，反应元件为1、2、3、4或5个，如果需要或多个效果更好的话优选多个。与反应元件操作性相连的通常是是最小启动子，此最小启动子本身不足以有效地起启动基因转录，必须和其上游的反应元件一起与转录因子诸成员相互作用后方能激活或上调下游目的基因转录。分析相关文献，可用作本发明最小启动子的包括但不限于腺病毒主要晚期启动子(核酸序列为序列72)、巨细胞病毒CMV最小启动子(核酸序列为序列75)、酵母Gall基因的启动子(核酸序列为序列74)，在本发明具体的实施方式中，最小启动子是腺病毒晚期启动子、酵母Gall启动子，但也可采用其它最小启动子。与反应元件操作性相连的启动子也可以是完整的启动子，这类启动子本身具有启动基因转录的能力，当转录因子结合在反应元件后，可增强或阻遏下游待转录核酸的表达，在另一个具体的实施方式中，启动子为SV40启动子(核酸序列为序列73)。在本发明的本领域技术人员知道，所谓“操作性相连指反应元件与启动子之间或多个反应元件之间不是直接相连而可以隔开若干个核苷酸，只要仍能协同作用即可。
本发明靶转录单元启动子下游是待转录的核苷酸序列，可以是编码目的蛋白或功能性RNA的核苷酸序列。如上面所述，目的蛋白可以是任何有用的蛋白。为了验证本发明系统的效果和便于检测，在本发明的实施例中，采用了示范性的报告蛋白萤火虫荧光素酶(Fluc，其核酸和氨基酸序列分别为序列76和序列77)、高斯荧光素酶(Gluc，其核酸和氨基酸序列分别为序列78和序列79)、红色荧光蛋白mCherry (其核酸和氨基酸序列分别为序列80和序列81)、绿色荧光蛋白(hrGFP，其核酸和氨基酸序列分别为序列82和序列83)、黄色荧光蛋白(EYFP，其核酸和氨基酸序列分别为序列91和序列92)、P -半乳糖苷酶(LacZ，其核酸和氨基酸序列分别为序列93和序列94)作为目的蛋白，但本发明的目的蛋白不限于这些报告蛋白。待转录的核苷酸序列也可以编码功能性RNA分子，例反义RNA分子。在宿主细胞或动物中表达这种功能性RNA分子可调节宿主细胞内的一些活动，例如，通过抑制编码蛋白的mRNA的翻译，阻止目的蛋白的表达。可用标准重组DNA技术将本发明光可诱导的目的蛋白基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个真核表达载体中或分别构建在二个真核表达载体中。可用标准技术将这种表达载体引入各种真核宿主细胞群中表达所需目的蛋白；或引入各种真核宿主细胞群中，例如动物胚胎细胞或植物生殖细胞，进一步选择产生有用的转基因生物，如转基因的山羊、绵羊、猪、牛或其它家畜，或转基因植物。本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统可用于在真核细胞中表达内源蛋白或外源蛋白，用于基因治疗和利用转基因或同源重组生物体(例如动物或植物)内基因的表达。本发明提供由三种或四种多肽组成的多种重组光敏转录因子融合蛋白的氨基酸序列、其编码核酸和其真核表达载体。在本发明的一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-VP16(简写为GAVV(WT))的编码核酸(序列3)、氨基酸序列(序列4)和哺乳动物细胞表达载体PGAVV(WT)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65(简写为GAVP)的编码核酸(序列31)、氨基酸序列(序列32)和哺乳动物细胞表达载体PGAVP(WT)。在本发明一优选实施方式中，提供其中VIVID含有点突变的三种重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列33、35、39)，氨基酸序列(序列34、36、40)和哺乳动物细胞表达载体pGAVP(C71V)、pGAVP (N56K)和pGAVP (Y50W)，其中括弧中为VIVID中的突变位点。在本发明另一更优选的实施方式中，提供其中VIVID含有双突变的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列37)、氨基酸序列(序列38)和哺乳动物细胞表达载体pGAVP(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AsL0V2-p65(简写为GALP)的编码核酸(序列43)，氨基酸序列(序列44)和哺乳动物细胞表达载体pGALP。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AuL0V-p65(简写为GAAP)的编码核酸(序列47)，氨基酸序列(序列48)和哺乳动物细胞表达载体PGAAP。在本发明另一优选的实施方式中，提供第一与第二多肽用不同接头肽连接的三种重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列59、61、63)，氨基酸序列(序列60、62、64)和哺乳动物细胞载体pGAVP-9、pGAVP-ll和pGAVP-12，其中9、11、12代表不同的接头肽。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-KRAB (C71V)(简写为GAVK(C7IV)的编码核酸(序列57)，氨基酸序列(序列58)和哺乳动物细胞表达载体pGAVK(C71V)。在本发明另一实施方式中，提供一组重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD-Ln(N56K+C71V)其中 n 为 1、2、3、4、5、6，简写为 GVG-Ln(N56K+C71V))的编码核酸(分别为序列97、99、101、103、105和107)，氨基酸序列(分别为序列98、100、102、104、106和108)和哺乳动物细胞表达载体pGPMA_GVG_Ln (N56KC71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VI VID-VP16 (N56K+C71V)(简写为GVVP(N56K+C71V))的编码核酸( 序列109)，氨基酸序列(序列110)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GVVP (N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gcn4(N56K+C71V)(简写为 GVGc(N56K+C71V))的编码核酸(序列 111)，氨基酸序列(序列112)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GVGc(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供一组其中VIVID含有点突变的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD的编码核酸(分别为序列113、115、117)，氨基酸序列(分别为序列114、116、118)和酿酒酵母菌表达载体 pGPMA-GVG(WT)、pGPMA-GVG(C71V)和 pGPMA_GVG(Y50W)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AsLOV2-Gal4AD(简写为GLG)的编码核酸(序列119)，氨基酸序列(序列120)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GLG。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽的重组光敏转录因子NLS-LexA-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NLVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列7)，氨基酸序列(序列8)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NLVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子NLS-cI-VIVID-Gal4AD (N56K+C71V)(简写为 NCVG (N56K+C71V))的编码核酸(序列 19)，氨基酸序列(序列20)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NCVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子NLS-LacI-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NLcVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列11)，氨基酸序列(序列12)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NLcVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子 NLS-TetR-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为 NTVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列15)，氨基酸序列(序列16)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NTVG(N56K+C71V)。本领域众所周知，氨基酸的密码子核苷酸有简并性(即某些氨基酸可有二个、或三个、或四个密码子，它们称为该氨基酸的简并密码子)，上述的各种重组光敏转录因子的编码核酸，本发明包括它们各自的所有简并核苷酸序列。上述的各种重组光敏转录因子的氨基酸序列，本发明包括它们各自的所有含保守性缺失、添加、置换修饰但仍保留了其原有功能活性的氨基酸序列类似物。本发明也提供含有反应元件-启动子,但待转录的核苷酸序列空缺的祀转录单元的真核表达载体，待转录的核苷酸序列空缺是让用户可以自行选择所需的待转录的核苷酸序列，例如目的蛋白的编码基因，用标准的重组DNA技术将其插入本发明的这种表达载体中，与上面所述含本发明重组光敏转录因子基因的表达载体共同转染宿主细胞，来调节待转录核苷酸序列(基因)的表达。本发明也提供分别转染了本发明各种重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，同时提供含有相应的反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的祀转录单元的真核表达载体。用户可用标准重组DNA技术将自行选择的待转录核苷酸序列(目的蛋白基因)插入该表达载体中，然后用该重新构建的载体转染已转染了本发明重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，并培养这种细胞表达他们所需的目的基因，或供他们研究如何调节目的基因的表达。本发明还提供装有本发明基因表达调节系统两部分的表达载体或已转染了这种载体的哺乳动物细胞的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒中一些容器分别装有含本发明一种或多种重组光敏转录因子基因的真核表达载体。在另一个实施方式中，该试剂盒中的一些容器分别装有含本发明一种或多种重组光敏转录因子基因的真核表达载体，另一些容器分别装有含相应反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。在还有一个实施方式中，该试剂盒中一些容器装有已转染了本发明重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，另一些容器装有含相应反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。本发明的试剂盒还可以包括相应的光照控制设备，例如LED灯及其调控装置。本发明的所有试剂盒都装有相应的说明书，以说明盒中的各成分、使用目的和使用方法，并提供有关的参考文献目录。本发明还包括光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括步骤a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中；b)引入含被调控基因的宿主细胞；和c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。光照诱导宿主细胞的方法包括光源的选择和光源的使用。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光。在本发明的一个实施方式中，光源选用蓝色LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照强度、光照时间、光照频率以及用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。在本发明的一个实施方式中，光照强度为0-0. 8ff/m2不等；在本发明另一个具体实施方式
中，光照总量不同，即相同的光照强度和光照总时间，分别每30s光照Is、每60s光照Is、每120s光照Is的光照频率进行光照诱导；在本发明的另一个实施方式中，用打印的投影片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平；在另一个的在本发明另一个实施方式中，用中性灰度片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平。附图简要说明图I是重叠PCR的示意图；图2是同源重组连接示意图；图3为反向PCR的原理；图4为含有光敏转录因子的哺乳动物细胞表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图；下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pEGFP-Nl，原有的EGFP基因被光敏转录因子融合蛋白基因取代。*号表示两个多肽处的接头肽不同；图5为含有靶转录单元的哺乳动物细胞表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pcDNA3. 1(+)-hygro,原CMV启动子区和多克隆位点区被靶转录单元取代；图6为含有光敏转录因子的酿酒酵母细胞表达载体的构建不意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为PGADI7，原Gal4AD基因被和多克隆位点区被光敏转录因子融合蛋白取代。*号表示两个多肽处的接头肽不同；图7为含有靶转录单元的酿酒酵母细胞表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图；下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为PYES2. I TOPO ；图8为将Gal4、VIVID(WT)、VP16搭桥PCR的核酸电泳图。左边箭头指的是搭桥、PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在750bp和IOOObp之间；图9为PCR扩增p65AD的核酸电泳图。左边箭头指的是PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和IOOObp之间；

图10为PCR扩增AsL0V2的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；图11为PCR扩增AuLOV的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；图12为PCR扩增LexA(1-87)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；图13为PCR扩增LacI (1-62)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在250bp和IOObp之间；图14为PCR扩增Cl (1-102)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；图15为PCR扩增TetR(l_63)的核酸电泳图。左边箭头指的是PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在250bp和IOObp之间；图16为PCR扩增Gcn4 (1-144)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；图17为在表达几种不同转录激活结构域为第三多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图18为在表达以几种VIVID突变体的第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图19为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的NIH3T3细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图20为在表达重组光敏转录因子GAVP (N56K+C71V)的C0S-7细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图21为在表达第一与第二多肽用不同接头肽连接的重组光敏转录因子GAVP(WT)的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图22为在表达以AsL0V2为第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照后对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图23为在表达以AuLOV为第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照后对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图24为在表达以KRAB为第三多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；图25为表达重组光敏光诱导转录因子GAVP (C71V)的HEK293单克隆细胞筛选。横轴为单细胞克隆的编号，纵轴为Fluc的活性水平；图26为在表达重组光敏转录因子GVG(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图27为在表达重组光敏转录因子GVVP(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图28为在表达重组光敏转录因子GVGc(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对LacZ的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图29为在表达第二与第三多肽用不同接头肽连接的重组光敏转录因子GVG (N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对LacZ基因的表达水平的调节；图30为在表达重组光敏转录因子Gal4-VIVID_Gal4AD的酿酒酵母细胞中，检测转录因子表达水平不同时对目的基因表达的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；
图31为在表达以几种VIVID突变体的第二多肽的转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP基因的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图32为以AsL0V2为第二多肽的转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照后对EYFP基因的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图33为重组光敏转录因子调节含不同个数Gal4反应元件的靶转录单元中EYFP基因表达的差异。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图34为在表达LexA、LacI, cl和TetR分别为第一多肽的重组光敏转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；图35为在表达重组光敏转录因子GAVP (N56K+C71V)的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，开始光照的时刻对应为0小时，纵轴为Fluc的活性水平；图36为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，不同的光照强度对目的基因表达水平的调节。横轴为光照强度，纵轴为Fluc的活性水平；图37为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，不同的光照总量(光照频率)对目的基因表达水平的调节。横轴为光照降低倍数，纵轴为Fluc的活性水平，不同曲线的光照总量(光照频率)不同；图38为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，光照调节mCherry (红色荧光蛋白)基因表达的显微呈像。上图为相差图像，下图为荧光图像；图39为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，光照调节hrGFP(绿色荧光蛋白)基因表达的显微呈像。上面为相差图像，下图为荧光图像；图40为非还原聚丙烯酰胺电泳(15%)检测荧光蛋白的表达。上图目的条带为hrGFP (绿色突光蛋白)，下图目的条带为mCherry (红色突光蛋白)；图41为RT-PCR鉴定光照/黑暗条件下目的基因Fluc的表达；图42在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，用中性灰度片在空间上调控96孔板中培养的细胞的荧光蛋白的表达；图43为用打印图案投影片给表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)细胞“拍照”得到的ECUST图案。左图为贴有投影片的培养皿的照片，右图为细胞的荧光图像；图44为纯化后光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的纯度。箭头指的是目的条带；图45为光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的光谱性质；
图46为光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的凝胶迁移实验。左右二图泳道从左至右GAV(WT)蛋白浓度分别为 5. 5iiM、2. 8iiM、l. 4iiM、0. 7iiM、0. 35 y M ;探针浓度均为 125nM ；图47为6种来自光敏蛋白的不同LOV结构域的同源性分析，其中黑色表示100%相同的氨基酸序列，深灰色表相似性较高的序列，浅灰色表示相似性中等的序列。
具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如简罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；J E.科林根等著，李慎涛等译《精编蛋白质科学实验指南》(科学出版社，背景)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。实施例中所用的pEGFP-Nl、pGADT7、pGBKT7质粒载体购自Clontech公司，pcDNA3. I (+) -hygro、pYES2. I TOPO 质粒载体购自 Invitrogen 公司。pG51uc、pBIND、pACT载体购自Promega公司，均为真核表达载体。pcDNA3. I (+) -hygro和pEGFP-Nl用于构建用于哺乳细胞内表达目的蛋白的真核表达载体，二者均有CMV启动子，前者具有潮霉素抗性基因，后者具有新霉素抗性基因。PGADI7含有Gal4转录激活结构域基因，pBIND含有酵母菌Gal4的DNA结合结构域基因，pACT含有VP16转录激活结构域基因。pG51uc含有Gal4操纵子、TATA最小启动子元件和萤火虫荧光素酶Fluc基因。pIRES-hrGFP购自Stratagene公司，含有hrGFP基因。pGluc-basic购自NEB公司，含有Gluc基因。pTRIPZ质粒购自Openbiosystem公司，含有SV40启动子序列。pO)FDuetl质粒购自Novagen公司，含有LacI基因。所有用于PCR的引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。本发明实实例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司完成。本发明实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BsrGI、Eco47II I、Bgl II、Pst I、Hindi 11、BamHI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有10 X Tango 缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆试剂盒(含同源重组酶)购自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。除非特别声明，无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin)、氨节青霉素(Amp)、PNPG和二硫苏糖醇(DTT)购自Ameresco公司；黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)、ATP、咪唑(Imidazole)购自Alfa公司；Gluc检测试剂盒购自NEB公司；D_荧光素钾盐购自Synchem公司；EGTA购自BBI公司；Trizol 试剂、胰蛋白酶(Trpsin-EDTA)、特级胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、Opti-mem培养基、青霉素/链霉素双抗购自Invitrogen公司；各种氨基酸购自上海生工生物有限公司；0NPG购自Sigma公司DMEM高糖培养基(无酚红/有酚红)购自Hyclone公司。除特别指出外，细胞培养器皿(如IOOmm直径细胞培养皿、48孔板等)、移液管等细胞培养一次性器材购自Corning公司。20_直径玻璃底细胞培养皿购自NEST公司。384孔发光检测白板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。96方孔细胞培养板购自GE healthcare公司。本发明实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；转染级质粒抽提试剂盒购自Omega公司；RNA抽提试剂盒购自Tiangen公司；ImpromII反转录试剂盒购自Promega公司；DC蛋白定量试剂盒购自Bio-rad公司。大肠杆菌Machl购自Invitrogen公司；大肠杆菌JM109购自Promega公司；大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司；细胞系HEK293、C0S_7、NIH3T3购白ATCC (美国模式培养物保藏所);粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)由广西师范大学资源与环境学系谌斌老师慷慨赠送；酿酒酵母AH109购自Clontech公司；BY4741购自Openbiosystem公司。本发明实施例中用到的主要仪器Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司),X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司),Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)。光度计购自日本和光(Sanwa)公司，核酸电泳仪(上海申能博彩公司)，Ti系列倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)，四用紫外分析仪(上海嘉鹏公司)。本文中的缩写词含义如下h =小时，min =分钟，s =秒，d =天，ii L =微升，mL=毫升，L =升，bp =碱基对，mM =毫摩尔，y M =微摩尔。本发明实施例中所用的一部分基因序列通过计算机从NCBI (美国国立生物技术信息中心)检索网站或从购买携带相应基因的商业化质粒的公司的官方网站获得。检索各蛋白编码基因的具体网站如下Gluc (高斯突光素酶)(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/protein/AAG54095. I)hrGFP (人源化绿色突光蛋白)(http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AY613996. I)Fluc (萤火虫突光素酶)(http: //www. promeRa. com/vectors/pG51uc. txt)Gal4 (http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/nuccore/NC 001148 report =Renbank&from = 79711&to = 82356&strand = true)VP16 (单纯疱疫病毒颗粒蛋白 16) (http://www. promeRa. com/vectors/pACT.txt)NF- K B p65 (http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/nuccore/23958349 report =GenBank)VIVID (http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AF338412. I)Phototropinl (向光素 I) : (http : // www.ncbi.nlm.nih.rov/nucleotide/2754822 report = Renbank&loR$ = nucltop&blast rank = l&RID =P49RPCAR01S)Aureochromel (金色素 I) (http : //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AB252504. I)
Gcn4 (酵母通用控制蛋白 4) (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/NC 001137 report = Renbank&from = 138918&to = 139763&strand = true)
LacI (乳糖操纵子阻遏蛋白)(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NC 000913 report = genbank&from = 365652&to = 366734&strand = true)LexA (http: //biocyc. org/ecoli/seguence type = GENE&ob iect = EG10533)EYFP (增强型黄色突光蛋白)(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/37551795)本发明实施例中所用的另一部分基因序列均通过计算机从NCBI (美国国立生物技术信息中心)或Uniprot (全球蛋白资源数据库)检索网站查询其氨基酸序列后，利用DNA design 2. 0软件将氨基酸序列按照宿主细胞种属密码子偏好性转换成核苷酸序列。检索各蛋白编码基因的具体网站如下cl (入操纵子阻遏蛋白)(http: //www. uniprot. org/uniprot/P03034)TetR(Tnl0B class,四环素阻遏物)(http: //www. uniprot. org/uniprot/P04483)mCherry (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AY678264. I)实施例所用方法(一 )聚合酶链式反应(PCR)1.目的片段扩增PCR:
权利要求
1.一种光可控基因表达系统，包括a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽；b)靶转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件、被第三多肽调节的启动子和待转录核酸序列。
2.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽、第二多肽和第三多肽之间可操作性连接，和/或其中反应元件、启动子和待转录核酸序列之间可操作性连接。
3.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3DNA结合结构域。
4.如权利要求3所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽选自酵母Gal4DNA结合结构域、大肠杆菌LexA DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、噬菌体Cl阻遏蛋白的DNA结合结构域、四环素组合蛋白TetR的DNA结合结构域。
5.如权利要求3所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽选自酵母Gal4DNA结合结构域、大肠杆菌LexA DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、噬菌体Cl阻遏蛋白的DNA结合结构域和四环素组合蛋白TetR的DNA结合结构域，及其截短体或/和氨基酸序列同源性80% -99%的突变体。
6.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述第二多肽选自含黄素类生色团的光敏蛋白的光敏结构域。
7.如权力要求6所述的光可控基因表达系统,其中所述第二多肽选自含LOV结构域的光敏蛋白的光敏结构域。
8.如权利要求7所述的光可控基因表达系统，其中所述第二多肽选自粗糙链孢霉菌的VIVID的L0V2结构域、燕麦光敏色素I基因的L0V2结构域AsL0V2和无隔藻金色素蛋白I的LOV结构域AuLOV，及其截短体或氨基酸序列15% -99%相同或氨基酸序列36% -99%相似的突变体。
9.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述第三多肽选自富含酸性氨基酸的转录激活结构域、富含脯氨酸的转录激活结构域、富含丝氨酸/苏氨酸的转录激活结构域和富含谷氨酰胺的转录激活结构域，Kruppel相关盒转录阻遏结构域。
10.如权利要求9所述的光可控基因表达系统，其中所述第三多肽选自单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域、酵母Gal4转录激活结构域、NF-kB p65亚基转录激活结构域、酵母通用控制蛋白4的转录激活结构域和锌指蛋白354A的Kruppel相关盒转录阻遏结构域。
11.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中还包含促进所述重组光敏转录因子向细胞核运输的核定位信号肽第四多肽，所述第四多肽与第一、第二、第三多肽直接或通过接头肽相连。
12.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述反应元件为可被所述第一多肽特异性识别和结合的DNA基序。
13.如权利要求12所述的光可控基因表达系统，其中所述反应元件选自Gal4结合元件、LexA结合元件、TetR结合元件、LacI结合元件和cl结合元件。
14.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述启动子选自腺病毒晚期启动子、巨细胞病毒CMV最小启动子、酵母Gall基因的启动子和SV40启动子。
15.如权利要求I所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽和第二多肽构成一种光可控DNA结合蛋白。
16.含有权利要求1-14之一所述光可控基因表达系统的真核表达载体。
17.如权利要求16所述的真核表达载体，所述表达载体含有所述重组光敏转录因子编码基因，和/或所述祀转录单元，所述祀转录单元中含有反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺。
18.如权利要求16所述的真核表达载体，其中所述重组光敏转录因子的核苷酸序列选自序列 3、7、11、15、19、31、33、35、37、39、43、47、57、59、61、63、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119 ;氨基酸序列选自序列 4、8、12、16、20、32、34、36、38、40、44、48、58、60、62、64、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120。
19.用权利要求1-14之一所述光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括步骤 a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中； b)引入含被调控基因的宿主细胞；和 c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。
20.如权利要求19所述的调控基因表达的方法，其中所述宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、动物细胞和哺乳动物细胞。
21.如权利要求19所述的调控基因表达的方法，其中还包括光源的选择和照射方法的选择，所述光源包括LED灯、荧光灯、激光和白炽灯，所述照射方法是持续的光照或不连续的光照。
22.如权利要求21所述的调控基因表达的方法，包括用光扫描、投影、光模具在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。
23.如权利要求21所述的调控基因表达的方法，所述方法还包括用打印的投影胶片、中性灰度片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。
24.一种试剂盒，装有权利要求16所述真核表达载体或/和转染了含有所述转录因子的真核表达载体的哺乳动物细胞，及相应的说明书。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中还装有含反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。
全文摘要
本发明提供一种光可控基因表达系统，包括a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽；b)靶转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件、被第三多肽调节的启动子和待转录核酸序列。本发明还提供包含这种光可控基因表达系统的真核表达载体，及用这种光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法。本发明还提供装有所述光可控基因表达系统各组分的试剂盒。本发明的光可控基因表达系统诱导快速、高效且强，比其他诱导剂安全，毒性小或无毒性；它可以在时间和空间上控制基因的表达。
文档编号C12N15/79GK102643852SQ20111004814
公开日2012年8月22日申请日期2011年2月28日优先权日2011年2月28日
发明者杨弋, 王雪, 陈显军申请人:华东理工大学