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齿兰环斑病毒和建兰花叶病毒分子检测体系的建立与应用

花匠小妙招
2024-11-29 12:48

简要技术说明：采用传统的RT-PCR技术检测植物病毒，其检测的灵敏度约为1ng模板RNA。

但在活体兰花植株上，虽然有危害症状表现，但是其中含有的病毒含量可能仍然很低，采用RT-PCR技术往往不能检测到病毒RNA。

因此，需要灵敏度和准确度更高的巢式RT-PCR（nested RT-PCR）技术来进行检测。

同时，随着实时荧光RT-PCR（real-time fluorescent RT-PCR）技术的逐渐广泛使用，建立2种兰花病毒的实时荧光RT-PCR检测方法具有重要的意义。

巢式RT-PCR是在普通RT-PCR基础上发展起来的一种PCR技术，在分子生物学研究和医学检测方面应用较多。

其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过2轮PCR反应对某个基因进行检测。

通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过20～30次循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。

这种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测灵敏度提高几个数量级。

相比传统RT-PCR技术，nested RT-PCR技术具有灵敏度更高、特异性更强和结果稳定等优点，是今后检测活体种携带微量疫病的一种非常实用和有效的方法。

实时荧光RT-PCR技术是建立在普通RT-PCR方法上的具有更高灵敏度的分子检测技术。实时荧光RT-PCR在普通RT-PCR反应体系中增加了一条TaqMan探针，探针的5´端含有报告荧光基团，3´端含有荧光的猝灭基团。当RT-PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5´端到3´端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的积累与扩增产物的形成完全同步。该方法由于增加了一条荧光探针，大大增加了扩增产物的特异性，并提高了检测灵敏度。同时，整个反应完全封闭，由仪器直接判读，不需要RT-PCR后处理，消除了扩增产物污染的可能性，减少了检测步骤，节约了检测时间。

应用前景：本项目成果可以应用于口岸检验检疫系统对进出口种球、种苗和花卉等植物或植物产品中ORSV与CyMV的检测，能够极大的提高阳性检出率，防止假阴性结果的产生。

方法也可用于研究机构或种植企业对兰花病毒的监测，防止病毒的传播与扩散，保证植株的健康。