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主要研究内容、目标及进展

花匠小妙招
2024-11-29 13:44

主要研究内容

开展微生物细胞壁与胞外多糖的合成机制及其生物学功能研究，研究领域涉及多糖生物合成途径的功能基因组学、分子生物学、微生物生理与生化。主要研究内容为：

1）病原真菌细胞壁合成机制及其在感染免疫中的作用。

2）病原细菌胞外多糖合成机制及其在感染免疫中的作用。

3）真菌糖蛋白表达体系的构建。

4) 古菌细胞表面糖链的合成与功能。

研究目标

研究病原微生物（病原真菌、病原细菌）细胞表面多糖与糖蛋白的合成调控机制，揭示其在感染免疫中的作用，为感染疾病的诊断与治疗提供新的靶标；研究真菌蛋白质翻译后修饰、糖链合成机制的研究，改造真菌蛋白质表达系统，为糖蛋白药物的生产提供底盘细胞。

主要进展

研究组长期从事微生物细胞壁合成机制及其生物学功能研究，已建立糖链结构分析、蛋白质与多糖的生化、细胞生物学、蛋白质组学、遗传操作系统及动物感染模型等研究技术和实验体系。对病原真菌（烟曲霉、尖孢镰刀菌）细胞壁糖蛋白与多糖、病原细菌（大肠杆菌、猪链球菌、肺炎链球菌）胞外多糖及古菌（嗜盐古菌）细胞表面糖链的结构、生物合成途径及功能开展了系统研究，近年来还开展里氏木霉、毕赤酵母糖蛋白表达的研究。研究成果已在本领域国内外核心期刊物发表研究论文90余篇、特邀综述14篇，获专利授权9项。

一、真菌细胞壁合成及其在感染中的作用

真菌细胞壁由多糖和糖蛋白组成，是真菌特有的细胞结构，不仅是保护真菌细胞的物理屏障，也是病原真菌与宿主直接接触的细胞结构，并且不存在于哺乳动物细胞中，因此细胞壁是诊断、治疗真菌感染的理想靶点。本研究组对病害真菌细胞壁合成机制及其功能进行了系统研究，取得的主要进展如下。

1. 烟曲霉细胞壁糖蛋白与多糖的合成及其对感染的影响

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是引起侵袭性曲霉病的主要病原真菌。侵袭性曲霉病的死亡率为85%左右；即使在用药的情况下，死亡率仍高达50%，死亡率高的原因是缺乏快速准确的诊断方法和可用药物有限。因此，迫切需要寻找新的诊断和治疗方法。为此美国FDA出台相关政策允许抗真菌感染新药的市场专营权延长5年，并将抗真菌药物列为“孤儿状态”，降低临床试验的限制，以鼓励抗真菌药物的研发。

为揭示烟曲霉细胞壁的合成机制，我们解析了烟曲霉糖蛋白的N-糖链和O-糖链结构，并应用生物信息学和蛋白质组分析，推测出烟曲霉蛋白质糖基化修饰（包括N-糖基化、O-糖基化和GPI修饰）的生物合成途径。在此基础上，通过遗传与生化分析对细胞壁糖蛋白与多糖合成的前体进行了研究，证明甘露糖（Man）和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）合成途径中的pmi1、srb1、uap1和ugm1等基因是细胞壁合成所必需的基因；当这些基因缺陷时，烟曲霉表现除细胞壁缺陷、细胞死亡、形态发生与极性生长异常等表型。说明这些基因所编码的蛋白有可能成为新药研发的靶分子。发现与蛋白质N-糖基化修饰及降解相关的基因stt3、cwh41、msdS和ams1均与细胞壁合成、极性生长密切相关，并阐明了其分子机制。对蛋白质O-糖基化修饰相关的pmt1、pmt2和pmt4的研究表明，O-糖基化也与烟曲霉细胞壁合成、温度耐受性和细胞极性生长相关，不同的pmt基因缺陷所引起的表型不同，通过糖蛋白组学研究证明，不同表型是由于不同Pmt蛋白所修饰的底物不同。

除N-和O-糖基化修饰外，烟曲霉细胞壁糖蛋白还有GPI修饰。我们发现烟曲霉GPI修饰缺陷时，细胞死亡增加、细胞壁发生缺陷、毒力下降。进一步通过遗传、生化和组学的方法，证明GPI修饰的缺陷使烟曲霉GPI蛋白的前体在ER内积累，引起ER-stress和磷酸肌醇信号通路的激活，导致钙离子信号通路上调，引发细胞自噬和坏死性凋亡。揭示了GPI修饰缺陷导致的细胞死亡机制，证明GPI修饰是烟曲霉细胞壁合成和毒力所必须的翻译后修饰。

对烟曲霉细胞壁糖蛋白合成机制的研究证明，Gel1、Gel2、Gel4和Ecm33为定位于细胞膜的GPI蛋白，其中负责细胞壁多糖合成的葡聚糖转移酶Gel1和Gel2的折叠需要糖基化修饰，当糖基化加工被阻断后，Gel1和Gel2不能正确折叠，导致细胞壁合成缺陷和极性生长异常。特异定位于细胞壁的GPI蛋白Mp1，是在甘露糖基转移酶Mnn9的作用下，引发O-糖链延伸，延伸而成的甘露聚糖与细胞壁葡聚糖共价交联，是Mp1定位于细胞壁。Mp1的成熟、分泌及细胞壁定位受GPI-糖链修饰的调控，当GPI-糖链修饰受阻时，Mp1不能定位于细胞壁，同时突变株细胞壁组分变化，表现除极性生长异常和细胞自噬等表型；在小鼠模型和天然免疫细胞中黏附增加，引起更严重的炎症反应，并能抵抗天然免疫细胞的杀伤。这些研究结果说明GPI修饰在烟曲霉细胞壁的结构、毒力和在宿主中的免疫应答中发挥重要作用（图1）。

图1. 烟曲霉细胞壁合成机制的模型。烟曲霉中负责细胞壁合成的葡聚糖转移酶Gel1和Gel2及细胞壁蛋白Mp1均为GPI蛋白。（1）在ER中N-糖基化修饰保证Gel1和Gel2的正确折叠，经GPI修饰后运输到细胞膜进行细胞壁的合成。（2）合成GPI蛋白时，GPI-糖链的Man2残基由Gpi7催化进行磷酸乙醇胺（EtNP）修饰后成为成熟的GPI；蛋白质C-端与成熟GPI连接后，由Ted1水解释放Man2上的EtNP，然后被p24识别、分拣进COP II囊泡。Man2残基的EtNP修饰缺陷时，Mp1不能被定位于细胞壁。（3）GPI蛋白由COP II囊泡运送到高尔基体后，由于葡聚糖转移酶Gel1和Gel2的蛋白C-端与GPI锚连接的第1或第2位为碱性氨基酸，可特异地在细胞膜上表达，参与细胞壁的合成。（4）细胞壁糖蛋白Mp1在Mnn9的作用下，其O-糖链延伸形成甘露聚糖，并且其蛋白质部分与GPI分离后进入细胞壁，通过O-连接甘露聚糖与细胞壁葡聚糖共价交联而定位于细胞壁。（5）在ER中Emp47凝集素负责将N-糖基化修饰的分泌蛋白分拣进COP II，并运送至高尔基体，保证糖蛋白的胞内运输与分泌。（6）高尔基体中的Vip36凝集素可将从ER泄漏的分子伴侣等分拣进COP I囊泡，并反运回ER，从而维持蛋白质合成机器与ER的稳态。

2. 尖孢镰刀菌细胞壁的合成及其对毒力的影响

尖胞镰刀菌（Fusarium oxysporum）是引起多种农作物枯萎病的病害真菌。我们对尖胞镰刀菌细胞壁糖蛋白与多糖的研究表明，由Pmt1、Pmt2和Pmt4负责蛋白质的O-糖基化修饰，虽然3个蛋白的功能不同，但都与尖孢镰刀菌的毒力相关。对细胞壁多糖组分呋喃半乳糖糖链合成相关的基因ugmA、ugmB和gfsA的研究发现，呋喃半乳聚糖是尖胞镰刀菌毒力所需的细胞壁组分。由于pmts、ugmA、ugmB和gfsA基因均不存在于植物中，因此它们是抗枯萎病药物研发的理想靶点。

二、病原细菌胞外多糖合成机制及其在感染与免疫中的作用

胞外多糖与病原细菌的毒力、免疫应答和耐药性密切相关。早期我们对新生儿脑膜炎的致病菌E. coli K1和2型猪链球菌（SS2）的荚膜多糖合成机制进行了研究，发现合成其荚膜多糖的关键酶NeuA是一个具有CMP-唾液酸合成酶和乙酰水解酶活性的双功能蛋白，并揭示了E. coli K1和SS2调控其荚膜唾液酸O-乙酰化修饰的机制。进一步我们证明荚膜唾液酸的O-乙酰化修饰可使大肠杆菌逃避Siglec介导的天然免疫，研究结果深化了对脑膜炎致病机制的理解，为脑膜炎感染的防治提供了新的思路和靶点。

近年来，研究组还开展了肺炎链球菌胞外多糖合成机制的研究，鉴定了多个决定肺炎链球菌血清型的基因，为新疫苗的研发奠定了科学基础。

三、真菌糖蛋白表达体系的研究

里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种重要的工业生产用真菌，被美国FDA列为GRAS（Generally Regarded As Safe）微生物。虽然里氏木霉在每升发酵液中可产生高达40克的分泌蛋白，但在表达异源蛋白时产量却不高。我们通过遗传、生化和糖蛋白组分析对里氏木霉开展研究，发现蛋白质O-糖基化修饰与蛋白质折叠、细胞壁合成等密切相关，改变其O-糖基化修饰途径可显著提高分泌糖蛋白的表达水平，是提高里氏木霉蛋白分泌表达的一个新策略。

近期我们的工作还包括对毕氏酵母的糖基化修饰途径进行人源化改造，为大规模、低成本的糖蛋白药物、抗体生产提供底盘细胞。

四、古菌细胞表面糖链的合成机制及其功能

蛋白质的糖基化修饰不仅存在于真核生物中，而且也存在于细菌和古菌中。古菌的S-层蛋白相当与细菌的细胞壁，虽然这些S-层蛋白是糖蛋白，但目前对古菌蛋白质糖基化的了解还非常有限。研究古菌蛋白质糖基化将有助于我们从进化的角度去揭示蛋白质翻译后修饰的功能、发掘可用于合成生物学的糖酶资源。我们对嗜盐古菌西班牙盐盒菌的蛋白质糖基化进行了系统研究，解析了该菌的S-层蛋白糖基化修饰的结构特征和合成途径，鉴定了多个与S-层蛋白糖基化修饰和胞外多糖合成相关的关键基因，证明S-层蛋白糖基化修饰和胞外多糖都与西班牙盐盒菌对极端环境的适应性相关。另外我们还发现了1个新型翻转酶，实现了该领域的一个重要突破（图2）。

图 2. 西班牙盐盒的N-和O-糖基化途径。西班牙盐盒菌的S-层蛋白被N-连接的Glcα-(1, 2)-[QuiNSβ-(1, 6)-]Gal和O-连接的Glcα-(1, 4)-Gal修饰。S-层蛋白的N-和O-糖基化修饰均发生在细胞膜的外表面，以Dol-P连接的糖为供体。Glc-DolP和Gal-DolP先在细胞膜的胞浆面合成，然后由Agl23将Glc-DolP和Gal-DolP翻转到细胞膜的外表面。虽然N-和O-糖链均含有Glc-Gal二糖，但它们的连接方式和合成途径不同。N-糖链的合成是由Agl22催化先合成Glcα-(1, 2)-Gal-DolP前体，然后在AglB的催化下将该前体二糖转移到S-层蛋白上；最后由一个未知的酶将QuiNS-DolP中的QuiNS转移到N-连接二糖上。O-连接的Glcα-(1, 4)-Gal二糖的合成是以Gal-DolP和Glc-DolP供体，顺序添加到S-层蛋白上，催化O-糖基化修饰的酶还未被鉴定。