基因工程基本知识及基本技术
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2024-01-29 01:03本页面
【正文】 （ 2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （ 3）非互补碱基越多，杂交效率越差。 （ 4）用一段寡聚核苷酸（ 8mer）的 所有可能的碱基排列序列 作探针。 8mer探针有 48= 65536 种序列。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一种 探针完全杂交形成 完全互补 双链。 （ 5）根据 杂交效率 可推断出靶 DNA的序列。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探针序列已知，则可推知靶 DNA序列。 但： 12mer靶 DNA 与 8mer探针杂交，将会有 5种 探针与之形成完全互补双链。 3’TCGGATCG5’ 3’CGGATCGA5’ 3’GGATCGAC5’ 3’GATCGACT5’ 3’ATCGACTT5’ 5’AGCCTAGCTGAA3’ 12mer target 8mer probe 假如知道能与之完全杂交的所有 5种探针序列，就可推知 12bp的靶 DNA序列。 （ 1） DNA芯片（ chip） 把寡聚核苷酸探针的 3‘端或 5’端与玻璃或凝胶形成共价连接。不同碱基组合的寡核苷酸小区排列在一起形成探针点阵 . 目前可以做出 65536 种 8mer探针芯片。 2. 技术要点 每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。 (2) （ 1）非放射性标记 1981年第一台商业化生产的 DNA自动测序仪诞生。 四、 DNA自动化测序 荧光物质标记。用激光能激发出 不同颜色的荧光。 1. 技术要点 （ 2）不同的标记对象 既可标记 引物 ，也可标记 ddNTP。 （ 4）分析自动化 （ 3）读片的自动化 激光探头直接读胶，实时阅读。 （ 2）反应的自动化 Sanger脱氧终止法。 电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出 DNA序列。 （ 5）反应可在一个试管中进行 标记 ddNTP时。 2. 荧光标记引物的自动化测序 ① 分别用 4种荧光物标记 引物 ， ② 区分反应产物， ③混合 电泳， ④激光一次 读胶， ⑤电脑 合成结果。 3. 荧光标记 ddNTP自动测序原理图解 4种不同的荧光物分别标记 4种 ddNTP 可在同一管中进行 可在单一泳道电泳。 测序结果 第六节 基因定点突变技术 基因突变：基因组 DNA分子在结构上发生碱基 对中组成或排列顺序的改变 ,并引起 个体表型的改变 ,而使生物体发生遗 传变异 .分为 自发突变 和 诱发突变 . A 寡核苷酸介导的基因突变 : 1 寡核苷酸引物诱变技术 2 盒式诱导突变 1 寡核苷酸引物诱变技术 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片断作为引物 ,启动单链 M13噬菌体 DNA进行复制 ,随后这段寡核苷酸引物成为新合成 DNA子链的一个组成部分 ,新生的子链便具有发生突变的碱基序列 . 原理 : 技术条件 : 载体 引物 2 盒式诱导突变 以各种双链质粒 DNA为载体 ,采用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片断置换待改造基因中两个限制酶切点之间的序列 ,在转化的大肠杆菌中形成数量众多的突变体 .这些突变体就好象不同的盒式录音磁带 ,可随时插入制备好的质粒中 . B PCR定点突变技术 应用 PCR技术在 DNA模板中预先确定的位置上引入单个或多个碱基的改变 . 1 引物 PCR定点诱变法 2 重组 PCR定点诱变法 第七节 酵母双杂交系统 Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 90年代，纽约大学的 S. Field等建立。 有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白编码基因 二、酵母双杂交系统的原理 许多真核生物的 转录激活因子 都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的 结构域组成。 1. 结构域（ Domain）合作 一、酵母双杂交系统的作用 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子 GAL4: DNA binding domain Active domain N C 1147aa 768881aa 上游激活序列（ UAS） 转录机 GAL4效应基因 结合 结合 激活转录 只要 DNA binding domain（ DNABD）与 Active domain（ AD）靠近就能够表现转录激活活性。 实验发现： 转录表达 2. 拆开 Domain DNA binding domain Active domain 上游激活序列（ UAS） 转录机 GAL4效应基因 结合 用重组 DNA技术把 GAL4的两个 Domain分开，就 丧失 了激活效应基因的能力。 不能转录 3. 重组 Domain 用重组 DNA技术把这两个 Domain分别与两个不同的多肽连接。 Active domain 蛋白 A 蛋白 B DNA binding domain 在体内，蛋白 A与蛋白 B是否能结合。 通过效应基因是否被激活来检查： 4. 观察报告基因表达 上游激活序列（ UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白 A DNA binding domain 转录激活 domain 蛋白 B GAL4的 DB domain与 AD Domain也不能靠近 ，所以仍然不能启动效应基因的转录。 不能转录 （ 1）如果蛋白 A与蛋白 B不能相互结合 上游激活序列（ UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活 domain 蛋白B 激活转录 GAL4的 DB domain与 AD Domain也能靠近 ，所以能启动效应基因的转录。 转录表达 （ 2）如果蛋白 A与蛋白 B能相互结合 双杂交原理 X基因和 Y基因产物的相互结合，导致 reporter gene表达。 Reporter gene表达就可说明 X基因产物于 Y基因产物能结合。 三、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型 GAL4基因 使酵母菌只能利用 载体 表达的 GAL4蛋白。 如： SFY526。 HF7c等菌株。 四、构建报告基因（ reporter gene） GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在 组氨酸缺乏培养基 上。 GAL4的效应基因是 his3/lacZ/URA3。 此外还有其他营养缺陷。 1. 穿梭质粒（ shuttle plasmid） 五、构建双杂交体系的穿梭质粒 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带 已知的靶蛋白基因 和携带 未知基因 序列。 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在 GAL4的BD之后。 （ 1） BDplasmid P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。 筛选标志： TRP 核定位信号是 GAL4本身的一部分 ADH： Alcohol dehydrogenase （ 2） ADplasmid 外源基因按正确阅读框克隆到 GAL4的 AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 筛选标志： LEU2 核定位信号是SV40的 T抗原的序列 六、酵母双杂交的实验过程 1. 把蛋白 A插入到 BD质粒上（ pGBT9） 2. 把蛋白 B插入到 AD质粒上（ pGAD424） 3. 两种重组质粒共同转化酵母菌（ HF7c） 报告基因： HIS（合成组氨酸） 4. 筛选观察 （ 1）存活选择 在缺少 亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 培养基上筛选 双载体 转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。 Trp Leu 在缺少 组氨酸（ HIS）、亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 的培养基上筛选蛋白 A和蛋白 B能相互作用的双载体转化子。 （ 2）蛋白结合选择 His Trp Leu
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