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【Mol Plant】OsRACK1A产物的过量积累，赋予水稻花对假黑穗病的抗性，并且不会降低水稻产量

花匠小妙招
2024-11-30 20:46

题目：Overproduction of OsRACK1A, an effector-targeted scaffold protein promoting OsRBOHB-mediated ROS production, confers rice floral resistance to false smut disease without yield penalty

刊名：Molecular Plant

作者：Guo-Bang Li，Jing Fan et al.

单位：Sichuan Agricultural University, Chengdu

日期：October 15, 2022

摘要

谷物形成是作物产量的基础，但易受非生物和生物胁迫的影响。水稻谷物生产受到假黑穗病真菌 Ustilaginoidea virens的威胁，这种真菌专门感染水稻花器官，破坏受精和种子形成。然而，人们对U. virens与水稻相互作用的分子机制和花抗性的遗传基础知之甚少。

在这里，我们发现U. virens分泌细胞质效应子 UvCBP1，以促进对水稻花的感染。从机制上讲，UvCBP1 与水稻支架蛋白 OsRACK1A 相互作用，并竞争其与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 OsRBOHB 的相互作用，从而抑制活性氧 (ROS) 的产生。

尽管对自然变异的分析显示没有可以避免被 UvCBP1 靶向的 OsRACK1A 变体，但OsRACK1A的表达水平与水稻种质中对U. virens 的田间抗性相关。OsRACK1A 的过量生产恢复了 OsRACK1A–OsRBOHB 关联并促进 OsRBOHB 磷酸化以增强 ROS 的产生，赋予水稻花对U. virens 的抗性没有屈服惩罚。

综上所述，我们的研究结果揭示了一种新的致病机制，该机制由来自花特异性病原体的基本效应物介导，并为平衡抗病性和作物产量提供了宝贵的遗传资源。

技术路线

水稻种质 Q455、其衍生的转基因品系、载体构建和遗传转化

免疫荧光和免疫金分析

核酸提取和PCR

ROS 和胼胝质沉积的测量

蛋白质相互作用分析

水稻原生质体中的 coIP 测定

Y2H 测定V

LCI 测定

GST pull-down 测定

主要结果

3.1 UvCBP1 易位到水稻花细胞中以抑制宿主免疫并促进U. virens感染

我们之前鉴定了一种U. virens分泌蛋白 UvCBP1（与 UVI_02019410 相同；GenBank：GAO15639.1），具有免疫抑制活性。在这里，我们研究了 UvCBP1 在何处以及如何作为水稻花中的免疫抑制剂发挥作用。我们通过免疫荧光分析检查了 UvCBP1 在花组织中的定位。UvCBP1 一抗和 Alexa Fluor 488 偶联二抗用于检测 UvCBP1。结果表明，UvCBP1 的绿色荧光信号存在于U.virens菌丝中，并在接种U.virens后 7 天 (dpi) 在雄蕊丝细胞中聚集为斑点（图 1A), UvCBP1高表达的时间点。我们接下来构建了 UvCBP1-GFP 和 GFP U. virens菌株并将它们接种到水稻花上进行免疫实验。我们观察到U. virens在细胞间感染水稻雄蕊丝（图 1 B），这与之前的报道一致。我们还发现数百个金颗粒位于感染 UvCBP1-GFP 菌株而非 GFP 菌株的花细胞的囊泡样结构中（图1 B）。定量证实 UvCBP1-GFP，而非 GFP，在花细胞中积累。作为对照，在U. virens的菌丝细胞中检测到 UvCBP1-GFP 和 GFP 的金颗粒（图 1 B ）。这些结果表明 UvCBP1 在U. virens感染期间易位到花细胞中。

图 1。UvCBP1 在U. virens感染期间易位到水稻花细胞中。

(A) UvCBP1 在U. virens感染的雄蕊花丝中的免疫荧光检测。用 UvCBP1 特异性抗体探测石蜡切片，然后用 Alexa Fluor 488 偶联二抗探测。(B) UvCBP1 在U. virens感染的花中的免疫金检测。显示的是透射电子显微照片，显示在感染U. virens菌株 PJ52 或表达UvCBP1-GFP 或 GFP 的 PJ52 的雄蕊丝部分中 GFP 标记的 UvCBP1 或 GFP 的免疫金标记。

为了检查宿主中 UvCBP1 细胞质位置的生物学相关性，我们制作了多个表达 UvCBP1 成熟序列（缺乏信号肽）的转基因水稻品系，这些序列标记有增强型黄色荧光蛋白（eYFP）（UvCBP1 ΔSP -eYFP ). 与野生型植物相比，UvCBP1 ΔSP -eYFP 品系表现出减少的几丁质引发的防御反应，包括胼胝质沉积、活性氧 (ROS) 爆发和防御相关基因的诱导（图 2 A- 2D）。疾病测定表明，UvCBP1 ΔSP -eYFP 植物表现出较高的每穗患病小穗率，并容纳更多U. virens比野生型植物生长（图 2 E-2G）。在 UvCBP1 ΔSP -eYFP 小穗中检测到较少的 H 2 O 2积累和较低的防御相关基因表达（图 2 H 和 2I）。这些结果表明 UvCBP1 易位到花细胞中以抑制模式触发的免疫，从而促进U. virens感染。

图 2。UvCBP1 抑制水稻免疫并促进U. virens感染。

（A 和 B）几丁质诱导的 UvCBP1 ΔSP -eYFP 叶中的胼胝质沉积。拍摄了代表性的苯胺蓝染色(A)，并记录了胼胝质沉积物的数量(B)。

(C)几丁质诱导的 UvCBP1 ΔSP -eYFP 叶中的 ROS 爆发。

(D)几丁质诱导的OsPR10b和OsBETV1在 UvCBP1 ΔSP -eYFP 叶中的表达。

(E)感染U. virens PJ52的野生型 (WT) 和 UvCBP1 ΔSP -eYFP 表达水稻的疾病表型。淡黄色的小穗表示假黑穗病球。

(F)每穗患病小穗率的箱线图。

(G)接种后 6 天的相对U. virens生长 (dpi)。

(H)在 3 dpi 收集的感染U. virens 的小穗中H 2 O 2的定量。

(I)感染稻瘟病菌的水稻小穗防御相关基因的 qRT-PCR 分析。

为了确定UvCBP1在U.virens致病性中的作用，我们构建了多个UvCBP1过表达或敲低的U.virens转化体。我们在穗后期将这些转化体和野生型菌株 PJ52 接种到水稻穗中。接种后 4 周左右，患病的圆锥花序产生了不同数量的假黑穗病球。患病小穗数和相对U. virens生长在UvCBP1过表达菌株感染的圆锥花序中显着较高，但在UvCBP1中显着较低与 PJ52 感染的圆锥花序相比，击倒菌株感染的圆锥花序。与PJ52 相比，感染UvCBP1过表达菌株显着降低了水稻小穗中H2O2积累和防御相关基因OsPR10b和OsBETV1的表达。相比之下，与感染 PJ52 的水稻小穗相比，感染UvCBP1敲低菌株的水稻小穗积累更多的 H 2 O 2并显示出更高的OsPR10b和OsBETV1表达水平。所以，UvCBP1是U. virens完全毒力所必需的。

3.2 UvCBP1 靶向水稻中的支架蛋白 OsRACK1A

为了确定 UvCBP1 的宿主目标，我们使用 UvCBP1 作为诱饵对U. virens条件化的水稻 cDNA 文库进行了 Y2H 筛选。我们鉴定了一种与 UvCBP1 相互作用的水稻支架蛋白 OsRACK1A（图 3 A ）。UvCBP1 和 OsRACK1A 之间的相互作用通过荧光素酶互补成像 (LCI) 测定法在本塞姆氏烟草中得到验证（图 3 B）。蛋白质印迹分析证实了相应结构的蛋白质表达。免疫共沉淀 (coIP) 测定表明 UvCBP1 与水稻原生质体和本塞姆氏烟草中的 OsRACK1A 相关（图 3 C ）。谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 下拉数据表明 UvCBP1 和 OsRACK1A在体外直接相互作用（图 3 D）。

3.3 OsRACK1A 是 ROS 生产和防御花卉中U. virens所必需的

OsRACK1A在水稻花中高表达。为了确定其在花免疫中的作用，我们使用 CRISPR-Cas9 技术生成了OsRACK1A敲除突变体。获得了一个在OsRACK1A中具有 4-bp 缺失的突变体和另一个具有 1-bp 插入的突变体。然而，这些突变体的纯合后代显示出严重的发育缺陷并且没有产生种子，阻碍了进一步的实验。然后我们用 RNA 干扰方法构建了OsRACK1A的基因沉默系。OsRACK1A敲低( OsRACK1A-KD) 降低了株高和主要的产量相关性状，表明OsRACK1A在水稻生长发育中起着至关重要的作用。然后我们在穗后期用U. virens菌株 PJ52 接种OsRACK1A-KD转基因植物。接种 4 周后，受感染的小穗长出绿黑色假黑穗病球（图 3 E）。OsRACK1A-KD中每穗的患病小穗率和相对U. virens生长率显着高于野生型植物 60%–70%（图 3F和 3G）。U. virens诱导的 H 2 O 2与野生型植物相比，OsRACK1A-KD小穗中防御相关基因OsPR10b和OsBETV1的积累和表达受到显着抑制（图 3 H-3K）。这些数据表明OsRACK1A是 ROS 产生和防御花中U. virens所必需的。

图 3。UvCBP1 与支架蛋白 OsRACK1A 相互作用，OsRACK1A 是产生 ROS 和抵抗水稻花中U. virens所必需的。(A) UvCBP1 和 OsRACK1A 之间的 Y2H 测定。(B)烟草中 UvCBP1 和 OsRACK1A 之间的荧光素酶互补成像 (LCI) 测定。(C) CoIP 测定。OsRACK1A-4×HA 或 mRFP-4×HA 在 UvCBP1 ΔSP -eYFP 转基因植物的原生质体中表达。(D) GST 下拉分析。从大肠杆菌中纯化出重组蛋白 MBP-UvCBP1 ΔSP和 GST-OsRACK1A 。GST 和 MBP 标签蛋白用作阴性对照。(E)感染U. virens PJ52的OsRACK1A敲低 ( OsRACK1A-KD ) 圆锥花序的疾病表型。(F)每穗患病小穗率的箱线图。(G) 6 dpi 时的相对U. virens生长。(H) OsRACK1A-KD小穗在 3 dpi 下用U. virens进行 DAB 染色。(I)在 3 dpi 时量化U. virens感染的小穗中的H 2 O 2 。( J 和 K) qRT-PCR 分析在 3 dpi 的指定水稻品系的小穗中的OsPR10b ( J ) 和OsBETV1 ( K ) 与U. virens。

3.4 OsRBOHB 产生的 ROS 抑制U. virens在花中的生长

因为OsRACK1A-KD花中H 2 O 2的减少促进了U. virens感染，我们测试了 H 2 O 2是否抑制U. virens生长。U. virens菌株PJ52 的分生孢子与连续浓度的H2O2孵育，并记录分生孢子的发芽率。结果表明，29.3 nmol ml -1 H2O2显着降低了绿藻的发芽率，在58.6 nmol ml -1 H2O2下发芽率降低了74%。并被146 nmol ml −1 H 2 O 2完全抑制（图4A）。与对照培养基相比， PJ52 的菌丝体生长在添加 H 2 O 2 (4.41 nmol ml -1 ) 的培养基中被抑制了 60% （图 4 B）。因此，U. virens对H 2 O 2高度敏感。

我们接下来评估了植物中ROS 的产生是否会限制U. virens在水稻花中的生长。为此，我们使用 CRISPR-Cas9 方法构建了OsRBOHB的多个突变系，OsRBOHB 是负责产生 ROS 的主要基因 ( Nakashima et al., 2008 )。两条单独的线，CR-rbohb-3在目标站点 1 有 1-bp 插入，在目标站点 2 有 6-bp 删除，CR-rbohb-4在目标站点 1 有 1-bp 插入和 5-bp在目标站点 2 删除，被选中用于后续实验（补充图 6）。患病小穗率和U. virens生长显着增加了大约 70%CR-rbohb突变体与野生型植物相比（图 4 C-4E）。CR-rbohb小穗中的H 2 O 2积累减少了近 50% （图 4F和 4G）。OsPR10b和OsBETV1的表达在CR-rbohb突变体中也降低了（图 4H和 4I）。因此，花对U. virens 的抗性需要 OsRBOHB 介导的 ROS 产生。

图 4。由OsRBOHB介导的 ROS 产生限制了稻花中U. virens 的生长。(A) U. virens PJ52 分生孢子的萌发与不同浓度的 H 2 O 2孵育48 小时。(B) PJ52 的菌丝体在添加/不添加 4.41 nmol ml −1 H 2 O 2的 PS 琼脂培养基上生长23 天。(C) OsRBOHB突变体 ( CR-rbohb ) 感染U. virens PJ52的圆锥花序的疾病表型。(D)每穗患病小穗率的箱线图。(E) 6 dpi 时的相对U. virens生长。(F) CR-rbohb小穗在 3 dpi 时用U. virens进行 DAB 染色。(G)在 3 dpi 时量化U. virens感染的小穗中的H 2 O 2 。(H 和 I) qRT-PCR 分析在 3 dpi 的指定水稻品系的水稻小穗中的OsPR10b ( H ) 和OsBETV1 ( I ) 与U. virens。

3.5 UvCBP1 损害 OsRACK1A–OsRBOHB 相互作用以减弱 ROS 的产生

为了理解 UvCBP1–OsRACK1A 相互作用的生物学意义，我们检查了 UvCBP1 是否会改变 OsRACK1A 的亚细胞定位或蛋白质稳定性。我们用分别携带 OsRACK1A-eYFP 和 UvCBP1 ΔSP单体红色荧光蛋白 (mRFP) 的农杆菌共渗入烟草叶片，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察到 OsRACK1A-eYFP 位于植物细胞的细胞质和细胞核中无论是否存在 UvCBP1 ΔSP -mRFP。在瞬时表达系统和稳定的转基因植物中，OsRACK1A 的蛋白质稳定性不受 UvCBP1 ΔSP的影响。这些结果表明 UvCBP1 不会改变 OsRACK1A 的定位或影响其稳定性。

RACK1 存在于许多蛋白质复合物中，其本身没有酶活性，但作为支架蛋白发挥作用，在不同的细胞过程中桥接蛋白质相互作用，例如蛋白质翻译和有丝分裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 级联介导的信号转导。水稻同源物 OsRACK1A 可以在以 OsRac1 为中心的防御复合体中检测到，它在水稻对米霉的免疫中发挥重要作用。OsRACK1A 有七个 Trp-Asp (WD) 结构域，只有前两个 WD 结构域（WD1 和 WD2）与 OsRac1 或 OsRac1 防御体的其他成分相互作用，例如 OsRBOHB（图 5A ）和OsSGT1 。我们发现 UvCBP1 还与 OsRACK1A 的 WD1-2 相互作用（图 5A），表明存在竞争的可能性。在 LCI 和 coIP 分析中，添加 UvCBP1 在很大程度上阻止了 OsRACK1A 与 OsRBOHB、OsRac1 和 OsSGT1 相互作用（图 5B和 5C），表明 UvCBP1 胜过 OsRACK1A–OsRBOHB、OsRACK1A–OsRac1 和 OsRACK1A–OsSGT1 的相互作用。因为 OsRBOHB 是一种还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，对 ROS 的产生和对U. virens 的免疫至关重要（图 4），我们评估了 OsRACK1A 或 UvCBP1 是否会影响 OsRBOHB 产生的 ROS。我们的数据表明，OsRBOHB 促进了烟草叶片中 ROS 的产生，OsRACK1A 增强了这一点。相比之下，UvCBP1 损害了 OsRACK1A/OsRBOHB 刺激的 ROS 产生，特别是在几丁质处理后（图 5D)。我们还发现 UvCBP1 显着抑制 OsRACK1A/OsRac1 刺激的 ROS 产生以及 OsMAPK6 调节的 ROS 产生。这些结果表明 UvCBP1 破坏了支架蛋白 OsRACK1A 与其伙伴之间的相互作用以抑制植物免疫。

我们之前曾报道过 UvCBP1 是一种抑制植物免疫的几丁质结合蛋白。为了测试 UvCBP1 的几丁质结合能力是否是靶向 OsRACK1A 所必需的，我们生成了一个突变版本的 UvCBP1，它失去了几丁质结合能力。我们发现该突变体 (UvCBP1 ΔSPm ) 仍然与 OsRACK1A 相互作用并减少了 OsRACK1A 和 OsRBOHB 之间的相互作用（补充图 10C和 10D）。与野生型 UvCBP1 ΔSP类似，UvCBP1 ΔSPm突变体显着抑制由 OsRACK1A–OsRBOHB 模块促进的 ROS 产生. 这些数据表明 UvCBP1 可能具有劫持几丁质和 OsRACK1A 的两个独立功能。

图 5。UvCBP1 与 OsRACK1A 和 OsRBOHB 的相互作用竞争以减弱 ROS 的产生。(A) Y2H 测定。测试了 OsRACK1A 及其截短版本 WD1-2 和 WD3-7 与 UvCBP1 ΔSP和 OsRBOHB (OsRBOHB N )的 N 末端的相互作用。(B)竞争性 LCI 测定。OsRBOHB 的 N 末端 (cLUC-OsRBOHB N ) 和 OsRACK1A-nLUC在本塞姆氏烟草中与/不与 UvCBP1 ΔSP一起共表达。(C)竞争性 coIP 分析。OsRACK1A-4×HA 和 3×FLAG-OsRBOHB在水稻原生质体中与/不与 UvCBP1 ΔSP -4×HA共表达。使用抗 FLAG 亲和凝胶进行 IP，然后使用 FLAG 或 HA 抗体进行蛋白质印迹分析。(D) ROS 测定。3×FLAG-OsRBOHB 和/或 OsRACK1A-eYFP在本塞姆氏烟草中与 UvCBP1 ΔSP或 eYFP共表达。对叶盘进行几丁质诱导的 ROS 爆发的测量。

3.6 OsRACK1A的表达水平与水稻种质中的稻曲病抗性相关

为了寻找可能抵抗 UvCBP1 靶向并赋予假黑穗病抗性的OsRACK1A天然等位基因，我们使用 RiceVarMap v.2.0 数据库 ( http://ricevarmap./ )分析了 4700 多个水稻品种中OsRACK1A的变异。我们在OsRACK1A基因区域发现了 25 个 SNP，其中 7 个 SNP 位于编码区域（图 6 A ）。使用这七个 SNP 进行单倍型分析，我们检测到四种主要单倍型，但没有一个导致氨基酸变化（图 6A ）。相比之下，OsRACK1A的 2.5-kb 启动子序列拥有 81 个 SNP 和 9 个插入或缺失（插入缺失）（图 6 A)。这些数据表明 OsRACK1A 蛋白是高度保守的，这一事实可能被U. virens用于免疫调节，并且OsRACK1A可能在转录水平处于动态调节之下。

我们想确定OsRACK1A的表达水平是否与假黑穗病抗性相关。为此，我们评估了从我们的种质资源库中选出的一部分水稻的田间抗黑穗病抗性（Huang 等人，2016 年；Qin 等人，2021 年）。我们发现像 Nipponbare、Lemont 和 Yahui2115 这样的水稻种质对假黑穗病具有抗性，而 Digu、9311 和 Pujiang6 表现出中度到高度的敏感性（补充表 1）。然后我们在孕穗后期检查了这些水稻种质小穗中OsRACK1A 的表达，这被认为是U. virens感染的关键时间点 ( Fan et al., 2016)). 结果表明，抗性水稻种质的OsRACK1A表达水平往往高于易感种质（p = 0.0466；图 6 B）。

接下来我们打算确定OsRACK1A启动子中的哪些顺式元件可能与OsRACK1A表达和假黑穗病抗性相关。我们从上述水稻种质中通过 PCR 和测序或从 RiceRC 数据库中检索它们获得了OsRACK1A启动子序列 ( Qin et al., 2021 )。我们发现五个 SNP 和一个结构变异（SV；一个 7873-bp 插入缺失）与假黑穗病抗性显着 (p < 0.001) 相关。具体而言，SV 位于OsRACK1基因区域上游的 −329 bp，而五个 SNP 位于 −674 和 −2151 bp 之间。我们预计 SV 可能会极大地影响OsRACK1A的表达和假黑穗病抗性。然后我们设计了两对引物来检测水稻种质中的 SV，发现在大多数易感水稻品系中检测到 7873-bp 插入，但在抗性水稻品系中未检测到（图 6 C 和补充图11 B ）。这些数据表明，启动子中的大量插入可能会降低OsRACK1A 的表达，从而导致对假黑穗病的易感性或抗性降低。

为了验证 SV、 OsRACK1A表达和假黑穗病抗性之间的关联，我们使用了来自易感水稻 (Pujiang6) 和抗性水稻 (Yahui2115) 的重组自交系 (RIL) 群体。7873-bp 插入存在于Pujiang6 的OsRACK1A启动子中，但不存在于 Yahui2115 中（补充图 11 B）。与蒲江6号相比，亚辉2115在感染U. virens的小穗中表现出更高的OsRACK1A表达、H 2 O 2积累和防御基因表达（补充图11 D-11G）。在 Pujiang6/Yahui2115 RIL 种群中（补充图 12），Yahui2115 型品系（无 7873-bp 插入）表达的OsRACK1A RNA 水平（p = 5.63E-09）显着高于 Pujiang6 型品系（有 7873-bp 插入）。雅惠2115型品系在水田试验中的病穗率和黑穗病指数均低于浦江6型品系（图6D -6F）。

我们还使用了来自水稻种质 9311（受体，具有 7873-bp 插入）和日本晴（供体，没有 7873-bp 插入）的染色体片段替换系 (CSSL) 来确认 SV、OsRACK1A表达和假黑穗病抗性（图 6 G ）。9311 的小穗的OsRACK1A表达水平低于日本晴小穗（图 6 H ）；9311 也表现出比日本晴更低水平的假黑穗病抗性，具有更高的病穗率、更多的U. virens生长和更低的 H 2 O 2积累和防御基因表达（图 6 I-6K）。与 9311 相比，CSSL 系 9311 CSSL−Nip具有显着增强的假黑穗病抗性和防御反应以及升高的OsRACK1A表达（图 6 H-6K ）。这些数据表明OsRACK1A表达水平与花对假黑穗病病原体的防御相关，并且OsRACK1A启动子中的 SV 强烈影响其转录水平。

图 6。OsRACK1A的表达水平与水稻种质中的假黑穗病抗性相关。(A) OsRACK1A的自然变异。显示的是RiceVarMap v.2.0 数据库（http://ricevarmap./）中 4700 多个水稻种质中OsRACK1A基因的多态性分析。(B) OsRACK1A在对稻曲病具有不同敏感性的水稻种质小穗中的表达。对一部分水稻种质资源进行了田间抗稻曲病抗性评估。在晚稻孕穗期收集水稻小穗用于 qRT-PCR 分析。(C)在包括浦江6 和 9311（补充图 11 B）在内的五个水稻种质中，在OsRACK1A基因区域上游 -329 bp 处检测到 7873 bp 的插入，但在 ( B ) 中使用的其他水稻种质中没有。用于基因分型的引物位置用箭头表示。(D) OsRACK1A在源自浦江 6 号和雅辉 2115 杂交的重组自交系 (RILs) 中的表达。RIL 分为两组：插入的 Pujiang6 型 (n = 52) 和未插入的 Yahui2115 型 (n = 36)。OsRACK1A表达水平标准化为参考基因OsUbi 。(E 和 F) Pujiang6 型和 Yahui2115 型 RIL 被评估为假黑穗病。(G)日本晴 (Nip)、9311 和源自 9311 和 Nip 的 CSSL 系的基因分型。使用两对引物来确定OsRACK1A启动子处是否存在插入；管家基因OsUbi用作对照。(H) Nip、9311 和 CSSL 系 9311 CSSL−Nip中OsRACK1A的 qRT-PCR 分析。9311中的OsRACK1A表达设置为1作为对照。(I) Nip、9311 和 9311 CSSL−Nip感染U. virens分离株 PJ52 的疾病表型。在患病的圆锥花序中形成黄色的假黑穗病球。(J)每圆锥花序的患病小穗。(G) U. virens在 6 dpi 时的生长。

3.7 提高 OsRACK1A 丰度抵消了 UvCBP1 的竞争效应

我们接下来研究了增加OsRACK1A表达如何抵消 UvCBP1 的毒力功能。竞争性 coIP 测定显示 3×FLAG-OsRBOHB N与更多的 OsRACK1A-eYFP 蛋白共免疫沉淀，同时 OsRACK1A 的表达增加，伴随着更强的几丁质诱导的 3×FLAG-OsRBOHB N磷酸化（图 7A）。与植物 RBOHB 磷酸化在 ROS 产生中的重要作用一致，我们发现几丁质诱导的 ROS 强度与 OsRBOHB 磷酸化水平呈正相关（图 7A 和 7B）。这些数据表明，增加 OsRACK1A 的量会抵消 UvCBP1 的竞争效应并恢复 OsRACK1A–OsRBOHB 关联以促进 ROS 爆发。

我们想确定 OsRACK1A 是否对 ROS 生产中的 OsRBOHB 调节很重要。为此，我们首先确定了 OsRACK1A 和 OsRBOHB 的相互作用域。在 LCI 测定中，OsRACK1A 仅与 OsRBOHB 的 N 末端（1-355 个氨基酸 [aa]）相互作用，这与之前在酵母中的数据一致（Nakashima 等人，2008 年）。OsRACK1A 的 WD1 和 WD2 结构域与 OsRBOHB N相互作用，而同时删除 WD1 和 WD2 (DelWD1-2) 消除了 OsRACK1A 与 OsRBOHB N的关联（补充图 13 A）。这些结果通过 coIP 测定得到证实（补充图 13 B）。OsRACK1A 的 DelWD1-2 突变体未能促进 OsRBOHB 介导的 ROS 产生（补充图 13 C)。这些结果表明 OsRACK1A 与 OsRBOHB 相互作用以调节 ROS 的产生。

我们接下来确定了水稻中OsRACK1A表达与 OsRBOHB 磷酸化之间的关联。我们构建了过表达OsRACK1A ( OsRACK1A-OE )的转基因水稻植物（补充图 14A和 14B），并且 3×FLAG-OsRBOHB 在OsRACK1A-OE、OsRACK1A-KD和野生型植物的原生质体中瞬时表达。我们观察到几丁质诱导的 3×FLAG-OsRBOHB 磷酸化在OsRACK1A-OE中比在野生型植物中强得多，但在OsRACK1A-KD植物中显着降低（图 7C）。我们还检查了 H 2 O 2OsRACK1A-OE、OsRACK1A-KD、CR-rbohb和几丁质处理的野生型小穗中防御相关基因的积累和表达。几丁质在OsRACK1A-OE小穗中诱导的 H 2 O 2量显着高于野生型小穗（图 7 D）（图 7 D）。相比之下，与野生型相比，OsRACK1A-KD和CR-rbohb小穗中几丁质诱导的 H 2 O 2减少了 33.7%–40.0% 。防御相关基因的表达也发现了类似的趋势；几丁质诱导OsPR10b和OsBETV1的高表达在OsRACK1A-OE中，但在OsRACK1A-KD和CR-rbohb中的表达低于野生型植物。因此，OsRACK1A 的过量产生增强了 OsRBOHB 的磷酸化，从而促进了 ROS 的产生。

3.8 OsRACK1A的过表达增强了对假黑穗病的抗性而没有产量损失

我们在OsRACK1A-OE圆锥花序上接种绿弧菌，发现与野生型植物相比，OsRACK1A-OE的病小穗率降低了 53.3%–62.9% （图 7 E 和 7F）。相对U. virens生长被显着抑制约 50%（图 7 G）。OsRACK1A-OE小穗中的H 2 O 2积累和OsPR10b / OsBETV1表达显着增加（图 7 H 和补充图 14 D）。然后我们将OsRACK1A-OE与CR-rbohb交叉并检查了所得CR-rbohb OsRACK1A-OE ( CR4 OE7 ) 植物的假黑穗病抗性。CR4 OE7植物比OsRACK1A-OE和野生型植物更易感，并且在U. virens感染的小穗中显示受损的 H 2 O 2积累和防御基因表达（图 7 I-7L 和补充图 14 E-14G）。这些数据表明OsRACK1A的过表达以OsRBOHB依赖性方式提高了假黑穗病抗性。

与野生型植物相比， OsRACK1A的过表达对植物和种子形态、穗数和长度、小穗数、千粒重或谷粒产量没有显着影响。这些数据在两个不同地点的现场试验中得到验证。因此，提高OsRACK1A表达可促进水稻对U. virens 的抗性，而不会影响产量。

图 7。OsRACK1A 的过量产生促进了 OsRACK1A–OsRBOHB 相互作用、OsRBOHB 磷酸化和假黑穗病抗性。(A)竞争性 coIP 分析。在本氏烟草中，在 UvCBP1 ΔSP存在的情况下，3×FLAG-OsRBOHB N与增加量的 OsRACK1A-eYFP 共表达。IP 使用抗 FLAG 树脂进行，然后使用 FLAG、GFP 或 UvCBP1 抗体进行蛋白质印迹分析。用 Phos-tag 检测3×FLAG-OsRBOHB N的磷酸化。(B) ROS 测定。在烟草中，在 UvCBP1 ΔSP存在的情况下，3×FLAG-OsRBOHB 与增加量的 OsRACK1A-eYFP 共表达。几丁质引发后，对叶盘进行 ROS 测量。(C)水稻原生质体中 OsRBOHB 的磷酸化。3×FLAG-OsRBOHB 在 WT、 OsRACK1A - OE和OsRACK1A-KD转基因品系的原生质体中表达，并用抗 FLAG 树脂进行免疫沉淀。用磷酸-Ser/Thr 抗体检测 3×FLAG-OsRBOHB 的磷酸化。Anti-OsRACK1A 用于检测 OsRACK1A 蛋白丰度。抗热休克蛋白用于上样归一化。(D)用几丁质或水处理 48 小时的水稻小穗中H 2 O 2的定量。CR，OsRBOHB功能缺失突变体，使用 CRISPR-Cas9 技术生成。(E)感染U. virens PJ52 的OsRACK1A-OE圆锥花序的疾病表型。(F)每圆锥花序的病小穗率。(G) U. virens在 6 dpi 时的生长。(H)在 3 dpi 时量化U. virens感染的小穗中的H 2 O 2 。(I−L ) OsRACK1A-OE7和CR-rbohb-4感染的OsRACK1A-OE7圆锥花序中的病害表型 ( I )、患病小穗率 ( J ) 、U. virens生长 ( K ) 和 H 2 O 2量化 ( L )与U. virens PJ52。(M)一个拟议模型说明了 UvCBP1 介导的毒力和 OsRACK1A 促进的耐药性。U. virens将 UvCBP1 分泌到水稻花细胞中以靶向 OsRACK1A 并战胜 OsRACK1A–OsRBOHB 相互作用以抑制宿主 ROS 的产生并促进感染。相反，OsRACK1A 的过量产生中和了 UvCBP1 竞争以恢复 OsRACK1A-OsRBOHB 结合并通过未知蛋白激酶增强 OsRBOHB 磷酸化，从而导致 ROS 产生增强和假黑穗病抗性。PM，植物质膜。

结论

在这项研究中，我们研究了先前报道的U. virens效应子 UvCBP1 的植物内定位和宿主靶点。免疫荧光和免疫金分析显示 UvCBP1 作为作用于水稻花细胞的细胞质效应子。酵母双杂交 (Y2H) 筛选将支架蛋白 OsRACK1A 鉴定为 UvCBP1 的宿主靶标，它通过干扰 OsRACK1A–OsRBOHB 相互作用来抑制水稻花的免疫力。似乎缺乏逃避 UvCBP1 靶向的天然 OsRACK1A 蛋白质变体，但 OsRACK1A 的结构变异启动子与其表达水平和假黑穗病抗性相关。OsRACK1A 水平的升高通过恢复 OsRACK1A–OsRBOHB 相互作用抵消了 UvCBP1 的毒力作用，进而增强了对假黑穗病的抗性。这些发现提出了通过利用植物和病原体之间的军备竞赛来工程化对U. virens等顽固病原体的抗性的原理。