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三角梅‘伊娃夫人’的繁育体系研究

花匠小妙招
2024-12-02 07:15

0 引言

三角梅属是紫茉莉科的常绿藤状观花灌木[1]，因苞片色彩丰富、花期长、易种养等而深受人们喜爱。现今全世界约有1000多个品种，在中国也有近400个品种[2]。其引入国内最早可以追溯到1872年，至今已有150多年的历史[3]，主要分布在福建、台湾、广东、广西、云南、四川等南方地区[4]。目前，国内三角梅属的研究主要集中在种质资源分类[5⇓-7]、扦插[8⇓-10]、园林应用[11⇓-13]、花期调控[14-15]、栽培管理[16]等方向，其品种选育工作较为落后[17-18]。近年来，随着其产业化高峰的到来，三角梅已成为国内发展最快的木本花卉之一[2]，开展三角梅品种开花特性和繁育系统相关研究，对于构建三角梅杂交育种体系及其新品种选育具有重要意义。

‘伊娃夫人’(Bougainvillea glabra ‘Mrs Eva’)是市场上常用的三角梅品种，其品种特性优良，耐热性好、易于栽培、花色艳丽且花期长，盛花期可达到见花不见叶的效果，具有极高的观赏价值，无论用于家庭园艺观赏还是园林绿化装饰都十分适合。但结实率较低、品种选育工作落后限制了其在种质创新中的价值。究其原因主要是该品种的繁育体系研究不够系统和深入，尚未建立适合的杂交育种体系。本研究系统探究‘伊娃夫人’的开花物候、花粉活力、花粉离体萌发率及繁育系统，以期构建更适合‘伊娃夫人’的杂交育种体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以广州市林业和园林科学研究院白云苗圃三角梅研究中心的三角梅‘伊娃夫人’为试材，选择生长健壮、无病虫害植株进行观察和研究。

1.2 开花物候观察

2021年4—5月在广州市林业和园林科学研究院白云苗圃三角梅研究中心基地大棚连续观察记录三角梅‘伊娃夫人’的第一朵花开花日期、最后一朵花的凋谢日期、单花开放持续时间、群体花期等指标。

1.3 花部形态特征和开花动态观察

利用Canon EOS700D相机拍照记录‘伊娃夫人’的开花过程，包括初花期、始花期、盛开期及衰败期（初花期为三角梅3个花苞片已分开但未展开；始花期为苞片还未完全展开，星花均未开放；盛花期为绝大多数星花已开，苞片全部展开；衰败期为星花萎缩闭合，苞片颜色变淡）[19]，同时对其花器官形态进行剖解观察。

1.4 花粉特性及离体萌发率的测定

1.4.1 花粉形态的测定

取3朵盛开的花，用镊子剥下花粉装入1.5 mL离心管中，加入300 μL 1%六偏磷酸钠溶液，在漩涡震荡器上震荡混匀，吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片。在Nikon eclipse 80i正置荧光显微镜明场下观察花粉粒二维形态，同时测量花粉直径。每个处理重复3次，每次观察3个视野，每个视野随机测量10粒花粉直径。

1.4.2 单药花粉量与花粉活力的测定

于上午8:00各取3朵当天即将开放的花蕾带回实验室，用镊子取下花药，分别装入200 μL离心管中，放置在干燥箱中常温干燥24 h，待花粉完全散出。加入60 μL 1%六偏磷酸钠溶液，在漩涡震荡器上混匀，将混匀后的悬浮液滴在血球计数板上，盖上盖玻片，此时，计数室内混合液的总体积为0.1 μL。在光学显微镜下统计血球计数板所有计数室内的花粉粒总数，每个处理重复3次，每次重复计数2次取平均值。单个花药的花粉量计算见式（1）。

式中，分母中数字8指三角梅单个花被管内的花药数。

采用FDA染色法进行花粉活力的测定。于上午8:00采摘开花后1~3 h的花朵带回实验室，用镊子取下花药，装入1.5 mL离心管中。往离心管中加入250 μL 0.01%的FDA染色液，在漩涡震荡器上震荡混匀，28℃避光5 min。用200 μL移液枪吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，用Nikon eclipse 80i正置荧光显微镜进行观察，在明场下统计视野内的花粉粒总数，在蓝色激发光下观察具有活力的花粉粒数。在蓝色激发光环境下，有活力的花粉会发出荧绿色荧光，无活力的花粉无荧光。每次进行拍照保存，记录名称等信息。每个重复取3个视野，每个视野花粉粒总数不少于20粒。

统计每个视野花粉活力[式（2）]计算平均值，作为花粉活力评价指标。

1.4.3 花粉离体萌发率的测定

花粉萌发率的测定采用液体培养基萌发的方法[20]，培养基配方为300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O+100 mg/L H3BO3+200 mg/L MgSO4·7H2O+100 mg/L KNO3+200 g/L蔗糖。试验设置15、20、25、28、30、35℃等6个温度处理。在盛花期采集适量‘伊娃夫人’花药，将花药用镊子剥下装入1.5 mL离心管中，加入250 μL培养液，在漩涡震荡器上混匀，让花粉充分散开。然后用移液枪吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上，将载玻片置于放有湿纸巾的一次性灭菌塑料培养皿中，盖上培养皿盖子，置于不同温度培养箱中离体培养12 h。在Nikon Eclipse E200正置显微镜下观察记录花粉粒总数及萌发数（花粉管大于或等于花粉粒直径判定为花粉萌发），计算花粉萌发率[式（3）]。每个处理重复3次，每次取3个视野，每个视野内花粉数不少于20粒。

1.4.4 花粉萌发群体效应

于上午9:00左右采集‘伊娃夫人’刚盛开的花朵带回实验室，将所有花朵分为A、B、C、D 4个处理，其中A组1朵花、B组3朵花、C组5朵花、D组8朵花，进行花粉群体萌发效应的测定。

将花药用镊子剥下装入1.5 mL离心管中，加入250 μL培养液，在漩涡震荡器上混匀，让花粉充分散开。然后用100 μL移液枪吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上，将载玻片置于放有湿纸巾的一次性灭菌塑料培养皿中，盖上培养皿盖子，置于28℃培养箱中离体培养12 h。在Nikon Eclipse E200正置显微镜下观察记录花粉粒总数及萌发数（花粉管大于或等于花粉粒直径判定为花粉萌发），计算花粉萌发率。每个处理重复3次，每次取3个视野，每个视野内花粉数不少于20粒。

1.5 繁育系统的确定

1.5.1 花粉量与胚珠比的估算

按1.4.2的方法测定三角梅的单花花粉量，胚珠用苯胺蓝染色法处理后[21]，在荧光显微镜下观察并计数。采用Cruden[22]的标准估算三角梅的花粉量与胚珠比(pollen-ovule ratio，P/O)，从而判定其繁育系统类型。

1.5.2 杂交指数的估算

对三角梅‘伊娃夫人’花（花序）直径、花药开裂和柱头可授性的时间分离、柱头与花药的空间定位进行观测。依据Dafni[23]的标准估算三角梅的杂交指数(out crossing index，OCI)，从而判定其繁育系统类型。

1.6 人工杂交试验

以三角梅‘伊娃夫人’为母本、三角梅‘小叶紫’为父本进行杂交试验。（1）对照为‘伊娃夫人’进行不套袋、不去雄处理，使其自由授粉，检测自然条件下的传粉情况。（2）对‘伊娃夫人’进行去雄、套袋、不授粉处理，检测是否有无融合生殖。（3）在‘伊娃夫人’开花前用纸袋套住，不去雄，使其自然授粉，检测是否需要传粉者。（4）对‘伊娃夫人’进行去雄套袋处理，人工授其自身的花粉，检测是否自交亲和。（5）去掉‘伊娃夫人’的雄蕊，人工授‘小叶紫’的花粉，套袋，检测是否为自交不亲和。根据结实数与试验数的比值，统计结实率。

1.7 数据处理

采用SPSS V26.0进行试验数据统计和方差分析，用WPS Office v11.19.0软件进行数据记录，并进行制图。

2 结果与分析

2.1 开花物候观察

由表1可知，‘伊娃夫人’群体花期约45 d，花序上的花朵陆续开放，单朵花持续开放时间约为2~3 d。

表1 2021年‘伊娃夫人’花期记录 组别第一朵花现蕾日期
（月-日）最后一朵花凋谢日期
（月-日）花期/
d 单花现蕾日期
（月-日) 单花盛开期
（月-日) 单花凋谢日期
（月-日) 单花开放天数/
d 1 4-1 5-3 32 4-3 4-15 4-17 2 2 4-1 5-16 45 4-3 4-19 4-21 2 3 4-1 5-5 34 4-3 4-23 4-26 3

2.2 花部形态特征及开花动态观察

对处于盛花期的‘伊娃夫人’花序进行分解（图1），可清晰地看见整个聚伞形花序是由3个苞片组成的，花梗与苞片中脉贴生，每个苞片上生1朵花，苞片呈椭圆形，紫色，苞片上可看见清晰的叶脉，沿着苞片中部主脉向外展开；花被管着生于苞片中下部，其结构特殊，呈圆筒状，长约2.0 cm，中上部皱缩，两端膨大；真正的花瓣则位于花被管顶端，颜色黄绿色。柱头与花药分离，柱头在花药下方，雄蕊一般为8个，内藏，花丝基部合生，子房具柄连接着柱头。

图1 ‘伊娃夫人’花部形态特征

1A.一级聚伞花序，1B.一花一苞，1C.花被管，1D.苞片，2P.花被，2A.花药，2Pi.雌蕊，2O.子房，3St.雄蕊

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跟踪记录‘伊娃夫人’开花过程，其初花期苞片主色呈绿色，3个苞片呈闭合状态，苞片长0.2~0.5 cm。约10 d后进入始花期，苞片颜色逐渐变为紫色，且越来越深，同时，花被管也变为紫色，苞片变大，花被管变长，苞片长1.8~2.2 cm、宽1.5~2.0 cm。再过约2 d后进入盛花期，此时，苞片充分展开，星花逐渐开始绽放，当第1朵花开放时，其余2朵花顶部开始破裂，随后依次盛开。苞片颜色变为深紫色，花被管也变为紫色，星花为黄绿色，花朵中间能够看见黄色的雄蕊，苞片长2.5~2.9 cm、宽2.0~2.2 cm，花被管长1.8~2.1 cm。三角梅星花在完全盛开的情况下，其形状是一个规则的正五边形，直径0.6~0.7 cm。盛开后的花在持续2~5 d后陆续进入衰败期（图2）。整个聚伞花序依次开花到依次凋谢，约历时15 d。衰败期的苞片开始逐渐褪色，由深紫色变为浅紫色，直至颜色全部褪去变为灰白色即彻底枯萎；星花皱缩闭合，花被管开始向下卷曲，其中部皱缩到一起，呈两边大中部小的状态。

图2 ‘伊娃夫人’开花过程观察

A.初花期，B.始花期，C.盛花期，D.衰败期

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2.3 花粉特性及离体萌发的测定

2.3.1 花粉形态观测

由图3可知，‘伊娃夫人’花粉形状为圆形或椭圆形，花粉直径为20~30 μm。平面视野下萌发沟不易发现。在100倍视野下，可清晰看见花粉外表面较为粗糙，网面纹路，纹路间存在黄色颗粒状物质。

图3 ‘伊娃夫人’的花粉形态

A.放大10倍，B.放大40倍，C.放大100倍

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2.3.2 单药花粉量与花粉活力

‘伊娃夫人’单药花粉粒约为1375粒，花粉活力为13.98%。

2.3.3 花粉离体萌发率

6个温度处理中，28℃最适宜‘伊娃夫人’花粉萌发，萌发率为5.66%；其次为30℃，萌发率为5.13%；低温或高温均不利于其花粉萌发，当环境温度为15℃时，花粉萌发率为4.40%；温度为35℃时，花粉萌发率显著降低，为2.45%，显著低于其他处理组（图4）。

图4 温度对‘伊娃夫人’花粉离体萌发率的影响

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2.3.4 花粉群体萌发效应

由2.3.2的结果可知‘伊娃夫人’单花药的花粉量为1375粒，完整的一朵花则有花粉量为11000粒，从而推算出3、5、8朵花的花粉量依次为33000、55000、88000粒。将这些花粉放入250 μL的培养液中则可得出其花粉密度分别为44000、132000、220000、352000粒/mL。由图5可知，花粉密度为132000粒/mL，即3朵花时离体萌发率最高，为3.75%；而当花粉密度为352000粒/mL时，花粉活力最低，为1.21%。经统计分析（表2）发现，当花粉密度为132000粒/mL，花粉离体萌发率显著高于其他3个处理；花粉密度为44000、220000粒/mL 2个处理间无显著差异；花粉密度为352000粒/mL显著低于其他处理。可见，花粉数量对‘伊娃夫人’的花粉萌发有影响，说明伊娃夫人花粉存在群体萌发效应。

图5 花粉密度对‘伊娃夫人’花粉离体萌发率的影响

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表2 ‘伊娃夫人’花粉群体萌发率 花粉密度/（粒/mL）萌发率/% 44000 2.63±1.72ab 132000 3.75±1.99a 220000 2.31±1.61ab 352000 1.21±1.10b注：不同小写字母表示0.05水平差异显著，字母相同表示差异不显著。

2.4 ‘伊娃夫人’繁育系统的确定

2.4.1 花粉量与胚珠比的估算

‘伊娃夫人’单花花粉量为11000粒，而其胚珠包被在子房内，在显微镜下观察到其只有一个胚珠（图6）。通过计算得出‘伊娃夫人’的花粉量与胚珠比为11000，按照判定其繁育系统为专性异交类型(obligate xenogamy)。

2.4.2 杂交指数估算

‘伊娃夫人’的星花直径为0.67 cm，参照Dafni[23]的标准记为3。通过前期杂交试验得出，雌蕊在散粉之前就具有可授性，因此判断其雌蕊先熟，记为0。其雌蕊和雄蕊在结构上空间分离，且雄蕊一直高于雌蕊，记为1。因此，得出其杂交指数为4，判定其繁育系统主要为异交类型，需要传粉者。

2.5 人工杂交试验

由表3可知，自然条件下不去雄、不套袋，任其自由授粉，结实率为0%，说明其自然结实率低，特殊的花结构有可能阻碍部分昆虫的授粉，同时也阻碍了风媒传粉。通过去雄、套袋不授粉的方式结实率为0%，说明‘伊娃夫人’不存在无融合生殖的情况。在开花之前套袋，能够断绝三角梅花粉或柱头与外界的接触，其结实率也为0%，说明‘伊娃夫人’授粉需要传粉者。去雄后进行自花授粉，套袋的试验结实率为0%，说明‘伊娃夫人’不存在自交亲和现象。去雄后，人工异株异花授粉的结实率很低，仅为3.8%，但能够说明‘伊娃夫人’存在自交不亲和，同时需要传粉者。

表3 ‘伊娃夫人’套袋及人工授粉试验结果 授粉方式试验数结实数结实率/% 不套袋、不去雄自然授粉 132 0 0 去雄、套袋不授粉 87 0 0 开花前套袋、不去雄 68 0 0 去雄、套袋、人工自花授粉 100 0 0 去雄、套袋、人工异株异花授粉 152 2 3.8

3 讨论与结论

3.1 ‘伊娃夫人’的开花物候及花部形态特征

植物的开花物候和花部形态特征是植物适应生长环境的一种进化策略，且植物的花部特征、传粉特性和繁育系统是相互适应的[24-25]。三角梅‘伊娃夫人’群体花期约45 d，单个聚伞型花序花期持续时间约为15 d，单朵花持续开放时间为2~3 d，同一植株不同部位不同花序上的花呈连续性开放，一定程度上相对延长了“花粉寿命”，这种特性能够保证植物传粉受精过程延长从而确保生殖成功，是一种典型的利于异交的进化机制。‘伊娃夫人’花被管呈圆筒状，其中上部皱缩，两端膨大，这样的特殊结构对大多数昆虫来说“难进难出”，因此虫媒传粉的昆虫类型被大幅缩小，花粉不能有效地传递到柱头上可能是导致其结实率低的原因之一。在自然界中，植物为了保证遗传多样性，通常会通过雌雄异熟、雌雄异位、自交不亲和等方式来确保异花授粉成功，以保证其后代能够更好地适应环境[26]。‘伊娃夫人’雄蕊位于雌蕊的上方，在空间上分离，说明其具有异花授粉的条件，且拥有适应环境的进化能力，但其特殊的花被管结构一定程度上阻碍其授粉结实，影响其结实率。

3.2 ‘伊娃夫人’的花粉特性及离体萌发率

花粉是高等植物的雄配子体，也是杂交育种最基本的材料之一[27]。花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力[28]。本研究发现‘伊娃夫人’花粉粒呈圆形或椭圆形，花粉直径为20~30 μm，花粉粒表面有网状纹路，纹路之间有黄色的颗粒状物质。‘伊娃夫人’花粉活力为13.98%，最佳萌发率为5.66%，花粉活力较低或许是导致三角梅结实困难的原因之一。其单个花药的花粉量约为1375粒，花粉萌发具有群体效应。适宜‘伊娃夫人’花粉离体萌发的温度为28℃，温度太高或太低均不利于其萌发，温度大于35℃会显著抑制其花粉萌发。本研究在进行花粉离体萌发率测定时培养时间均为12 h，而培养时间对花粉萌发存在一定影响，后续可继续研究最适合其萌发的培养时间。

3.3 ‘伊娃夫人’的繁育系统

花粉/胚珠比和杂交指数广泛用于植物繁育系统的研究[29-30]。‘伊娃夫人’花粉量与胚珠比为11000，判定其繁育系统为专性异交类型；杂交指数为4，判定其繁育系统主要为异交类型，部分自交亲和，需要传粉者；结合田间套袋及人工授粉试验，结果表明‘伊娃夫人’繁育系统倾向于异交类型，3种检测方法基本一致。过度的近交和远交都会导致繁育系统适合度的下降，中间程度的杂交及混合交配系统为最适合交配方式[31]。事实上，自然界中纯粹的自交和异交物种均很少见，大多数异交植物可以自交授粉，而大多数自交植物也可以异交[32]。这种以异交为主要的繁殖方式是三角梅物种进化的结果。本研究人工杂交试验选择品种太少，以至于未获得理想的结实效果，后续研究中需增加品种种类和数量。

探明三角梅‘伊娃夫人’的花粉特性和繁育系统类型，可通过人工有目的地选择花粉活力高或柱头可授性强且亲缘关系较远的品种进行杂交，以达到提高结实率的目的。杂交后代可通过扦插等无性繁殖方式快速扩大种群规模，获得遗传性状稳定的优良株系。利用有性与无性繁殖方式互补的特性对三角梅属植物有性杂交创新种质和无性繁殖扩大优异种质种群具有重要的生产实践意义。

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