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毛蕊花糖苷的生物合成研究进展

花匠小妙招
2024-12-03 19:46

苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides, PhGs)类化合物是一类由各种糖基修饰的植物次生代谢产物,具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等重要的生物活性[1]。苯乙醇苷广泛存在于双子叶植物中,到目前为止,已从植物中分离出多种苯乙醇苷化合物,如肉苁蓉苷C、管花苷B和毛蕊花糖苷等(图1a)。分子结构显示,苯乙醇苷以β-D-吡喃葡萄糖为中心糖核,由乙酰基、咖啡酰基、阿魏酰基、香豆酰基、桂皮酰基和香草酰基为侧链,由鼠李糖、阿拉伯糖、芹糖、葡萄糖和半乳糖等不同糖基修饰,具有丰富的结构多样性。根据糖苷数量不同,可将苯乙醇苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷和四糖苷[2](图1c)。毛蕊花糖苷(acteoside, ACT)是苯乙醇双糖苷的典型代表,其结构由咖啡酸(caffeic acid, CA)、羟基酪醇(hydroxytyrosol, HT)、葡萄糖以及C3位修饰的鼠李糖组成,具有抗炎、抗菌、抑制HIV-1逆转录酶、抗肿瘤和抗氧化等作用,对神经系统损伤修复、消化系统调节、免疫系统调节等具有重要保护作用,在新药开发领域具有巨大潜力和经济价值[1]。

图1 毛蕊花糖苷的结构和含量分布

Fig.1 The structure and content distribution of acteoside

(a) Phenylethanoid glycosides and its derivatives (b) Content distribution of acteoside in different varieties (c) Common substituents of phenylethanoid glycosides

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毛蕊花糖苷主要存在于马鞭草科、苦苣苔科、唇形科、玄参科、木犀科、列当科、木通科和车前科等200多种植物的根、茎、叶和花中[3],由于受植物自身生物合成能力以及种属、产地、栽培、采收条件的不同,毛蕊花糖苷在植物体中的含量存在显著差异[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],如在具有“沙漠人参”之称的列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma)中,管花肉苁蓉中平均含量可达到4.75%,而在荒漠肉苁蓉和沙苁蓉中的平均含量相当,仅为0.23%[9](图1b)。目前利用化学法合成毛蕊花糖苷时[14],存在合成路线长、副反应多、手性拆分烦琐、收率低和成本高等问题,因此植物提取来源的毛蕊花糖苷仍占据市场主导地位。但由于植物中含量较低,且提取工艺复杂,加之植物生长周期较长,受到气候环境等因素影响较大,无法为天然产物提取提供稳定的原料来源,极大地限制了其大规模生产。

利用合成生物学,对天然产物的合成进行理性设计与改造,有望为人类面临的资源、环境等领域重大挑战提供新的解决方案。如从自然界中大规模挖掘新的酶蛋白元件,通过改造大幅提高酶蛋白的通量与效率;将不同来源的生物合成相关的代谢途径元件化、模块化组装最终构建高效的微生物细胞工厂。目前已经成功实现了萜类、黄酮、生物碱、皂苷等多种天然产物的生物合成和转化[15],而对于苯乙醇苷类化合物,微生物合成其关键前体(如咖啡酸、羟基酪醇、酪醇和红景天苷等)已有相关报道,但由于毛蕊花糖苷合成的关键元件和途径尚未完全解析,主要是下游酰基转移和糖基修饰途径中的酰基转移酶和鼠李糖基转移酶尚未报道,酰基化和鼠李糖基化的催化顺序也尚未得到验证,使得毛蕊花糖苷的生物合成研究受阻。本文将从苯乙醇苷生物合成关键代谢途径解析、关键基因元件挖掘和优化、关键前体物的合成等方面介绍苯乙醇苷的研究现状,并对当前存在的问题和未来的发展趋势进行探讨,以期为毛蕊花糖苷细胞工厂的构建提供依据。

1 毛蕊花糖苷生物合成途径解析

1.1 苯丙氨酸代谢途径

目前,毛蕊花糖苷大致的生物合成潜在代谢模块已基本取得共识,主要包括苯丙氨酸代谢途径、多巴胺途径/酪胺途径以及下游酰基转移和糖基修饰的交叉途径。已有研究表明毛蕊花糖苷合成的中间体包括咖啡酸、咖啡酰基辅酶A、羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷[16,17,18]。体外水解实验证明,毛蕊花糖苷在糖苷水解酶的作用下水解为咖啡酸、去鼠李糖基毛蕊花糖苷(木通苯乙醇苷A)和去咖啡酰基毛蕊花糖苷[19,20]。温度、光照和pH等因素对毛蕊花糖苷稳定性影响的研究表明,毛蕊花糖苷在溶液中可降解为咖啡酸和去咖啡酰基毛蕊花糖苷[21]。动物喂食实验表明,大鼠尿液中毛蕊花糖苷的水解产物为羟基酪醇和咖啡酸[22]。在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸首先在苯丙氨酸解氨酶(PAL)作用下转化为肉桂酸,肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(C4H)作用下将苯环C4位生成为对香豆酸,接着香豆酸3-羟化酶(C3H)催化其生成咖啡酸[3]。此外,来源于放射糖丝菌的酪氨酸解氨酶(TAL)可将酪氨酸转化为对香豆酸,对香豆酸在C3H催化下生成咖啡酸,这为异源合成咖啡酸提供了新思路[23]。

1.2 多巴胺途径/酪胺代谢途径

多巴胺途径/酪胺途径的中间体酪醇和羟基酪醇是毛蕊花糖苷生物合成的另一关键前体,二者可通过不同路径生成毛蕊花糖苷的前体物质红景天苷或羟基酪醇葡萄糖苷,该途径是毛蕊花糖苷生物合成过程的重要的分支途径(图2b)。酪氨酸在多酚氧化酶(PPO)/酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)的作用下生成L-多巴,多巴脱羧酶(DODC)/酪氨酸脱羧酶(TyDC)催化L-多巴产生多巴胺,之后在伯胺(含铜)氧化酶(CuAO)和醇脱氢酶(ALDH)作用下生成羟基酪醇[16-18,24-25]。在另一支路,多巴胺经伯胺(含铜)氧化酶(CuAO)/单胺氧化酶(MAO)催化后生成3,4-DHPAA。Vavricka等[26]利用来源于家蚕中具有醛合酶和脱羧酶双功能的羟苯基乙醛合成酶(DHPAAS)催化L-多巴生成3,4-DHPAA,之后ALDH催化3,4-DHPAA生成羟基酪醇[24]。

图2 毛蕊花糖苷的生物合成途径解析

Fig.2 The biosynthetic pathways of of acteoside

(a)Phenylalanine metabolic pathway (b) Dopamine pathway/Tyramine pathway and enzymatic crossover pathway (c) Acyltransferase and glycosyltransferase catalytic pathway.PAL: Phenyl ammonia lyase; C4H: Cinnamate 4-hydroxylase; C3H: Coumarate 3-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate coenzyme ligase; TyDC: Tyrosine decarboxylase; ALDH: Alcohol dehydrogenase or arylalchohol dehydrogenase; 4HPAR: 4-hydroxyphenylpyruvate reductase; 4HPAAS: 4-hydroxyphenylacetaldehyde synthase; DHPAAS: 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde synthase; MAO: Monoamine oxidase; TYO: Tyramine oxidase; CuAO: Copper amine oxidase; PPO: Polyphenol oxidase; TLH: Tyramine/tyrosol hydroxylase; TH: Tyrosine hydroxylase or tyrosine-3-monooxygenase; DODC/DDC: Amino acid decarboxylase or dopa decarboxylase; TAL: Tyrosine ammonia lyase; TAT: Tyrosine aminotransferase; HPPADC: 4-hydroxyphenylpyruvate decarboxylase; 4HPAAS: 4-hydroxyphenylacetaldehyde synthase; HCT: Quinine hydroxycinnamyl transferase; UGT: UDP-glucose glucosyltransferase;URT: UDP-rhamnose glucosyltransferase

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酪胺通路可为毛蕊花糖苷生物合成途径提供酪醇或羟基酪醇前体。酪氨酸通过TyDC催化形成酪胺,酪胺被CuAO/酪胺氧化酶(TYO)氧化为4-羟基苯基乙醛(4-HPAA),4-HPAA可被4-羟基苯乙醛还原酶(4HPAR)/ALDH还原为酪醇,然后酪醇在酪醇羟化酶(tyrosol hydroxylase, TLH)催化下生成羟基酪醇[16-17,24,27-28]。由于TyDC、TYO和ALDH具有杂泛性,所以研究者提出其他酪胺合成途径的假设,即酪氨酸在TyDC的脱羧作用下生成酪胺,之后酪胺在TH的作用下生成多巴胺,多巴胺被TYO氧化为3,4-DHPAA,之后被ALDH还原为羟基酪醇,但是该假定途径中的TH并未得到验证[28]。还有学者假设多酚氧化酶(PPO)可以催化酪胺生成多巴胺,以及羟基化红景天苷生成羟基酪醇葡萄糖苷,但其功能也未得到验证[16,17,18]。

迷迭香酸是一种天然存在的多酚化合物,研究表明酪氨酸转氨酶(TAT)是迷迭香酸合成过程中酪氨酸衍生途径中的第一个酶,它催化酪氨酸转氨生成4-羟基丙酮酸(4-HPPDC),之后在4-羟基苯基丙酮酸脱羧酶(HPPADC)作用下生成4-HPAA[29,30]。Torrens-Spence等[31]首次发现一种依赖于磷酸吡哆醛的羟基苯乙醛合酶(4HPAAS),它可直接催化酪氨酸转化为4-HPAA,并在该研究中确定了4HPAR和催化酪醇生成红景天苷的糖基转移酶编码基因。此外,酪氨酸可以通过TYR催化生产羟基酪醇[25]。这些酶促交叉途径中的酶都丰富了毛蕊花糖苷生物合成途径的多样性。

1.3 毛蕊花糖苷的酰基转移和糖基修饰交叉途径

从毛蕊花糖苷的结构类似物可以看出,其中心均为葡萄糖,与咖啡酰基发生酯化,C3位则由鼠李糖基进行修饰(图1a),但其酰基化和鼠李糖基化的分子催化机制研究未见报道。由毛蕊花糖苷的水解、代谢实验和化学结构等反向推测可得,毛蕊花糖苷的合成存在2种潜在可能[19,20,21,22]。首先,咖啡酰辅酶A和羟基酪醇葡萄糖苷在酰基转移酶(quinine hydroxycinnamyl transferase, HCT)作用下生成去木通苯乙醇苷A,木通苯乙醇苷A在鼠李糖基转移酶(UDP-rhamnose glucosyltransferase, URT)催化下进一步生成毛蕊花糖苷,另一潜在的途径是羟基酪醇在葡萄糖基转移酶的作用下生产羟基酪醇葡萄糖苷,羟基酪醇葡萄糖苷在URT催化下生产去咖啡酰基毛蕊花糖苷,去咖啡酰基毛蕊花糖苷最后在HCT作用下与咖啡酰辅酶A缩合生成毛蕊花糖苷(图2c)。

2 毛蕊花糖苷合成的高效调控策略

2.1 毛蕊花糖苷合成相关转录组挖掘

转录组是指生物体在某个特定的生理条件或生长周期下所转录出的mRNA的总和,是研究基因结构、功能和基因表达的重要手段,也是关联表型研究的主要方法。转录组技术的应用为挖掘药用植物活性成分生物合成的相关酶基因提供了有效工具。毛蕊花糖苷合成途径中仍有许多关键酶未解析,因此可通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并推测最终蛋白质产物的丰度。通过对相关转录组数据的分析,获取了与苯乙醇苷合成相关的数据(表1),可为毛蕊花糖苷的生物合成提供思路。

表1 苯乙醇苷转录组数据分析结果

Table 1 Data on the transcriptome of the phenylethanoid glycosides

物种 NCBI Accession 酶沙漠肉苁蓉Cistanche
deserticola[32] SRR1779481、SRR1779494 PAL、4CL、HCT、CSE、CYP73A、CYP98A3 熟地黄Rehmannia
glutinosa Hairy Roots[17] SRR5438036、SRR5438037、SRR5438042 PAL、C4H、C3H、4CL、TyDC、PPO、CuAO、HCT、ALDH、UGT 熟地黄Rehmannia
glutinosa Tuberous
Root[16] SRR8196590、SRR8196591、SRR8196592、SRR8196593、SRR8196594、SRR8196595、SRR8196596、SRR8196597、SRR8196598、SRR8196599、SRR8196600、SRR8196601、SRR8196602、SRR8196603、SRR8196604、SRR8196605、SRR8196606、SRR8196607、SRR8196608、SRR8196609、SRR8196610、SRR8196611、SRR8196612、SRR8196613 PAL、C4H、C3H、4CL、PPO、DODC、CuAO、UGT、ALDH、HCT Centranthera grandiflora[18] SRR9903027、SRR9903028、SRR9903029、SRR9903030、SRR9903031、SRR9903032、SRR9903033、SRR9903034、SRR9903035 PAL、C4H、C3H、CuAO、ALDH、4CL、UGT、TyDC、PPO、HCT 橄榄Olea europaea L.[24] SRR8606699、SRR8606701、SRR8446454、SRR8446455、SRR8446452、SRR8446453、SRR8446451 PAR、DODC、ALDH、PPO、CuAO

肉苁蓉是提取苯乙醇苷类物质的重要药用植物,对其基因组和转录组数据的研究为毛蕊花糖苷生物合成途径的研究提供了宝贵资源。利用针对沙漠肉苁蓉的RNA-Seq分析方法对沙漠肉苁蓉的肉质茎进行深度转录组测序,首次获取了其转录组数据,通过序列比较和系统发育分析,鉴定了连接初生代谢与次生代谢的关键酶PAL基因,这也是苯乙醇苷生物合成中的第一个关键酶,并且首次推测了17个参与根茎中苯乙醇苷生物合成的酶基因[32]。通过代谢组学和转录组学探究不同类型沙漠中肉苁蓉质量差异的结果表明可能由于PAL、ALDH、谷草转氨酶(GOT)等的表达上调使得盐碱地中的苯乙醇苷含量较高[33],这为苯乙醇苷合成途径的解析提供了依据。

玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa)中富含丰富的苯乙醇苷物质,通过对熟地黄块根进行从头转录组测序,比较KEGG途径和试验性途径,提出了可能与毛蕊花糖苷生物合成有关的19个候选基因,为毛蕊花糖苷合成途径的解析提供了方向。之后利用RT-PCR对数据进行集中验证后发现地黄转录组中编码预苯酸脱水酶(ADT)、天冬氨酸转氨酶(ASP5)、GOT2、4CL、伯胺氧化酶(AOC3)、C4H、HCT和C3H的基因[34]。有趣的是地黄叶片中毛蕊花糖苷的含量比根部高,这可能是由于在特定的发育阶段中基因差异表达造成不同部位酶的表达量不同,这也是利用转录组技术来解析毛蕊花糖苷合成途径的难题之一。之后,对四个不同品种的熟地黄块茎根中径向纹和非径向纹进行栽培并分析其转录组数据获得了与毛蕊花糖苷合成相关的223个基因。通过转录组数据分析出PAL、C4H、C3H、4CL、TyDC、PPO、CuAO、ALDH、HCT、UGT等基因[16]。在对Centanthera grandiflora Benth转录组测序中则挖掘到231个参与毛蕊花糖苷生物合成的基因,通过注释与毛蕊花糖苷生物合成途径相关的KEGG途径,确定PAL、C4H、C3H、CuAO、ALDH、4CL、UGT、TyDC、PPO和HCT等10种基因。其中,表达量最多的是CuAO,其次是4CL、ALDH和UGT,最少的是HCT。与根相比,参与苯丙氨酸途径和酪氨酸途径的基因在叶和茎中的含量更高,尤其是PAL和PPO基因。并且与根部相比,叶和茎中的四个基因PAL、C4H、C3H和4CL均上调,这表明苯丙氨酸衍生途径在地上部分表达量较高[18]。然而,上述研究通过转录组研究预测HCT和UGT催化咖啡酰辅酶A和羟基酪醇葡萄糖苷到毛蕊花糖苷的下游酶促途径,但相关基因的功能并未得到验证[16,18]。

诱导子是指能够诱发植物产生抗性或自身防御和保卫素的因子,可以快速、专一和选择性地诱导植物多种特定基因的表达,从而活化特定的次生代谢产物[35]。为筛选明显增加地黄毛状根中毛蕊花糖苷积累的最佳诱导子,利用由发根农杆菌介导的地黄遗传转化系统比较不同浓度的诱导子,研究发现25 μmol/L的水杨酸(SA)既能明显促进毛状根的生长又能显著提高毛蕊花糖苷的含量。之后采用RNA-Seq技术对诱导不同时间的地黄毛状根进行转录组分析,查找不同条件下差异表达的基因,最终确定PAL、C4H、C3H、4CL、TyDC、PPO、CuAO、ALDH、HCT、UGT等基因可能参与毛蕊花糖苷生物合成。其中C3H和ALDH分别为占丰度最多和最少的同源基因[17]。此外,Fatemi等[29]评估了不同浓度的茉莉酸甲酯(MeJA)和多壁碳纳米管(MWCNTs)等诱导子对迷迭香酸积累及其生物合成途径相关基因表达水平的影响,编码PAL、TAT、4HPPR和迷迭香酸合酶(RAS)的基因被鉴定为关键基因,其中TAT具有转氨作用,这为毛蕊花糖苷合成途径的解析提供了新思路。

橄榄(Olea europaea)是生物活性多酚的丰富来源,可生产毛蕊花糖苷的重要前体羟基酪醇。通过全长转录组测序对橄榄果实和叶片中多酚生物合成的相关基因进行鉴定,实验中定量了12种多酚化合物,共鉴定出6个基因家族的106个转录本与羟基酪醇的合成相关,其中与羟基酪醇合成相关的基因包括PPO、DODC、CuAO、ALDH和PAR[24]。上述苯乙醇苷转录组研究的结果,为毛蕊花糖苷合成途径的解析及调控基因、关键酶的挖掘提供了依据。

2.2 毛蕊花糖苷合成和调控的关键酶挖掘

植物细胞色素P450酶(CYP450)是广泛存在于生物界的一类膜结合的血红素氧化蛋白。多种植物源天然代谢产物如苯丙烷类、萜类、生物碱等生物合成途径中均有CYP450的参与。植物源天然产物的CYP450酶存在异源表达困难、催化效率低等问题,也是目前毛蕊花糖苷生物合成途径中研究的热点和难点。在合成咖啡酸的苯丙氨酸途径中,C4H是该途径的第二个关键酶,也是CYP450酶催化的第一个氧化反应,控制苯丙氨酸途径中多酶复合物与膜的电子传递,具有高度的专一性。例如,来源于毛果杨(Populus trichocarpa)的C4H是合成木质酚的关键CYP450酶[36]。C3H可进一步催化对香豆酸发生C3羟化反应,将羟基引入对香豆酸苯环的C3位上形成咖啡酸,是合成咖啡酸的第二个CYP450氧化反应。Furuya等[37]报道了首个细菌源催化对香豆酸羟化为咖啡酸的细胞色素P450酶CYP199A2,实现了对苯环C3位羟化。此外,Lin和Yan[38]表达了依赖于FAD和NADH的4-羟基苯乙酸3-羟化酶(4HPA3H),其可催化对香豆酸合成咖啡酸,表明4HPA3H和CYP199A2均可实现C3H的羟化功能。

HCT属于植物酰基转移酶BAHD家族,具有“HXXXD”和“DFGWG”两个保守序列,常以羟基肉桂酰辅酶A为供体,催化底物形成酯类或酰胺类化合物。天然产物酰基化可有效改善植物次生代谢产物的理化性质并提高其生物活性,被广泛应用于开发生物质能源、改良作物品种和研制抗炎药物等领域[39]。目前烟草、拟南芥、紫花苜蓿等9种植物中的HCT已被克隆和异源表达,Cha等[40]通过引入烟草(Nicotiana tobacco)来源的奎尼酸羟基肉桂酰基转移酶,利用葡萄糖成功合成了绿原酸。Li等[41]通过表达红三叶草(Trifolium pratense)中的HCT2,高效生产咖啡酰基苹果酸。Chiang等[42]对卷柏(Selaginella moellendorffii)和其5种直系HCT进行分子模拟,发现HCT活性口袋附近的柔性Arg可识别不同大小的天然酰基受体底物和非天然的酰基受体底物,从而完成酰基化反应。在毛蕊花糖苷合成过程中,其下游酰基催化途径中的HCT根据转录组数据进行了初步预测[16,18],但是具体催化功能尚未得到深入解析,且专一性催化咖啡酰辅酶A和羟基酪醇葡萄糖苷合成木通苯乙醇苷A等HCT未见报道,仍需进一步挖掘与解析。

糖基化是植物次生代谢物合成途径中常见的后修饰方法,可以影响代谢物活性和天然产物生物利用度,毛蕊花糖苷合成途径中包含葡萄糖基化和鼠李糖基化。来自高山红景天(Rhodiola sachalinesis)的UGT73B6和来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的UGTBL1不仅可以催化酪醇生成红景天苷,同时还能催化酪醇C4位生成淫羊藿次苷D2(icariside D2),表明UGT73B6和UGTBL1催化红景天苷具有非特异性[43,44]。Chung等[27]报道了来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的糖基转移酶AtUGT73C5、AtUGT73C6和AtUGT85A1可以催化酪醇合成红景天苷,Choo等[45]则发现AtUGT85A1可催化羟基酪醇生成羟基酪醇葡萄糖苷,这为毛蕊花糖苷下游途径中葡萄糖基化的研究提供了依据。当前植物来源的鼠李糖基转移酶的报道多见于黄酮类物质的糖基化,催化苯乙醇苷类物质的鼠李糖基转移酶目前仍未见报道。

3 毛蕊花糖苷关键中间体的微生物合成

大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为模式微生物,是生产植物次生代谢产物的良好宿主。将来自不同生物体或途径的酶引入或重新组装进微生物中,实现天然产物生物合成途径的异源组装。利用微生物细胞结构简单、生长迅速的优势可实现大规模生产。当前已经积累了丰富的以微生物作为工业平台的经验,如生产各种天然药物黄酮、多酚、生物碱和萜类等,利用微生物高效合成毛蕊花糖苷的中间体咖啡酸、羟基酪醇、酪醇和红景天苷已有相关的报道[46]。

3.1 咖啡酸

咖啡酸作为毛蕊花糖苷合成的关键前体之一,是植物苯丙烷代谢的重要化合物,因具有抗氧化、抗病毒、抗癌和抗炎等特性而备受关注。在E.coli中可直接通过酪氨酸、对香豆酸或简单的碳源等前体转化为咖啡酸(图2a、b),利用酶改造、关键CYP450酶的挖掘、代谢工程等策略产量可达0.05~10.19 g/L[47]。Lin和Yan[38]在E.coli中表达来源于荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的TAL和大肠杆菌内源4HPA3H,首次利用酪氨酸从头合成了咖啡酸,摇瓶产量可达50.2 mg/L。Furuya和Kino[48]以甘油作为碳源,利用来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的4HPA3H催化对香豆酸生成咖啡酸,摇瓶产量最高可达10.19 g/L。

Liu等[49]通过筛选不同来源的羟化酶HpaB和HpaC首次在S.cerevisiae中构建了利用酪氨酸生产咖啡酸的途径。其中来自铜绿假单胞菌的HpaB和来自肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)的HpaC为最优酶组合,在摇瓶培养中产量可达(289.4±4.6)mg/L。由于上述过程需要补充酪氨酸,Li等[50]则在S.cerevisiae中实现了葡萄糖从头合成咖啡酸。通过与CYP450还原酶CPR1联用,首次在S.cerevisiae中成功表达植物源的C3H,同时结合密码子优化、增强前体供应、降低副产物形成、优化异源宿主和发酵培养基等手段,使咖啡酸产量达到11.432 mg/L,这为在S.cerevisiae中生产咖啡酸开辟了新途径,并为咖啡酸衍生代谢物的合成建立了平台。

3.2 羟基酪醇

羟基酪醇是毛蕊花糖苷合成的关键中间体,具有强抗氧化性。Satoh等[25]以葡萄糖作为唯一碳源,利用小鼠酪氨酸羟化酶(TH)催化酪氨酸合成羟基酪醇,同时利用来自E.coli的酪氨酸羟基化辅因子四氢单抗蛋白(MH4)避免了过度氧化等问题,最终羟基酪醇的摇瓶产量为69.08 mg/L。Li等[51]选用微生物来源的酶构建人工合成羟基酪醇的途径,避免了哺乳动物酶需要翻译后修饰以及内膜结构缺乏等问题。同时,通过关闭副产物4-羟基苯乙酸(4-HPA)的生成、过表达醇脱氢酶ADH6和HpaBC提高酪醇和羟基酪醇的产量、从培养基中去除NH4Cl增强酪氨酸向4-HPPDC的转氨作用,将抗坏血酸添加到细胞培养物中减少羟基酪醇的过度氧化等策略,羟基酪醇的最终产量达到了(1 243±165)mg/L。Yao等[52]利用HpaBC代替羟基酪醇合成途径中的第一个限速酶小鼠羟化酶,之后借助生物传感器进行体内定向进化优化第二个限速酶TYO,通过替换限速酶解决代谢途径的瓶颈,最终在E.coli中开发了高效的全细胞催化体系,利用酪氨酸转化为羟基酪醇的产量可达4 690 mg/L。Li等[53]通过利用不同拷贝数的质粒来平衡芳香族氨基酸氨基转移酶(TyrB)、L-谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮酸脱羧酶(PmKDC)和醛还原酶(YahK)在E.coli中的共表达,将菌株的生长与合成阶段分开,最终利用全细胞催化体系将L-多巴转化为羟基酪醇的产量为5.59 g/L。

3.3 酪醇和红景天苷

作为酪氨酸酚酸类衍生物,红景天苷广泛存在于药用植物红景天属中,具有抗疲劳、抗心血管疾病和抗癌等功效。目前红景天苷的微生物细胞工程已有相关的报道,Xue等[54]利用葡萄糖作为碳源,通过引入丙酮酸苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10和芳香族氨基转移酶基因ARO8构建生产酪醇的重组菌株、破坏编码内源性苯甲酸酯脱水酶(pheA)和苯乙醛脱氢酶(feaB)的基因关闭4-HPA的生成途径,并过表达ARO10提高酪醇的量,最终在摇瓶中获得1 203.46 mg/L酪醇。Chung等[27]利用酪氨酸为碳源,在E.coli中表达三种拟南芥来源的UGT,其中AtUGT85A1催化效率最好,酪醇和红景天苷的摇瓶产量可达1 394.6 mg/L和288 mg/L。合成微生物共培养技术是当前合成生物学和代谢工程的新兴策略,在E.coli中构建苯丙氨酸缺乏的糖苷(AG)菌株和酪氨酸缺乏的糖苷(GD)菌株,通过共培养生物合成酪醇和红景天苷。其中AG菌株利用木糖过量生产前体酪醇,GD菌株则消耗葡萄糖并增强前体尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的供应用于合成红景天苷,通过平衡代谢途径的强度,在5 L的反应器中可生产出6.03 g/L的红景天苷,该共培养系统也可用于生产其他重要的糖苷和天然产物[55]。

在S.cerevisiae底盘中,Jiang等[30]首先过表达来自欧芹的芳香醛合酶(AAS),利用酵母内源性埃里希 (Ehrlich) 途径增强酪氨酸生物合成酪醇的代谢通量,之后利用AtUGT85A1糖基化酪醇生成红景天苷,最终通过分批补料发酵使酪醇和红景天苷的产量分别达到1 394.6 mg/L和732.5 mg/L。Guo等[56]通过敲除乙醇分支途径中编码丙酮酸脱羧酶(PDC1)的基因、表达来自E.coli的具有分支酸歧化酶和预苯酸脱氢酶的双功酶(EctyrA)、引入磷酸酮醇酶(Xfpk)等方式在S.cerevisiae中进行代谢工程改造,获得高产酪醇的底盘宿主,最终通过葡萄糖分批补料发酵使酪醇和红景天苷产量为8.47 g/L和1.82 g/L,达到大规模工业生产的水平。Liu等[57]采用解除反馈抑制、过表达关键酶、抑制竞争途径等方法将碳流引入酪醇的合成,利用来自玫瑰红景天(Sedum rosea)的RrU8GT33opt进行酪醇的糖基化,最终在S.cerevisiae中利用模块化思想实现了从葡萄糖高水平生产酪醇和红景天苷。在5 L的反应器中酪醇和红景天苷的产量可达(9.90±0.06)g/L和(26.55±0.43)g/L,酪醇的滴度比初始菌株提高了26倍,这为酪醇和红景天苷的进一步工业化生产铺平了道路,也是当前在S.cerevisiae中生产红景天苷的最高产量。

4 结论与展望

毛蕊花糖苷作为苯乙醇苷的代表性物质,是一类非常重要的天然活性产物和药物开发中间体,具有巨大的保健和医用价值。近年来已有较多研究者以E.coli或者S.cerevisiae作为底盘宿主,通过天然生物合成途径和异源微生物合成途径成功合成了毛蕊花糖苷的前体物质。但合成毛蕊花糖苷的分子机制仍未明确,仍需解决以下问题:(1)药用植物的全基因组尚未报道,转录组信息仅有部分报道,造成关键酶的挖掘比较困难,部分潜在候选酶的功能尚未确定,如鼠李糖基转移酶URT和酰基转移酶HCT;(2)异源酶与微生物底盘宿主适配性差,CYP450与不同来源CPR不匹配,导致催化效率低[50];(3)部分已报道的酶特异性不高,缺少高分辨的晶体结构,存在酶分子改造难度大等问题[27]。随着药用植物的基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学信息的进一步挖掘和解析,通过催化元件性能的不断提升、底盘细胞内供给系统的不断优化,将会进一步提升毛蕊花糖苷全合成效率,为变革传统植物提取方式、保护环境、减少占用耕地等方面做出巨大贡献,进一步展现合成生物学在微生物合成植物天然产物上的潜能和生命力。

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