紫云英LHY基因及其应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-12-03 20:37

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及紫云英lhy基因及其应用。

背景技术：

紫云英(astragalussinicusl.)是豆科，黄耆属二年生草本植物，主要分布于中国长江流域，是重要的蜜源植物。紫云英对土壤资源的可持续利用，具有重要意义。

成花是植物从营养生长向生殖生长的关键转换，同时也是是实现世代交替的中心环节，在很大程度上决定了植物繁殖的成功与否。紫云英按开花早晚可分特早花型、早花型、中花型和晚花型，开花时间直接决定了有效生长季的长短。作为绿肥，紫云英的种植和收获时间取决于主作物，保证紫云英产量的同时还要与主作物的生育期相协调。在合适的时间促使或避免开花，根据当地的耕作制度选育花期适当的品种是重要的育种目标。因此，成花基因研究对紫云英生长发育及遗传改良具有重要意义。但对于紫云英成花机制的研究，以及开花相关基因在此过程中的作用尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的是提供紫云英lhy基因及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供紫云英lhy基因，lhy基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)seqidno:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明利用race技术获得lhy基因的全长cdna序列大小为2865bp(seqidno:1)，含有一个2259bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为407bp和199bp。polya尾巴信号肽区域位于2854-2859bp处。

第二方面，本发明提供含有所述lhy基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述lhy基因或含有该基因的生物材料在调控植物开花时间中的应用。

所述调控是指延迟开花时间。

前述应用包括：

1)使植物包含lhy基因；或者，

2)使植物过表达lhy基因。

所述应用包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

可选地，过表达lhy基因的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过向植物中导入具有lhy基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上lhy基因的拷贝数；

3)通过将强启动子与lhy基因可操作地连接；

4)通过导入增强子。

本发明中，所述植物为拟南芥、紫云英。

进一步地，所述应用包括利用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导等方法将包含lhy基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植株。

第四方面，本发明提供所述lhy基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。育种目的为延迟开花时间。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次从紫云英中克隆得到lhy基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，在拟南芥中验证了lhy基因具有调控植物开花的功能，具体为延迟植株开花。转lhy基因的拟南芥株系出现抽薹延迟，开花延迟，抽薹天数比野生型平均晚18.36天，开花天数比野生型平均晚20.72。这表明紫云英lhy基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。本发明提供的lhy基因及其编码蛋白为培育植物新品种提供了宝贵资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中紫云英lhy基因编码蛋白的氨基酸序列与其它九个物种的序列同源性比对结果。

图2为本发明实施例1中lhy蛋白质二级结构预测及功能位点注释。

图3为本发明实施例1中利用mega5.2构建的lhy基因氨基酸序列的nj系统进化树(数字为置信度)。

图4为本发明实施例1中预测的lhy蛋白的三维结构图及其与模板碳主链的重叠图。其中，a：紫云英lhy的三维结构图。b：紫云英lhy结构和质型多角体病毒rna聚合酶蛋白的碳主链的重叠图。彩色结构的是紫云英lhy；紫色线是质型多角体病毒rna聚合酶碳主链。

图5为本发明实施例1中紫云英lhy基因5-racepcr电泳结果分析。其中，m:dl5000marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；1：lhy5-racepcr电泳结果(约750bp)。

图6为本发明实施例1中紫云英lhy基因3-racepcr电泳结果分析。其中，m:dl5000marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；1：lhy3-racepcr电泳结果(约580bp)。

图7为本发明实施例1中紫云英lhy基因3端第一步移基因pcr扩增结果。其中，m:dl5kdnamarker：100，250，500，750，1000，15000，2000，3000，5000bp；1：lhy3端第一步移基因pcr扩增产物(约2000bp)。

图8为本发明实施例2中转基因(紫云英lhy基因)拟南芥的表型分析结果。其中，左侧为野生型，右侧为转基因植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1紫云英lhy基因的克隆及序列分析

本发明利用race技术从紫云英中获得lhy基因的全长cdna序列大小为2865bp(seqidno:1)，含有一个2259bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为407bp和199bp。polya尾巴信号肽区域位于2854-2859bp处。其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。具体方法如下：

1、试验材料：新鲜紫云英组织样本。

2、rna提取：紫云英总rna提取采用rneasyplantminikit(qiagen货号：74904)进行，具体提取过程参照试剂盒说明书。

3、5-race-pcr实验

5-race模板采用generacertmkit(invitrogen，货号：l1500-01)进行合成。

(1)引物设计及序列

采用primerpremier6.0软件进行5-race引物的设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物序列见表1。

表15-race引物序列

(2)5-racepcr反应体系及条件见表2～表5。

表25-racepcr第一轮反应体系

表35-racepcr第一轮反应条件

表45-racepcr第二轮反应体系

表55-racepcr第二轮反应条件

(3)5-racepcr电泳结果

pcr结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果见图5)，5-racepcr呈现出一条特异性条带，大小约750bp左右，切胶回收后，连接pucm载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

4、3-race-pcr实验

3-race模板采用generacertmkit(invitrogen，货号：l1500-01)进行合成。

(1)引物设计及序列

利用客户提供的序列，采用primerpremier6.0软件进行3-race引物的设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物序列见表6。

表63-race引物序列

(2)3-racepcr反应体系及条件见表7～表10。

表73-racepcr第一轮反应体系

表83-racepcr第一轮反应条件

表93-racepcr第二轮反应体系

表103-racepcr第二轮反应条件

(3)3-racepcr电泳结果

pcr结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果见图6)，3-racepcr呈现出一条特异性条带，大小约580bp左右，切胶回收后，连接pucm载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

5、紫云英lhy基因3端第一步移基因克隆

目的基因pcr扩增及回收。

(1)模板：紫云英3-race为模板。

(2)引物序列见表11。

表11引物序列

(3)pcr扩增体系及条件见表12～表13。

表12pcr扩增反应体系

注：invitrogen，货号：12532-016。

表13pcr扩增反应条件

(4)pcr扩增结果

pcr结束后，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析(结果见图7)，pcr产物呈现出一条特异性条带，大小约2000bp左右，切胶回收后，连接pucm-t载体，转化高效化学感受态细胞dh5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

紫云英lhy基因的生物信息分析：

紫云英lhy基因编码蛋白的氨基酸序列与其它九个物种(cicerarietinum,medicagotruncatula,glycinesoja,glycinemax,phaseolusvulgaris,castaneasativa,prunuspersica,vitisvinifera,citrussinensis)序列同源性比对结果见图1。

使用protparam进行蛋白质氨基酸含量和理化性质分析。lhy基因编码的蛋白质含有752个氨基酸，其分子量为82800.03道尔顿，理论等电点为5.88，其化学组分见表14。该蛋白含有95个带负电荷的氨基酸残基和84个带正电荷的氨基酸残基，它的n端以蛋氨酸起始。该蛋白共含有11486个原子，其中碳原子3578个，氢原子5672个，氮原子1030个，氧原子1182个，硫原子24个，其脂肪族指数为62.97，疏水性指数为-0.752，不稳定性指数为56.29。综合以上数据，该蛋白被归类为不稳定性蛋白。

表14lhy基因编码蛋白的化学组分

应用clcgenomicsworkbench进行lhy蛋白的二级结构预测，该蛋白由752个氨基酸组成，包含30个α螺旋和8个β折叠。氨基酸序列中的酰胺化位点、蛋白激酶c磷酸化位点和n-糖基化位点见图2。利用netphos预测蛋白质中丝氨酸、苏氨酸和络氨酸的磷酸化位点，在lhy蛋白质中共预测出39个丝氨酸磷酸化位点，17个苏氨酸磷酸化位点和5个络氨酸磷酸化位点(表15)。

表15磷酸化位点预测结果

应用blastp程序对紫云英的lhy蛋白与其他9个物种同源蛋白进行了比较分析，结果显示物种之间有一定的相似性。其中，紫云英与medicagotruncatula的lhy蛋白的相似度达到78.96％，与cicerarietinum和glycinesojalhy蛋白的相似度分别达到了76.66％和75.17％，这一结果表明紫云英lhy蛋白与这三个物种有一定的同源性。用lhy蛋白构建的进化树显示紫云英与cicerarietinum和medicagotruncatula聚为一类(图3)。

紫云英lhy蛋白与其他物种lhy蛋白的比较分析结果见表16。包括氨基酸数量，相似度，e值，等电点和分子量等指标。

表16紫云英lhy蛋白与其他物种lhy蛋白的比较分析

利用mega5.2软件构建lhy基因氨基酸序列的nj系统进化树，bootstrep设置为1000，采用jones-thorton-taylor模型构建nj树。建树所涉及到的基因的序列号为：cicerarietinum:np_001296649.1,medicagotruncatula:aes82836.2,glycinesoja:khn16397.1,glycinemax:xp_006604920.1,phaseolusvulgaris:cad12767.2,castaneasativa:aau20773.1,prunuspersica:xp_007218929.1,vitisvinifera:xp_010661511.1,citrussinensis:xp_006491389.1。

紫云英lhy和质型多角体病毒rna聚合酶分别有752和1225个氨基酸组成。质型多角体病毒rna聚合酶蛋白在pdb数据库里的id为3ja4。紫云英lhy蛋白的三维结构是以3ja4为模板在i-tasser软件中预测得到的(图4)。预测的蛋白结构c值为-0.36，表示其与3ja4的a链在折叠和二级结构方面非常类似。显示目标蛋白和模板蛋白的结构相似性的tm值为0.968，rmsd值为

实施例2lhy基因在紫云英各组织的相对表达水平检测

1、总rna提取

紫云英均为温室种植的植物材料，是用普通紫云英植株材料采集种子培养而成的新鲜紫云英组织样本。

2、荧光定量pcr引物设计和合成

采用primerpremier6.0和beacondesigner7.8软件进行定量pcr引物设计，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用内参基因为18srdna(genbank：af359603.1)。

3、real-timepcr(q-pcr)基因表达差异统计分析

每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(ct内参基因－ct目的基因)进行统计分析。lhy基因q-pcr表达量分析结果见表17。

表17lhy基因q-pcr表达量分析

以上结果表明，lhy基因在各器官中均有表达，表达量由高到低依次为叶、花、花芽、茎、叶芽、荚果。可见，lhy基因的表达具有组织特异性，可能在紫云英花发育过程中起到重要的作用。

实施例3转基因拟南芥的培养及其表型分析

1、含本发明紫云英lhy基因(seqidno:1)的重组质粒的构建。

2、转化农杆菌感受态

将测序正确的重组质粒转化农杆菌感受态。菌落pcr鉴定表明载体质粒已成功转入到农杆菌中。

3、拟南芥转化流程(花序浸染法)

(1)种植：选择吸水性好，土质松软的至石配合营养土(1：1/2)作为拟南芥种植土壤。直径9cm的花盆，每盆播种100-150颗。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。

(2)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。

(3)去顶：拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

(4)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬转化后的农杆菌使od＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05％(500ul/l)。

(5)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在转化后的农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。

(6)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

(7)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

(8)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

(9)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的0.5×ms培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天后死亡。

(10)转基因植株转土栽培。转基因种子在含潮霉素的ms平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。

(11)pcr鉴定：取阳性植株叶片进行基因组dna的提取并使用目的基因序列和载体35s启动子序列引物进行pcr验证，引物序列如下(5′-3′)：

p1235f:cgggatccatggacgcttattcctctgg

p1235r:ccgctcgagagtatctccctccaagcg

检测转基因阳性植株。

植物筛选标记潮霉素基因检测：

潮霉素f：gagcatatacgcccggagtc，潮霉素r：gtctccgacctgatgcagctctcgg。

将lhy基因转化到农杆菌c5c81，利用花序法侵染拟南芥。将待检测的拟南芥种子在抗性培养基上种植，转化成功的植株能够正常生长，而未转化成功的植株是黄色死亡植株lhy基因未转化成功。将初筛得到的幼苗移栽到培养钵中继续培养，当生长至10～12片时，剪取叶片进行基因组dna的提取，并使用目的片段扩增引物及载体35s启动子序列引物进行pcr检测，电泳结果出现目的条带，表明lhy基因已经整合到拟南芥基因组中。

4、转基因拟南芥表型分析

播种转基因拟南芥t2代，记录转基因株系的开花情况。从播种后开始计算抽薹、开花所需天数，以及开花数，结果见表18和图8。

表18

可见，与野生型拟南芥植株相比，转基因拟南芥的系表现出晚花表型。对转基因拟南芥及野生型拟南芥的抽薹天数、开花天数及开花数进行统计。结果显示，超表达lhy基因拟南芥株系的抽薹天数比野生型平均晚18.36天，开花天数比野生型平均晚20.72天。这表明lhy基因的超表达对拟南芥的抽薹、花期均有影响。lhy基因的表达可以延迟植物开花。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>紫云英lhy基因及其应用

<130>khp191117512.8

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2865

<212>dna

<213>紫云英(astragalussinicusl.)

<400>1

atcttcttctggcctacttctacttgtgcttctctcctcctcctgctactgctgctactg60

ctgctactgctactgctactgctctctctctctcttccaatttgattcttcctgctttca120

atctgaaaggctcacatgagtccgccggtgaattcctgcgcttcacacacatgatcgcac180

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aagcaatttctgagaaccccgattccaacatattgaagggcagaaaacttgttgaccgtt2100

cctcatgtggttctaacacaccctccagcagcgaagagactgatgcactagcaaagaatg2160

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ctgtagctcacgaacatgacgtgtaagatgtgtgtaccatagtaaattattaccaactct2820

cttttactttgttaattggactcatgttactataaaaaaaaaaaa2865

<210>2

<211>752

<212>prt

<213>紫云英(astragalussinicusl.)

<400>2

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151015

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260265270

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340345350

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