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一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法

花匠小妙招
2024-12-03 20:37

专利名称：一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法
技术领域：
本发明提供了一种终止转基因植物通过花粉将外源基因传递给其它植物的方法，从而有效降低了转基因植物的环境风险，属于生物技术领域。
背景技术：
近年来，随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增加，转基因生物的大规模环境释放及其可能带来的环境生物安全问题已经日益成为目前全球最受关注和争议的领域之一。转基因植物中的外源基因通过基因漂移(或天然杂交)转移到环境中的非转基因品种或其野生近缘种(包括杂草种类)中，并通过遗传渐渗在野生近缘种的群体中存留或进一步扩散，从而带来环境生物安全问题。花粉介导的基因漂移广泛存在于具有杂交亲和性的植物种类之间，包括同一物种不同群体和不同物种之间的基因漂移。与其它形式的基因漂移(如种子介导的基因漂移)相比，花粉介导的基因漂移由于可以借助风力和昆虫进行，因而是最不容易避免的。目前已经发现一些降低花粉中外源基因扩散的方法，常见的如叶绿体转化、花粉中外源基因的去除等。大多数植物的叶绿体是母性遗传的，如果外源基因整合到叶绿体基因组上，就不能通过花粉向其它植物扩散，因此可以避免外源基因的扩散。然而叶绿体转化只在少数植物中利用基因枪法获得了成功。另外，叶绿体转化载体包含有叶绿体同源片段，以保证外源基因的定点组合，而大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚，因此，无法确定用于载体构建的同源片段和外源基因插入位点，对未知序列叶绿体基因组只能通过保守序列来完成。另外一个关键的问题是，大多数植物细胞含有10-100个叶绿体，每个叶绿体又含有高达100 个质体基因组拷贝，而只有少数的质体基因组能够转化成功，使外源基因完全整合到叶绿体每个DNA拷贝中需要有效的组织培养方法以及筛选技术，而对于大多数单子叶植物来说目前还没有建立起来有效的转化和筛选系统。特异位点重组(如Cre/loxP系统、FLP/FRTs系统和锌指核酸酶(ZFNs)系统)是将花粉中外源基因剪切掉的方法。在这类体系中，花粉特异启动子驱动位点特异重组酶将其识别位点旁侧的转基因元件准确切除，而不影响花粉的正常生成和功能，但是这种方法的效率较低。最新发展的loxP/FRTs系统可以被Cre或FLP任何一种重组酶识别，相比Cre/ IoxP和FLP/FRTs，具有更高的效率(Luo，K. et al.，2007)，但是这一技术目前只在烟草中得到了验证。雄性不育是另外一种广泛应用于商业化转基因植物中避免花粉介导转基因漂移的方法。Mariani等利用Barnases基因创造了烟草和油菜的雄性不育系，雄性不育株系做母本，野生型株系做父本，获得的杂交种借助Barstar基因恢复育性。然而，其负效应表现在，与对照相比，以花粉为食物的昆虫如油菜花露尾甲长成成虫的数量明显减少。而且，有证据表明，barnase对动物和人类细胞具有毒性，因此需要植物特异表达barnase的部位不是被食用的部分。另外，Barnase在应用方面还存在着很多问题，例如雄性不育性状具有温度敏感性，容易受环境影响而不稳定、即使在花粉特异启动子下，barnase的毒性也有可能会泄露表达在植物体其它部位，从而引起各种重要农艺性状的变化、barnase在后代分离中存在不稳定性等。因此，这种方法也不是理想的控制转基因漂移的方法。

发明内容
本发明提供了一种有效阻止转基因植物通过花粉传播至其它水稻品种、野生近缘种、野草以及其它植物的方法。此方法的核心技术是利用花粉形成后期特异启动子PG47驱动花粉致死基因ZM-AA1，将携带有转基因的花粉杀死，而不带转基因的花粉仍然能够正常发挥功能。本发明的优点在于1)带有转基因的花粉粒因为携带有一个植物来源的糖代谢基因而完全失活，效率高达100%，降低了由花粉介导的基因漂移造成的环境风险；2)花粉致死基因由花粉发育后期特异启动子驱动，对另外一半不携带转基因的花粉粒的形成和功能完全无影响；3)外源基因可以通过雌配子传递。本发明通过以下方案来实现首先构建转化载体，将花粉致死基因置于花粉发育后期特异性启动子PG47下游，红色荧光蛋白所基因置于愈伤组织和种皮特异性启动子END2下游，两个基因表达盒紧密连锁；然后利用野生型水稻品种中花11幼胚或成熟胚诱导的愈伤组织作为转化外植体，利用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入；受体细胞在共培养后的30天内利用荧光显微镜进行三次筛选，将稳定表达红色荧光的愈伤组织分化成幼苗；对转化幼苗进一步进行分子生物学鉴定和花粉活性鉴定。本发明依次通过以下步骤来实现
1)载体构建将花粉致死基因连接于花粉发育后期特异性启动子下游，使表达该融合基因的花粉败育。将筛选标记基因融合于愈伤组织和种皮特异性启动子下游，从而可以对转化个体的愈伤组织和种皮进行筛选。将二者紧密连锁构建于表达载体的T-DNA区。2)利用农杆菌介导的转化法转化水稻，通过筛选标记基因对转化细胞进行筛选，进而分化成再生植株。3)分子生物学检测利用PCR，Southern blot方法对转基因植株进行筛选及鉴定。4)花粉致死能力的测定采用I2-KI染色法，观察转基因植株上的花粉类型并判断其育性。5)利用X2-检验统计转基因植株自交所结种子种荧光种子(转基因种子)与非荧光种子(非转基因种子)的比例是否附合1:1。

图1显示了实施例1中植物表达载体PSPT05结构示意图。图2显示了实施例2中经农杆菌转化后表达红色荧光蛋白的水稻愈伤组织。图3显示了实施例2中经农杆菌转化后获得的再生水稻植株。图4显示了实施例3中部分植株的PCR鉴定(M: DNA分子量标准；负/阴性对照；+ :正/阳性对照)。图5显示了实施例4中部分转基因植株的Southern blot鉴定(N 阴性对照，M:分子量标准；质粒以转化质粒作为阳性对照)。图6显示了实施例5中花粉I2-KI染色后的花粉粒。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图具体描述本发明的技术方案，但不限于此。本发明实施例中具体涉及两个基因，和RP。ZM-AAl编码淀粉酶，在花粉发育后期特异性启动子的驱动下，它可在成熟花粉后期表达出淀粉酶，从而降解花粉粒中的淀粉，最终使花粉败育，其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ； ^基因用作筛选标记基因，来源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，它可编码红色荧光蛋白，可被激发出红色荧光，便于转基因的愈伤组织和种子的筛选，其核苷酸序列及氨基酸序列分别见 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID N0. 4。实施例1 构建表达载体
本发明中转化所使用表达载体名称为PSPT05 (附图1)。该载体是在pPZP基础上人工构建而来。表达载体上有2个基因表达盒:Z￥-AAJ基因表达盒，该表达盒由来自玉米的花粉发育后期特异性启动子PG47驱动(其核苷酸序列见SEQ ID N0. 5)，并由来自玉米的终止子IN2-1终止转录(其核苷酸序列见SEQ ID N0. 6)，另外转运肽ZM-BTl融合于ZM-AAl基因与PG47启动子之间，ZM-BTl的核苷酸序列见SEQ ID N0. 7，报告/筛选标记基因RP基因表达盒，该表达盒由来自玉米的愈伤组织和种子特异性启动子END2驱动(其核苷酸序列见SEQ ID N0. 8)，并由来自马铃薯的终止子PIN II终止转录，PIN II的苷酸序列见SEQ ID N0. 9。T-DNA区段内不含抗生素抗性标记基因，也不含除草剂筛选标记基因。实施例2 获得转基因水稻植株
将实施例1中转化载体用电击法导入农杆菌菌株AGLO中，用于转化野生型中花11诱导的愈伤组织。利用红色荧光蛋白对转化愈伤组织进行筛选，附图2为表达外源基因的愈伤组织，进一步将其分化再生出表达外源基因的转化植株(附图3)。实施例3 转基因植株的PCR检测
取实施例2中的转基因水稻植株叶片，抽取总DNA。以/ 基因序列为模板设计引物，对Ttl代转基因水稻基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物片段为789bp。扩增程序为 940C IOmin ；94°C lmin，60°C lmin, 72°C Imin ；37 循环；72°C IOmin0 正向引物序列为 5，-GGACTTGAACTCCACCAGG-3，；反向引物序列为5，-ATAATGCCAATACGACACC-3，。附图 4 为部分转基因植株PCR扩增结果，说明外源基因已整合至水稻受体基因组中。实施例4 转基因植株的Southern Blot检测
对Ttl代转基因水稻基因组DNA进行Southern Blot检测，以鉴定外源基因在水稻转化受体中的整合情况。取实施例2中Ttl代转基因水稻植株叶片，抽取总DNA。以/^基因序列中的M6bp核苷酸片段为探针，选用NEB公司的Ih I限制性内切酶进行消化反应。酶切反应体系为 200ul 基因组 DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、损a I 4ul (20U/ul)并用无离子水将体系补足至200 uL· 37°C温育6小时。附图5为部分转基因植株Southern Blot检测结果。结果表明，外源基因已整合至受体水稻基因组中。实施例5 花粉致死能力的测定
采用I2-KI染色法，观察转基因水稻花粉的形态并判断其育性(附图6)。共调查了花粉1995粒，正常可育花粉为1015粒(50. 8%)，不育花粉为980粒2%)。对二者是否符合 1:1分离规律进行了 X2-检验(自由度为1)。X2值为0.614，远低于显著水平0.05时的临界值3. 814，证明二者比例在P < 0. 05水平符合1:1。因此认为基因杀花粉功能彻底。
序列表
〈110〉北京未名凯拓作物设计中心有限公司
北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司〈120〉一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法〈160〉 9
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 1 〈211〉 1561 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(彻 mays) 〈400〉 1
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Phe Lys Ser lie Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr
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Leu 225
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<213> 玉米(Zea mays) <400> 5
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〈213〉玉米(彻 mays) 〈400〉 6
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tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg348 〈210〉 7 〈211〉 225 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(彻 mays) 〈400〉 7
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca60ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg225 〈210〉 8 〈211〉 944 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(彻 mays) 〈400〉 8
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〈213〉马铃薯{Solanum tuberosum) 〈400〉 9
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权利要求
1.一种防止外源基因从转基因植物漂移到其它植物和环境中的方法，此方法包括a)一段编码玉米α-淀粉酶基因的核苷酸序列，所述序列连接于花粉特异性启动子；b)将(a)中的核苷酸序列转化水稻；c)将转化细胞再生成植株。
2.权利要求书1中，花粉特异性启动子为PG47启动子。
3.权利要求书1中获得的转基因植株包含由花粉特异启动子驱动的玉米α-淀粉酶基因，并与荧光筛选标记基因FP紧密连接。
全文摘要
本发明提供了一种有效地降低转基因植物通过花粉传播导致环境风险的方法。本方法中，两个紧密连锁的基因表达盒转入中花11野生型材料，这两个基因表达盒是，1)花粉致死基因，ZM-AA1,由花粉发育后期特异性启动子PG47驱动；2)荧光筛选标记基因FP,由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动。携带单拷贝转基因的单株在自交结实过程中，没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实，而携带转基因的花粉粒在花粉发育后期败育，不能与雌配子受精，从而降低了转基因在环境中漂移的风险。
文档编号A01H4/00GK102477443SQ20101056355
公开日2012年5月30日申请日期2010年11月29日优先权日2010年11月29日
发明者万向元, 周君莉, 王海洋, 邓兴旺申请人:北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司, 北京未名凯拓作物设计中心有限公司