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生物技术在园林植物遗传改良上的应用学习PPT教案.pptx

花匠小妙招
2024-12-03 20:58

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,现代生物技术及其基本概念,（一）生物技术概念,生物技术（,Biotechnology),，有时也称生物工程（,Bioengineering,）,是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。,（二）生物技术的种类,基因工程（,Gene Engineering,）,细胞工程（,Cell Engineering,）,酶工程（,Enzyme Engineering,）

2、,发酵工程（,Fermentation Engineering,）,蛋白质工程（,Protein Engineering,）,（三）细胞工程,细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。,（四）克隆概念,分离基因的技术；,扩增基因的技术；,将单一细胞扩增成细胞群体的技术；,将一个生命体复制成一个与之完全相同的新个体的过程；,将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。,一个遗传上来源完全相同的生物群体,。,第一节组织培养,植物组织培养技术是现代植物生物技术的基本技术。,一、植物组织培养的概念与内

3、容,植物组织培养,(plant tissue culture),：是指在无菌条件下，将离体的植物材料（器官、组织、细胞以及原生质体等）培养在人工配制的培养基上，在适宜的光照和温度条件下，使其再生，形成完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。,广义的植物组织培养即植物离体培养,(plant in vitro culture),，不仅包括分生组织、输导组织、薄壁组织等离体组织的培养，而且包括原生质体，悬浮细胞，根、茎、叶、花、果实，以及成熟和未成熟的胚胎及至完整植株等的离体培养。,外植体,(explant),：由植物体上切下来用于离体培养的离体材料，包括任何植物的任何一部分活的组织，包

4、括细胞、组织和器官。,继代培养（,subculture,）：由最初的外植体上新增殖的组织，继续转入新的培养基上进行培养的过程。,单细胞无性系：指在细胞培养中，由单细胞形成的无性系。,愈伤组织（,callus,）：在组织培养过程中，由外植体形成的一团无特定结构和功能的细胞团。,胚状体（,embryo,）：在组织培养过程中，由外植体或愈伤组织产生的，与正常受精卵发育方式类似的胚胎结构体。,植物组织培养的类型,根据培养材料的来源、特性及其应用，植物组织培养主要包括以下几个方面：,植株培养离体器官培养,茎尖培养胚乳培养,胚培养细胞培养,胚珠和子房培养原生质体培养,花药与花粉培养离体授粉受精,

5、1,、植株培养（,plant culture,）,指对,幼苗,和,较大的完整植株,的培养，主要用于提供适合接种的外植体或是研究植株在某些培养基上的反应等。,通常可分为：,扦插苗培养,和,种子苗培养,等类型。,2,、茎尖培养（,shoot-tip culture,）,指对植物茎尖分生组织或更大的芽在离体条件下进行培养，进而获得完整植株的过程。,根据培养目的和外植体的取材大小，分为,普通茎尖培养,（,shoot culture,）和,茎尖分生组织培养,（,apical meristem culture,）。,3,、胚培养,(embryo culture),指将受精后形成的,胚,从胚珠或种子中剥离出

6、来，置于一定的培养基上生长发育成完整植株的过程。,它包括,未成熟胚,、,成熟胚,以及,杂种胚,的离体培养。,4,、胚珠和子房培养（,ovule and ovary culture,）,将植物的,离体胚珠,或,子房,接种到一定的培养基上进行培养，最终获得成熟种子或完整植株的过程。,根据授粉情况，可分为,已授粉胚珠与子房的培养,和,未授粉胚珠与子房的培养,。,5,、花药与花粉培养,(anther and microspore culture),在离体条件下，对处于一定发育时期的,花药,或,花粉,进行培养，使其改变正常的发育方向而形成,单倍体植株,的过程。,6,、离体器官培养,(organ cult

7、ure),指以植物的,某一器官的全部或部分或器官原基,作为外植体的离体培养技术。,其材料包括：,根尖、茎尖、茎段、茎的切块、叶片、花瓣、花蕾、花托、子房、子叶、以及未成熟的果实,等。,7,、胚乳培养（,endosperm culture,）,可培育出三倍体。,8,、细胞培养,(cell culture),指以能保持较好分散性的,单细胞,或,很小的细胞团,作为外植体的离体培养技术。,根据培养方式可分为,悬浮培养、平板培养、看护培养、微室培养、微滴培养,等类型。,9,、原生质体培养,(protoplast culture),指对利用酶或物理方法去掉细胞壁而获得的,原生质体,作为外植体的离体培养技术

8、。,10,、离体授粉受精,指在无菌条件下培养离体的未受精雌性器官并授以无菌花粉，花粉萌发后花粉管进入胚珠完成受精过程，进而获得有生活力种子的技术。,离体授粉受精的类型,根据培养器官母本组织的保留情况，分为：,离体胚珠授粉,离体胎座授粉,离体柱头授粉,二、植物组织培养在园林植物育种中的应用,1,、利用茎尖等培养进行园林植物的快速繁殖和工厂化育苗,通过茎尖、茎段培养，对于一些名优特新品种（种类）、优良自交不亲和系、雄性不育系以及常规无性繁殖困难的种类，均可快速形成无性繁殖系。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,2,、利用微茎尖培养获得无病毒植株,很多植物都带有病毒，如果利用微茎尖培养，有可能获得

9、脱毒的试管苗。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,3,、结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选,培养组织或细胞处在不断地分裂分化状态，易受培养条件和外加压力（如射线、化学物质）的影响而产生突变。,如今，通过这一途径已筛选到抗病、抗除草剂、抗盐碱、高蛋白、高赖氨酸等突变体，有些已用于生产。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,4,、利用花药与花粉培养等进行单倍体育种,将处于一定发育时期的花药与花粉或未授粉的胚珠和子房进行离体培养，可诱导雌、雄配子细胞发育成完整的单倍体植株，再使优良的单倍体植株染色体加倍，便可获得纯合稳定的二倍体植株。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,5,、利用胚乳培养等

10、获得三倍体植株。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,6,、利用胚胎培养和体细胞杂交等克服远缘杂交障碍,利用胚珠和子房培养进行试管授粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交或自交不亲和性。通过原生质体融合途径或以部分克服有性杂交种间的障碍，获得体细胞杂种，给实现种间或属间甚至科间广泛杂交以极大的促进作用。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,7,、利用离体培养进行种质资源的长期保存和远距离运输,利用茎尖及细胞培养结合低温或超低温冷冻贮藏，不仅节约空间，又可以减少病虫危害，也便于运输和交换种质资源。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,8,、通过组织培养提供生物技术育种的中间材料。,植

11、物组织培养在园林植物育种中的应用,另外，利用植物组织、细胞及原生质体作为受体，通过某种途径和技术将外源目的基因导入植物细胞，使其再生成完整植株，可获得能使外源目的基因稳定表达的转基因植株。,第二节植物组织培养的理论基础,一、植物细胞具有全能性,二、植物细胞可以进行脱分化,三、植物细胞可以进行再分化,四、植物分化的激素调节,植物细胞全能性（,totipotency,）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部,遗传信息,，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。,已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂能力，并改变

12、原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。,脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象（如由愈伤组织形成根、芽或胚状体等）。,激素是培养基中不可缺少的组成部分，它对愈伤组织的诱导和器官分化都有直接的影响。包括：,细胞分裂素,生长素,细胞分裂素,KT,（激动素）,ZT,（,zeatin,，玉米素）,6BA,（,6,苄基腺嘌呤）,2ip,（异戊烯基腺嘌呤）,促进细胞的分裂和器官分化、诱导胚状体,(embryoid),和不定芽的形成、延迟组织的衰老并增强蛋白质的合成。,生长素,2,，,4D,（,2,，,4,二氯苯氧乙酸）,NAA,（萘乙酸）,IAA,（吲哚乙

13、酸）,IBA,（吲哚丁酸）,2,，,4,，,5T,促进细胞伸长生长和细胞分裂、诱导产生愈伤组织、促进根的分化,第三节实验室的设备,一、清洗设备,离体培养的关键之一是要保证无菌，以免污染。,因此，必须对实验材料、各种用具进行严格的消毒。,清洗玻璃器皿的设备：水槽、水桶、各种大小的试管刷、洗涤架、适用的工作台等。还要有干燥箱。,常用的洗涤剂：肥皂、洗衣粉、洗液（即铬酸,硫酸混合液）。,一、清洗设备,二、消毒设备,1,、引起污染的因素：器皿与用具，培养基，培养材料，操作时的空气，工作人员的衣物等。,2,、对于器皿、衣物和培养基等可用热压灭菌锅进行消毒，即高温高压消毒。,二、消毒设备,3,、刀、剪、

14、镊子等用具，在使用前可插于,70,的乙醇中，用时再在酒精灯的火焰上消毒，待冷却后应用。也可将它们装在金属盒内，放在,150,下的电热烘箱内,40,分钟或,120,下两小时进行消毒。,二、消毒设备,4,、接种室（箱）内的空间及地面和墙壁，可用甲醛薰蒸灭菌或用紫外灯照射。接种前也可用,70,的酒精喷雾，使空间的灰尘降落及擦拭操作台表面。,二、消毒设备,5,、接种材料的消毒,消毒的原则：既要杀死材料上附着的微生物，又不能伤及材料。,常用的表面消毒的消毒剂：次氯酸钠，过氧化氢，低浓度的氯化汞等。,三、无菌操作设备,包括接种室、接种箱、超净工作台以及各种接种时的刀、镊、剪之类的用具。,接种室外最好设有准

15、备室，使工作人员进入接种室前有一个过渡以减少将室外杂菌带入室内。准备室可放置工作服、拖鞋中、帽子等，并用紫外灯随时进行灭菌。,用于无菌操作的工具有：酒精灯、贮存酒精（,70,）棉球的广口瓶及各种镊子、接种针、接种钩（或铲）、剪子等。,四、培养容器,1,、试管,2,、,L,形管和,T,形管,3,、长方形扁瓶及圆形扁瓶,4,、三角瓶,5,、培养皿,6,、平型有角试管和无角试管,7,、细胞微室培养的器皿,第四节培养基,一、培养基的成分,培养基的组成有大量元素、微量元素、碳水化合物、及各种有机附加物，如维生素、氨基酸、植物生长调节物质及其他天然产物，如椰乳、酵母提取液、肌醇。用固体培养基时，还要加入

16、琼脂。,（一）无机营养物,大量元素：,一般是指浓度大于,0.5mmol/L.,氮,(N),、磷,(P),、钾,(K),、钙,(Ca),、镁,(Mg),、硫,(S),。,微量元素：,包括铁,(Fe),、铜,(Cu),、钼,(Mo),、锌,(Zn),、钠,(Na),、锰,(Mn),、钴,(Co),、硼,(B),、碘,(I),。,（二）碳源和能源,蔗糖和葡萄糖等,（三）有机营养物,维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。,（四）生长调节物,生长素,：,2,，,4-D,、奈乙酸,(NAA),、吲哚丁酸（,IBA,）、吲哚乙酸,(IAA),。,细胞分裂素,：激动素（,KT,）、,6-,苄基氨基嘌呤（,6BA,

17、）、玉米素（,ZT,）。,赤霉素,（,GA,）,、脱落酸（,ABA,）、乙烯利（,CEDP,）。,（五）琼脂,固体培养基用,（六）一些天然产物,如麦芽提取液、椰乳、鲜果汁、酵母提取液、番茄汁等。它们对愈伤组织的诱导和维持均是有益的。,二、培养基的配制,1,、重蒸镏水的制备,2,、配制母液,配制培养基最方便的方法是先制备一系列的母液。,3,、培养基的配制和灭菌,配制培养基时，可将大量元素和微量元素，根据母液浓度稀释至配方所需的浓度，再加上附加物质和蔗糖，待全部溶解后定容。随后用,KOH,或,NaOH,及,HCl,调正到需要的,PH,值。再加入琼脂，一般用量为,0.5,0.9,，加热全溶后再装于培

18、养瓶内。,培养基要进行高压灭菌。,制备的培养基应在消毒后二星期内应用。,三、几种常用的培养基,1,、,MS,培养基,(Murashige,和,Skoog,1962),2,、米勒培养基（,Miller,1963,）,3,、,H,培养基,(Bourgin,和,Nitsch,1967),4,、改良怀特培养基,(White,1963),5,、,B5,培养基,(Gamborg,等,1968),6,、尼奇培养基,(Nitsch,1951),7,、,N6,培养基（北京植物研究所，黑龙江农业科学院，,1974,）,第五节植物组织培养的基本程序,植物组织培养经历的五个阶段：,（,1,）,预备阶段,外植体的获得

19、；,接种材料的消毒处理；,配制适宜的培养基；,（,2,）,诱导去分化阶段,（,3,）继代增殖阶段,（,4,）生根成芽阶段,（,5,）移栽成活阶段,一、取材和灭菌,根据试验目的，确定植物种类、品种并选择合适的部位作为外植体，对外植体进行消毒处理。,二、培养基配制和灭菌,根据试验材料，选择适宜的培养基，配制后高压灭菌备用。,三、接种,将消毒好的外植体在无菌条件下切成小块（约,0.5,1.0cm,），植入培养基。,四、接种后的培养,进行温控和光控。,多数情况下，长出愈伤组织后，还要往分化培养基里转移一次。,五、试管苗移栽大田,本阶段的主要目的是提高移栽成活率。,经试验表明：选择壮苗。适当炼苗、控制水

20、分供应、选择适合的移苗季节和选用合适的移栽土壤是提高移苗成活率的重要环节。,第六节单倍体育种,单倍体的概念及其特点,只含有一套染色体组的生物体；,被子植物的配子体世代。,矮小性；,不育性；,全显性。,2.,单倍体植物在育种上的意义,单倍体植物的直接利用；,克服杂种分离，缩短育种年限；,快速获得异花授粉植物的自交系；,单倍体植物的诱变育种；,克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；,3.,单倍体植株和愈伤组织的培养,（,1,）单倍体材料的采集,单倍体育种的首要问题是如何获得大最的单倍体植株。据现有的研究材料，用花药培养产生单倍体植株有两个途径,:,第一是在离体培养的花药中，花粉经过类似胚胎发育的过程

21、直接形成单倍体植物，如烟草、曼陀罗等。,第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。,（,2,）花药的接种,接种前的准备工作,接种和培养花药是在无菌条件下进行的，所用的一切用具必须彻底灭菌。,花粉发育时期的鉴定,适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要的，为此，进行花药培养前，要用显微镜进行花粉发育时期的鉴定。,经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与花药或花序的外部形态联系起来，找出花粉单核期或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花药进行接种培养。,（,3,）从愈伤组织分化成苗,诱导愈伤组织分化出根、茎、叶的方法是在愈伤组织长到,1-3,毫米大

22、小（如小米大）时，即可转移到诱导分化培养基上，促使分化长出植株。一般说来，愈伤组织如果先形成芽，随后根自然会发生，如果先有根，以后不一定会出芽。因此，掌握芽分化的条件是十分重要的。,愈伤组织转移培养工作是在无菌室或接种箱内进行的，转移后愈伤组织培养在,23-28,恒温室内，每日光照,9-11,小时，可用日光灯作辅助光，光强度在,2000,勒克斯以上。,在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上的一但转移后的一但转移后仍应向上，否则会影响生长，同时在转移时，就避免沾带过多的培养基。,4.,染色体加倍,处理方式：,试管内进行；,花粉植株定植后进行；,药剂处理；,植株鉴定。,单倍体育种程序：,材料采集

23、,接种培养诱导愈伤组织获得再生植株染色体加倍幼苗培育和品种选择,第七节植物原生质体培养和细胞融合,常规杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图通过这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。,原生质体的概念,植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。此时，细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。,原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。,2.,原生质体的特点,比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，为实现异源遗传物质转化提供了较好的实验材料。,原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开

24、辟了一条新的育种途径。,3.,发展概况,1892,，,J.A.Klerker,用机械法获得原生质体；,1960,，,E.C.Cocking,用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁形成再生植株,;,1960,，,G.Barski,发现,题细胞原生质体能融合在一起形成单核的、并能进行分裂的杂种细胞；,1972,，,P.S.Carlon,首次获得烟草体细胞种间杂种。,80s,此项技术在我国得到发展。,4.,原生质体的制备,（,1,）取材与灭菌,（,2,）酶解,(,纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶,),（,3,）分离（沉淀法、漂洗法、滴洗法）,（,4,）洗涤,（,5,）鉴定

25、（形态观测、活性鉴定）,原生质体的培养：,细胞壁再生；,细胞分裂；,植株再生。,5.,原生质体的融合,化学法诱导融合,按比例混合双亲原生质体,-,滴加,PEG-,滴加高钙高,PH,值溶液,-,洗涤原生质体溶液,-,离心获得原生质体溶液,-,筛选杂种细胞,-,再生杂种细胞。,物理法诱导融合,基本程序：,原生质体的获得；,电击融合；,筛选杂种细胞；,杂种细胞再生和完整植株的形成。,6.,融合细胞的培养鉴定与筛选,杂和细胞的显微镜鉴别；,互补法鉴定杂和细胞；,细胞与分子生物学法；,植株形态的鉴别。,第八节人工种子,人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素、及其他成分的人

26、工胶囊。其具有种子的功能，可直接用于田间播种。,1,、,人工种子的构成,人工种皮,胚状体,人工胚乳,2,、,人工种子的特点,：,（,1,）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；,（,2,）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；,（,3,）成本低，适于田间机械化生产；,（,4,）可根据需要调节胚乳成分。,3,、,人工种子的制备,（,1,）胚状体的制备及其同步生长；,（,2,）人工胚乳的制备；,（,3,）配制包埋剂及人工包埋。,人工种子包埋示意图,4%,海藻酸钠,体细胞胚,包埋丸,2%CaCl,人工种子,水,4,、人工种子的贮存与萌发,低温、干燥、洁净。,第九节基因工程,（一）基

27、因工程的含义,按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外,DNA,重组技术,和,DNA,转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，创造出新的生物类型。,致癌农杆菌介导的,Ti,质粒载体转化法,重组,DNA,的直接转化法,微粒散射技术,(Particle bombardment),（二）基因工程的基本步骤,1,、目的基因的克隆与鉴定；,2,、植物表达载体的构建；,3,、植物的遗传转化；,4,、转化细胞的筛选；,5,、转基因植株的鉴定。,基因,基因克隆,基因转化,DNA,重组技术,植物遗传转化技术,植物组织培养技术,第十节分子标记技术在育种中的应用,1.DNA,遗传标记的特点：

28、,数量极多；,遗传上稳定；,排除了环境差异,.,2.DNA,遗传标记的应用,构建遗传图谱；,分析亲缘关系；,定位农艺性状；,分子标记辅助选择；,种质资源及杂种后代的鉴定。,3.,分子标记技术,RFLP,Restriction fragment length polymorphisms,RAPD,AFLP,SSR,SSLP,本章要点：,植物组织培养的概念,植物组织培养的类型,植物组织培养在园林植物育种中的应用,植物组织培养的理论基础,植物组织培养实验室的设备,培养基的种类、成分和配制,植物组织培养的基本程序,重点内容：,植物组织培养的概念，在园林植物育种中的应用，理论基础，培养基的配制，基本

29、程序。,难点内容：,植物组织培养的理论基础，培养基的种类、成分和配制，植物组织培养的基本程序。,概念：,植物组织培养，外植体，继代培养，单细胞无性系，愈伤组织，胚状体。,作业和思考题：,1.,植物离体培养的基本原理是什么？离体培养技术在园林植物育种中有何应用价值？,2.,植物离体培养一般要有哪些主要步骤，各包含哪些主要工作？,3.,单倍体育种在多年生木本植物中潜在的重要性表现在哪些方面？,参考文献,1.,包满珠主编,.,园林植物育种学,.,北京：中国农业出版社,2004.,2.,曹家树,申书兴主编,.,园艺植物育种学,.,北京：中国农业大学出版社,.,3.,朱之悌,.,树木无性繁殖与无性系

30、育种,.,林业科学，,1986,，,22(3):280-290.,4.,陈振光等,.,园艺植物离体培养学,.,北京,:,中国农业出版社,1996.,一、植物组织培养的概念与内容,植物组织培养,(plant tissue culture),：是指在无菌条件下，将离体的植物材料（器官、组织、细胞以及原生质体等）培养在人工配制的培养基上，在适宜的光照和温度条件下，使其再生，形成完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。,外植体,(explant),：由植物体上切下来用于离体培养的离体材料，包括任何植物的任何一部分活的组织，包括细胞、组织和器官。,3,、胚培养,(embryo culture

31、),指将受精后形成的,胚,从胚珠或种子中剥离出来，置于一定的培养基上生长发育成完整植株的过程。,它包括,未成熟胚,、,成熟胚,以及,杂种胚,的离体培养。,植物组织培养在园林植物育种中的应用,3,、结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选,培养组织或细胞处在不断地分裂分化状态，易受培养条件和外加压力（如射线、化学物质）的影响而产生突变。,如今，通过这一途径已筛选到抗病、抗除草剂、抗盐碱、高蛋白、高赖氨酸等突变体，有些已用于生产。,（一）无机营养物,大量元素：,一般是指浓度大于,0.5mmol/L.,氮,(N),、磷,(P),、钾,(K),、钙,(Ca),、镁,(Mg),、硫,(S),。,微量元素：,包括铁,(Fe),、铜,(Cu),、钼,(Mo),、锌,(Zn),、钠,(Na),、锰,(Mn),、钴,(Co),、硼,(B),、碘,(I),。,2,、,人工种子的特点,：,（,1,）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；,（,2,）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；,（,3,）成本低，适于田间机械化生产；,（,4,）可根据需要调节胚乳成分。,人工种子包埋示意图,4%,海藻酸钠,体细胞胚,包埋丸,2%CaCl,人工种子,水,概念：,植物组织培养，外植体，继代培养，单细胞无性系，愈伤组织，胚状体。,