喹诺酮类抗生素对拟南芥及线蚓的生态毒理机制及抗性组学研究
喹诺酮类抗生素对拟南芥及线蚓的生态毒理机制及抗性组学研究
【摘要】： 抗生素因其具有生化作用杀死微生物或是抑制其生长的效果而被广泛用于生物体疾病治疗与预防,同时在畜禽养殖业中,还通过在饲料中添加亚治疗剂量的抗生素以促进畜禽生长。然而,生物对抗生素的弱代谢能力,导致大部分抗生素经由排泄系统排至体外,成为环境污染物。本文通过研究三种环境中典型喹诺酮类抗生素:恩氟沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星对典型模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)与土壤非目标生物线蚓(Enchytraeus crypticus)的毒性影响,从拟南芥的基础生理、光系统、氧化胁迫体系、叶际微生物以及线蚓的基础生理、防御响应体系、肠道微生物、抗生素抗性基因方面揭示抗生素对环境生物的危害。在三种喹诺酮类抗生素胁迫下,拟南芥的根长及地上部鲜重随抗生素浓度增加而降低,显示出显著的剂量-效应关系,毒性强弱为:恩氟沙星>诺氟沙星>左氧氟沙星。抗生素胁迫下,拟南芥新生叶片出现白化现象,并且随抗生素浓度增加,叶片白化现象增强。随抗生素胁迫增强,拟南芥细胞透性显著增强。透射电镜观察发现50 mg/L恩氟沙星胁迫下的拟南芥叶片出现片层结构扭曲、细胞器肿胀、淀粉颗粒数量增加等现象。在三种喹诺酮类抗生素胁迫下,以叶绿素荧光参数(F_0,F_m,F_v/F_m)、光响应曲线(NPQ,Y(II))为指标,研究了三种喹诺酮类抗生素对拟南芥光系统的影响。结果表明,F_0、F_m值随抗生素浓度增加而增加,表明叶绿素反应中心在抗生素胁迫下受损。F_v/F_m,Y(Ⅱ),NPQ值随抗生素浓度上升而降低,表明拟南芥在抗生素胁迫下光合效率受抑制。新叶相较于老叶具有更高的F_v/F_m值可能是拟南芥适应抗生素胁迫,维持自身更好地生长。三种抗生素对光系统的抑制效应为:恩氟沙星>诺氟沙星>左氧氟沙星。在三种喹诺酮类抗生素胁迫下,拟南芥细胞内活性氧自由基(ROS)水平随抗生素浓度上升而提高,脂质过氧化产物丙二醛含量变化与抗生素浓度呈正相关。中高浓度处理组中SOD、GPX酶活性降低,可能是由于抗生素的外源胁迫超出拟南芥叶片细胞中抗氧化酶的耐受能力所导致。POD活性持续上升,可能是抗氧化胁迫体系为降低细胞内H_2O_2而需要维持高活性水平。拟南芥细胞内超氧化物反应基因At COBL5、At ERD7、At GRP、At UCP2和At OGO上调,以增强拟南芥氧化胁迫耐受性。在恩氟沙星胁迫下,拟南芥叶际微生物于门水平检测到变形菌、拟杆菌、厚壁菌、放线菌和蓝细菌。恩氟沙星处理组中叶际微生物群落OTU数、Chao指数和Shannon指数显著降低,表明拟南芥叶际微生物丰度及微生物多样性显著降低。处理组中叶际微生物KEGG通路中过氧化物酶体、谷胱甘肽代谢通路上调,以增强宿主抗氧化胁迫能力;药物代谢—细胞色素P450、异源生物素通过细胞色素P450代谢通路上调以增强宿主对抗生素代谢及排毒能力;碳固定及淀粉和蔗糖代谢通路下调,表明拟南芥有机物积累受抑制;植物—病原体通路下调,表明拟南芥抵御病原体能力下降。在三种喹诺酮类抗生素胁迫下,线蚓体重及繁殖能力下降,显示出剂量-效应关系,高浓度组中线蚓繁殖能力与对照组差异显著,三种喹诺酮类抗生素对基础生理影响强弱为:恩氟沙星>诺氟沙星>左氧氟沙星。线蚓体内ROS含量随抗生素浓度上升而提高。抗氧化胁迫机制中SOD、GST活性随抗生素浓度增加而先上升后下降。细胞色素P450酶作为线蚓体内外源污染物解毒酶,其活性随抗生素浓度上升而增加,以完成线蚓对体内外源污染物解毒。在三种喹诺酮类抗生素胁迫下,线蚓细胞内免疫识别因子基因相对表达量上升,其中恩氟沙星处理组与对照组相比具有显著差异。细胞内具有溶血功能的抗菌蛋白的基因相对表达量上升,诺氟沙星、恩氟沙星处理组与对照组相比差异显著。线蚓体内溶菌酶基因相对表达量上升。线蚓免疫系统对三种抗生素的响应强弱为:恩氟沙星>诺氟沙星>左氧氟沙星。在恩氟沙星胁迫下,线蚓肠道微生物于门水平放检测到线菌、变形菌、扁平菌、拟杆菌和厚壁菌。恩氟沙星处理组中线蚓肠道微生物群落OTU数、Chao指数和Shannon指数显著降低,表明其肠道微生物丰度和多样性显著降低。基于KEGG数据库,对线蚓肠道微生物进行PICRUSt功能预测,结果显示过氧化物酶体和β-丙氨酸代谢通路显著上调,表明其抗氧化胁迫能力增强;丁酸脂代谢、色氨酸代谢显著上调,表明其免疫保护机制被激活以增强自身免疫保护;氧化磷酸化通路显著下调,表明其粒体能量代谢受抑制;脂多糖的生物合成通路显著下降,表明其肠道微生物细胞膜完整性受威胁;嘧啶代谢、DNA复制、核糖体、同源重组通路显著下降,表明其基因组健康受到威胁;不动杆菌、芽孢杆菌、红球菌与伯克霍尔德菌相对丰度增加,表明线蚓染病风险增加;链霉菌、诺卡氏菌相对丰度上升,鞘氨醇单胞菌相对丰度降低,表明其通过增加抗生素产生以清除致病菌。在恩氟沙星胁迫下,线蚓肠道微生物中抗生素抗性基因、可移动遗传元件多样性及相对丰度显著增加,氟喹诺酮类抗性基因亚型相对丰度最高提高11.72倍,表明恩氟沙星对线蚓进化产生外源压力。线蚓肠道微生物中抗生素抗性基因及微生物相关性分析表明:线蚓产生共抗性可能是抗生素抗性基因间呈正相关导致;致病菌埃希氏菌属、红球菌属和芽孢杆菌属与抗生素抗性基因呈正相关,可能是其相对丰度增加的原因;鞘氨醇单胞菌属与抗生素抗性基因呈负相关,表明线蚓降解抗生素能力受抑制,即减少抗生素降解,以保证体内抗生素灭杀肠道内相对丰度增加的致病菌。
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2021
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