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一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法及在种质保存中的应用

花匠小妙招
2024-12-06 13:14

本申请涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法及在种质保存中的应用。

背景技术：

1、大花石蝴蝶（ petrocosmea grandiflora hemsl.）是苦苣苔科（gesneriaceae）石蝴蝶属（petrocosmea）的多年生小草本，主要分布于云南地区海拔2000米左右的山地石灰岩及山洞岩壁上，为我国特有物种。大花石蝴蝶形态多为莲座型，其花朵比其它石蝴蝶属植物大约一倍左右，花冠紫色或蓝紫色，花色艳丽，以纤小的植株体态和硕大的花朵深受人们亲睐，具有较高的观赏价值和园艺开发潜力，可用于室内盆栽和园林造景等。但由于大花石蝴蝶对生境要求严格，受人类活动影响等原因，导致野外分布狭窄，种群数量极少，目前已列入中国高等植物受威胁物种名录、云南省极小种群野生植物保护名录（2022 版）和云南省重点保护野生植物名录（2023版），依据 iucn红色名录等级评估标准评定其濒危等级为极危(cr)，随时面临灭绝的风险，急需开展行之有效的拯救保护工作。

2、现有技术中，苦苣苔科植物通常以播种、扦插或组织培养的方法进行繁殖，但种子繁殖易受种源及发芽率的影响，扦插成活率则受季节限制且扦插部位单一。植物组织培养作为现代生物技术的一个重要分支，具有产量高、质量好、成本低、繁殖系数高和保护珍惜濒危植物资源等特点，是物种快速繁育、种质资源保存最有效的手段之一，在园艺、花卉等诸多领域中发挥着重要作用。

3、开展大花石蝴蝶组织培养及保存方法相关研究，将为苦苣苔科植物的繁殖育种提供理论和实践参考，也能提供优质实验材料，为后续探讨大花石蝴蝶濒危机制、杂交育种、基因工程和分子研究等奠定基础。但目前，现有技术中涉及到的苦苣苔科植物快速繁殖仅涉及到部分其他种类，并不涉及到大花石蝴蝶，关于大花石蝴蝶通过组织培养技术进行离体繁殖和保存方面的研究未见任何报道。

4、因此，本申请首次对大花石蝴蝶的组织培养快速扩繁技术进行研发，填补该领域的空白，以满足大花石蝴蝶商品化生产、生物技术研究以及种类资源保护的需要。

技术实现思路

1、为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本申请提供一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，该方法首次实现了对于大花石蝴蝶的高频再生繁殖，填补了对于大花石蝴蝶快速扩繁的空白。

2、本申请第一方面提供一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，包括以下步骤：

3、（1）无菌苗的获取：

4、利用大花石蝴蝶进行无菌萌发，获取得到大花石蝴蝶无菌苗；

5、（2）不定芽诱导或者是体细胞胚胎诱导：

6、所述不定芽诱导具体为：将大花石蝴蝶无菌苗大小相对一致的叶片完全切除叶柄后，以远轴面接触培养基的方式接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，不定芽诱导培养基为：1/8ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph为5.8±0.3；8周后将诱导得到的不定芽在相同培养基上进行继代培养28-33d进行不定芽生长，获得继代培养后的诱导芽；

7、所述体细胞胚胎诱导具体为：将大花石蝴蝶无菌苗大小相对一致的叶片完全切除叶柄后，以远轴面接触培养基的方式接种到体细胞胚胎诱导培养基上进行体细胞胚胎诱导，体细胞胚胎诱导培养基为：1/8ms+ba1.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph为5.8±0.3；8周后将诱导得到的体细胞胚胎继代在相同培养基上进行体胚培养使体胚发育成熟，获得体胚分化的小苗；

8、（3）生根和壮苗培养：

9、将步骤（2）中获得的继代培养后的诱导芽或者是体胚分化的小苗，接种到生根培养基上进行生根和壮苗培养，得到生根苗；生根培养基为：1/2ms+ 0.1mg/l iba+ 0.1mg/lnaa+ 1g/l活性炭+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph为5.8±0.3。

10、可选的，在第一方面的一些实施方式中，所述步骤（2）中在将诱导得到的不定芽在相同培养基上进行继代培养时，继代培养条件为：光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

11、可选的，在第一方面的一些实施方式中，所述步骤（2）中在将诱导得到的体细胞胚胎继代在相同培养基上进行体胚培养时，继代培养条件为：光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

12、可选的，在第一方面的一些实施方式中，所述步骤（3）中生根培养条件为光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

13、可选的，在第一方面的一些实施方式中，所述步骤（1）中在利用大花石蝴蝶进行无菌萌发时，用70% 酒精30 s和1% naclo 30 s处理大花石蝴蝶种子。

14、本申请第二方面提供一种基于大花石蝴蝶高频再生繁殖方法获取得到的生根苗在种质保存中的应用，包括将利用该繁殖方法得到的生根苗分成单株接种到离体保存培养基上进行离体保存，离体保存培养基为：1/2ms +蔗糖30g/l+琼脂6g/l ，ph为5.8；离体保存培养条件为光照强度1600lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

15、可选的，在第二方面的一些实施方式中，在所述离体保存培养基上进行离体保存的继代周期为1.5年以上。

16、本申请提供的技术方案可以包括以下有益效果：

17、本发明首次对大花石蝴蝶这一面临濒危的极小种群野生植物进行组织培养快速扩繁技术进行研发，提出针对该植物的组织培养快速扩繁技术以及相关的专用培养基，填补了对于大花石蝴蝶快速扩繁的空白，可有效推动该属植物种质资源的可持续利用和开发。通过本发明中的方法，在利用不定芽诱导技术路线时，8周后不定芽诱导率达98%，并且平均每个外植体诱导的不定芽数高达84个；而在利用体细胞胚胎诱导技术路线时，8周后体胚诱导率达52.77%，平均每个外植体诱导的体细胞胚数达12个；上述两种技术路线均实现了对于大花石蝴蝶的高频再生繁殖。

18、本发明同时提出了基于大花石蝴蝶高频再生繁殖方法获取得到的生根苗在种质保存中的应用，通过特别的离体保存培养基，在该离体保存培养基上进行离体保存的继代周期可长达1.5年以上。

19、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

技术特征：

1.一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，其特征在于，所述步骤（2）中在将诱导得到的不定芽在相同培养基上进行继代培养时，继代培养条件为：光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

3.根据权利要求1所述的一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，其特征在于，所述步骤（2）中在将诱导得到的体细胞胚胎继代在相同培养基上进行体胚培养时，继代培养条件为：光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

4.根据权利要求1所述的一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，其特征在于，所述步骤（3）中生根培养条件为光照强度2000lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

5.根据权利要求1所述的一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法，其特征在于，所述步骤（1）中在利用大花石蝴蝶进行无菌萌发时，用70% 酒精30 s和1% naclo 30 s处理大花石蝴蝶种子。

6.根据权利要求1至5任一项所述的一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法在种质保存中的应用，其特征在于，将利用该繁殖方法得到的生根苗分成单株接种到离体保存培养基上进行离体保存，离体保存培养基为：1/2ms +蔗糖30g/l+琼脂6g/l ，ph为5.8±0.3；离体保存培养条件为光照强度1600lx，光照时间12h/d，温度20±2℃。

7.根据权利要求6中的应用，其特征在于，在所述离体保存培养基上进行离体保存的继代周期为1.5年以上。

技术总结
本申请是关于一种大花石蝴蝶高频再生繁殖方法及在种质保存中的应用，涉及植物组织培养领域，繁殖方法包括以下步骤：（1）无菌苗的获取；（2）不定芽诱导或者是体细胞胚胎诱导；（3）生根和壮苗培养。本申请首次对大花石蝴蝶进行组织培养快速扩繁技术进行研发，提出针对该植物的组织培养快速扩繁技术以及相关的专用培养基，填补了对于大花石蝴蝶快速扩繁的空白，可有效推动该属植物种质资源的可持续利用和开发。通过本发明中的方法，在利用不定芽诱导技术路线时，8周后不定芽诱导率达98%，并且平均每个外植体诱导的不定芽数高达84个；而在利用体细胞胚胎诱导技术路线时，8周后体胚诱导率达52.77%，平均每个外植体诱导的体细胞胚数达12个。

技术研发人员：孟静,常丹,李村富,何俊
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/15