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祝贺！推动基因疗法，生产效率提升20倍！药明生基《自然》子刊发布下一代工具

花匠小妙招
2024-12-07 17:07

▎药明康德内容团队编辑

基因疗法的发展离不开腺相关病毒（AAV）载体的大规模生产，但传统的质粒转染生产方式效率有限。

近期，一篇《自然·通讯》论文介绍了全新的AAV载体生产系统：TESSA。该系统借助辅助腺病毒实现了AAV载体的大规模、安全生产。

与传统手段相比，TESSA技术能将AAV的产能提升20倍，此外产物质量、病毒基因组滴度和转染滴度等指标也有大幅提升，从而造福更多患者。

近30年来，基因疗法的出现开启了现代医学的全新时代，为多种遗传疾病的患者带来了彻底治愈的希望。而在围绕着基因疗法的挑战中，其中一项便是如何将基因编辑工具递送至人体内的目标区域。

不难想象，执行这项任务的载体必须要具备这些基本特性：作为基因要搭乘的“便车”，这个载体能将自身的遗传物质导入宿主细胞；同时，这个载体必须足够安全，没有自我复制能力，也不会致人患病。另外，这个载体需要具有靶向性，能高效地找到目标细胞。

腺相关病毒（AAV）正是满足这些条件的理想载体。作为一种存在复制缺陷的病毒，除非有其他腺病毒的辅助，否则AAV无法自我复制。根据目前的研究，AAV不会致人患病，基因整合进宿主细胞基因组的风险也很低。在AAV的基础上，科学家改造制备的重组腺相关病毒（rAAV）进一步避免了基因整合的风险，因此成为基因疗法的有效载体。

不过，从理论到实际的规模化生产又是另一道难题。当今，rAAV载体的高效规模化生产就面临这样的悖论：直接由载体携带DNA进入目标细胞时，这个名为转染的过程虽然安全，但效率不足；相反，如果有腺病毒辅助参与这个过程，生产效率是提高了，但由于辅助腺病毒能够在宿主细胞中自我复制，可能造成安全隐患。

如何利用辅助腺病毒的高效，同时消除安全隐患，成了长期困扰研究人员的一道难题。近期，在一项发表于《自然·通讯》的研究中，来自药明生基全资英国子公司OXGENE与牛津大学的研究团队开发了一款能够大规模、安全生产无转染rAAV的系统——TESSA。与传统的质粒转染途径相比，无需转染的TESSA技术能将rAAV的产能提升20倍，并确保生产过程安全无污染，产物的质量也远超传统手段。

论文作者之一，药明生基和OXGENE首席科学官Ryan Cawood博士介绍道：“以合理的成本大批量生产纯化的AAV载体，是细胞与基因疗法的产业面临的一项巨大挑战。我们聚焦于辅助腺病毒生产，这种策略易于实现规模化，并且易于操作。”

要规避腺病毒导致污染的风险，让我们从理解腺病毒的生命特性开始。腺病毒的生命周期包括早期与晚期两个阶段：早期阶段提供了rAAV生产所需的辅助功能，而晚期阶段负责生产腺病毒结构蛋白，使得腺病毒能够自我复制。

所以思路很清晰：腺病毒的早期阶段是生产rAAV时希望利用的特性；而晚期阶段却是需要规避的。因此，如果只允许腺病毒经历生命周期的早期阶段、人为终止晚期的结构蛋白合成，那么腺病毒就能辅助rAAV的生产，同时避免造成污染。

▲腺病毒生命周期示意图（图片来源：OXGENE）

要实现这一点，关键就在于如何操纵腺病毒自我复制的开关——主要晚期启动子（major late promoter，MLP）。

可以说，有了MLP调控晚期基因的转录，才有腺病毒结构蛋白的合成。因此，研究团队要做的就是设计基因开关，在受控的条件下终止腺病毒晚期的生命活动。

为此，研究团队基于一种已经被证明有效的基因开关——四环素遏制蛋白（TetR），设计了全新的策略。这类蛋白广泛分布于细菌与古菌中，正常情况下它会与基因组中一个负责基因表达的操纵子结合。这个操纵子（全名四环素抗性操纵子，简称TetO）被遏制蛋白占用后，就无法继续转录下游的基因了。

不过有一种例外情况，一旦有四环素类似物（如强力霉素）存在，那么遏制蛋白就会转而与四环素类似物结合，这时操纵子也空了出来，可以正常调控基因表达。

▲通过插入TetO，让腺病毒无法产生结构蛋白（图片来源：OXGENE）

理解了这个原理后，让我们回到腺病毒的问题上。研究团队向MLP中插入了一个操纵子，这时，当不存在四环素类似物时，遏制蛋白与操纵子结合，MLP受到抑制。结果就是，腺病毒只能进行基因组的复制，却无法生产新的结构蛋白。

由此，一个调控腺病毒结构相关基因表达的反馈循环出现了，这就是四环素激活自沉默腺病毒（Tetracycline-Enabled Self-Silencing Adenovirus，也就是上文中TESSA的全称）系统。

TESSA技术实际生产rAAV的效果究竟如何？研究团队进行了多维度的检验。他们测试了TESSA生产不同rAAV血清型的产能、安全性与质量，尤其是rAAV2血清型——相比于其他天然的AAV血清型，现有途径生产rAAV2的产能明显更低，这也成为困扰业界的一大难题。

为了检验TESSA技术生产rAAV2血清型的产能与质量，研究团队使用经过改造的TESSA技术，在人源细胞系中生产rAAV2，并与目前常用的传统无辅助质粒系统进行了对比。传统途径在72小时时rAAV2产能最高，接近2×104GC/cell（即每个细胞的基因组拷贝数）；相比之下，TESSA在96小时内的产能持续增加，超过了3×105GC/cell。综合而言，TESSA将rAAV载体的产能平均提升了20倍之多。

▲在人源HEK293细胞系中，TESSA生产rAAV2的产能显著高于质粒转染途径（图片来源：参考资料[1]）

除了产能的提升，基于TESSA生产的rAAV2质量（即转导能力）也是基于质粒转染生产的5倍。TESSA技术的安全性同样得到了确认：四环素类似物缺失时，具有感染性的腺病毒几乎消失，避免了可能的污染。

除了rAAV2，研究还验证了TESSA在更多血清型中的优异表现：在rAAV6/8/9中，TESSA将rAAV的产能提升了10~25倍，将产物的转导能力提升了7~60倍，实现了rAAV高效、安全的大规模生产。

总体而言，相比于无辅助的传统质粒系统，TESSA技术生产的病毒滴度可提高1个数量级，不同血清型的转染滴度（含基因组的病毒载体的转染能力）提升了数十甚至数百倍，反映rAAV质量的实心率也提升了13倍左右。rAAV生产效率的提升也将大幅提升基因疗法的效率：以脊髓型肌萎缩症、血友病A和血友病B为例，TESSA的产量可供应的病患人数是传统质粒系统的15倍左右。

这些实验结果共同表明，TESSA能够实现安全、高质量、低成本的大规模产业化rAAV生产，使其有可能颠覆AAV生产工艺、成为行业未来。

Ryan Cawood博士点评道：“TESSA改变了AAV生产的局面，它将推动细胞与基因疗法的发展、造福患者。TESSA还将为全球合作伙伴赋能，以更快的速度为更多患者开发拯救生命的基因疗法。”

参考资料：

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