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毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析

花匠小妙招
2024-12-11 05:14

毛竹Phyllostachys edulis作为经济竹种，经济价值高，生产潜力大，在中国工农业生产和国民经济中占有重要的地位。毛竹营养生长周期长，开花时期不确定，并且开花后集体死亡，导致竹林面积减少，对经济发展和生态环境造成重大损失和破坏。近几年竹子频繁的开花，科研人员不断尝试各种试验手段来探究竹子开花的机制，竹子开花生物学和生殖生物学研究又成为人们关注的重点。近年来，花器官发育研究的快速发展为竹类的花发育研究提供了借鉴和基础，尤其是模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana，金鱼草Antirrhinum majus，矮牵牛Petunia hybrida等开花调控基因及其功能的研究。通过对拟南芥和金鱼草中同源异型突变体进行系统的遗传学分析[2-4]，提出了花器官ABC模型的假说。在植物中，A类基因能够控制花萼形成，A类和B类基因能够共同控制花瓣的形成，B类和C类基因共同决定雄蕊的发生和发育，而C类基因则控制植物心皮的行成。反向遗传学研究显示，D类基因和E类基因的同源基因同样在调控花形态建成方面起重要作用，D类基因调控胚珠的形成和发育[5-7]，而E类基因在所有花器官的形成中起着调控作用[8-10]。在花发育调控中大部分基因属于MADS-box基因家族，该家族基因拥有典型的MADS-box保守结构域，是一类重要的转录因子，主要在植物花器官的发育及开花时间的调控上起作用。目前，从麻竹Dendrocalamus latiflorus和绿竹Bambusa oldhamii中已经分离了与竹子花发育密切相关的MADS-box基因，并对其功能进行初步了分析[11-12]，但是对于毛竹MADS-box基因的相关报道比较少，研究人员曾对毛竹的E类基因PeMADS1进行了初步的鉴定与分析[13]。本研究以毛竹花样品为研究材料，首次克隆了1个A类的MADS-box基因PheMADS15，并对该基因与麻竹、拟南芥和水稻Oryza sativa等不同物种同源基因亲缘关系进行了分析，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）研究它在毛竹不同组织上的表达差异，初步鉴定了PheMADS15的功能，为竹子开花和育种奠定了基础。

1. 材料与方法

1.1 植物材料和主要试剂

PheMADS15基因克隆的材料为毛竹的花穗，毛竹开花实验地位于广西壮族自治区桂林市，位于南岭山系的西南部。该毛竹林属于自然生长状态。以毛竹花器官分离出的花芽、苞片、颖片、稃片、浆片、雄蕊、雌蕊和幼胚为模板，共计8个样品，用于克隆和组织特异性表达分析。

TA克隆T-esay Vector，Taq酶购自TaKaRa公司，柱式DNA胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。转化用的感受态来自天根公司DH5α大肠埃希菌Escherichia coli。Trizol试剂购自Life公司，反转录试剂盒购自Promega公司。SYBR Green I Master试剂盒购自Roche公司。根据毛竹的TIP41作为内参，用于qRT-PCR分析。聚合酶链式反应（PCR）引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法1.2.1 Trizol试剂盒提取毛竹花的总核糖核酸（RNA）

选取生长良好的毛竹花穗，通过Trizol法提取花样品的总RNA，用于PheMADS15基因的克隆。

1.2.2 PCR扩增PheMADS15的全长序列

根据毛竹基因组数据库的PheMADS15 cDNA序列设计PCR引物，PheMADS15-F：5′-AGTTGAACTGAAGAGGATTGAG-3′；PheMADS15-R：5′-CTAAAGAACCCAACCAAGCATG-3′，引物由金唯智生物科技有限公司合成。以毛竹花cDNA为模板，进行PCR。反应体系50.0 μL：5.0 μL 10.0×长和精确聚合酶链式反应（LA PCR）缓冲液（加镁离子优化），8.0 μL三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）（2.5 mmol·L-1），5.0 μL PheMADS15-F（5.0 mmol·L-1），5.0 μL PheMADS15-R（5.0 mmol·L-1），2.0 μL模板，24.5 μL双蒸水和0.5 μL长和精确脱氧核糖核酸（LA DNA）聚合酶。反应程序为94 ℃预变性5 min；然后按下列循环参数进行扩增反应：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，经过30个循环后，72 ℃ 10 min，16 ℃保温。PCR扩增产物进行电泳检验，回收目的DNA片段，与T-easy克隆载体连接，将PCR连接产物热激转化到DH5α感受态细胞，最后涂含Amp的Luria-Bertani（LB）培养基平板，过夜37 ℃培养，然后挑取单克隆进行菌落PCR反应。取1.0 μL菌液，通过引物PheMADS15-F和PheMADS15-R验证，PCR反应程序同上。将检测正确的阳性克隆菌液测序并保菌。

1.2.3 实时定量PCR分析

根据Trizol试剂提取毛竹花样品的总RNA。通过NanoDrop Spectrophotometer ND-100测定提取的总核糖核酸（RNA）的浓度，然后进行电泳检测。根据Promega胶回收试剂盒说明书，取1.0 μg RNA于0.2 mL离心管（EP）中，70 ℃孵育10 min，短暂离心后，置于冰上；准备一个20.0 μL的反应体系：4.0 μL 25 mmol·L-1氯化镁，2.0 μL 10×反转录缓冲液，2.0 μL脱氧核糖核苷三磷酸混合液，0.5 μL RNA酶抑制剂，15.0×16.67 nkat鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶，0.5 μg多聚胸腺嘧啶T重复寡核苷酸[Oligo（dT）]15引物，1.0 μg RNA，最后添加不含核酸酶的水到20.0 μL。混匀后进行反转录反应。使用Oligo（dT）15引物时，42 ℃孵育15 min，95 ℃，5 min，然后转入0~5 ℃放置5 min。得到的cDNA用于下一步的qRT-PCR反应的模板。其反应体系为20.0 μL体系，包括2.0 μL的反转录的cDNA，10.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix，各0.4 μL的上下游引物，加双蒸水至反应总体积为20.0 μL，重复3次·处理-1。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。qRT-PCR使用仪器的是Roche LightCycler® 480。

1.2.4 PheMADS15基因全长序列分析

PheMADS15基因的开放读码框（ORF）由美国生物技术信息中心（NCBI）ORF-finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）来鉴定；通过DNAMAN和MAGE 6.0软件来分析该基因的同源性；用ExPASY（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析氨基酸的相对分子质量和等电点等理化性质。

2. 结果

2.1 毛竹花总RNA的提取

用Trizol试剂提取毛竹总核糖核酸（RNA），测得RNA样品的光密度为1 103.0 ng·L-1。将提取到的RNA作为模板，于-20 ℃冰箱保存，用于后续PCR扩增。

2.2 PheMADS15基因全长的克隆

以毛竹花cDNA为模板，以PheMADS15-F和PheMADS15-R为引物，PCR扩增PheMADS15的全长，PCR产物经过电泳检测，在603 bp处有一条明亮的条带（图 1），与基因组数据的片段大小保持一致，初步判定为目的基因片段。测序的结果表明，该目的基因与毛竹基因组数据库中的cDNA序列完全一致。命名为PheMADS15（GenBank登记号：KU721916）。

图 1 毛竹PheMADS15基因片段电泳图

Figure 1 Electrophoresis of the amplification fragment of PheMADS15 gene of Phyllostachys edulis

2.3 PheMADS15基因和编码蛋白序列分析

用DNAMAN软件和NCBI的Blast在线软件分析测序结果，该基因开放阅读框（ORF）的核酸序列及推导出的氨基酸序列（图 2）。结果表明：毛竹PheMADS15基因序列含有1个603 bp的开放阅读框，编码200个氨基酸。用ExPASY（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析该基因序列编码的蛋白。该蛋白氨基酸的相对分子量为23.48 kD，理论等电点为8.98。

图 2 PheMADS15编码区核酸序列及其氨基酸序列

Figure 2 Nucleotide and predicted amino acid sequence of PheMADS15

2.4 进化树分析

通过MAGE 6.0运用Neighboro-Joining方法构建毛竹与其他物种间的系统进化树。对PheMADS15基因编码的蛋白质进行系统进化分析（图 3），对比麻竹（AAR32118.1），水稻（AAF19047.1），二穗短柄草Brachypodium distachyon（NP_001288319.1），玉米Zea mays（ACG35179.1），小米Setaria italica（XP_004981740.1），高粱Sorghum bicolor（AAB50181.1），小麦Triticum aestivum（ABF57926.1），大麦Hordeum vulgare（AAW82994.1）和拟南芥（AT1G69120），毛竹与麻竹中的DlMADS1和水稻中OsMADS14比较近。这些MADS-box基因都与拟南芥的AP1同源。

图 3 PheMADS15系统进化树分析

Figure 3 Phylogenetic tree analysis of PheMADS15

2.5 PheMADS15组织特异性表达

提取的总RNA电泳检测结果表明，提取的毛竹花的总RNA结构完整，光密度为1 103.0 ng·L-1，可以用于定量PCR分析。用反转录的毛竹花组织cDNA模板进行qRT-PCR，以TIP41作为内参，PheMADS15在毛竹8个样品中进行表达量检测（图 4）。结果显示：PheMADS15的表达量在花蕾中最高，其次是苞片，接着是颖片，而表达量最低是雌蕊，其次是浆片，接着是幼胚。在毛竹花发育的过程中，PheMADS15主要在花初期表达量高，随着毛竹花的不断发育，表达量逐渐减少。

图 4 PheMADS15在毛竹不同组织中特异性表达

Figure 4 Relative expression of PheMADS15 in different tissues of Phyllostachys edulis

3. 讨论

毛竹是中国重要的经济竹种，具有非常独特的性质，在中国具有广泛的栽植面积和非常高的经济价值。目前，竹子造林主要以无性繁殖为主，开花无规律，花粉活性极低，杂交育种进展缓慢，严重阻碍了毛竹新品种培育。现代分子生物学理论和实验技术的快速发展，为阐明竹子开花分子机制奠定了基础，有望突破常规育种的局限性，并加速育种进程。本研究对PheMADS15基因与其他物种的同源基因构建的进化树进行分析，结果表明：毛竹与麻竹的亲缘关系极为相近，其次和水稻的OsMADS14相近，而与玉米的亲缘关系较远，这与之前的报道大体一致。稻亚科Ehrhartoideae和竹亚科Bambusoideae有着比较近的基因序列结构和亲缘关系，在早期，水稻与竹类植物都同属竹亚科[14-15]。

毛竹PheMADS15基因编码的蛋白质与其他物种的MADS-box有着较高的同源性，尤其是与来自麻竹的DlMADS1[16]同源性更高，表明毛竹与麻竹在进化中可能处于比较相近的位置，进而也证明毛竹的MADS-box基因在进化上是相当保守的。PheMADS15基因编码蛋白序列与水稻和拟南芥A类基因同处于一个进化树分支中，推测该基因为A类的功能基因。

A类功能基因在花发育过程中起着重要的调节作用。在拟南芥中，AP1主要在花分生组织的初期高量表达，过表达能提前使植物开花[17-19]，在开花诱导中起着重要的作用。在水稻中，OsMADS14过表达导致水稻提前开花[20]。毛竹的PheMADS15与拟南芥的AP1以及水稻的OsMADS14在一个进化枝上。PheMADS15在毛竹花的初期表达量比较高，尤其是在花芽中。推测PheMADS15在毛竹开花诱导方面可能起着重要的作用，但PheMADS15在竹子中调控开花的机制仍是未知的。以上结果为竹子开花提供了有用的信息。