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一种朱顶红优质种苗组织培养快速繁殖方法与流程

花匠小妙招
2024-12-11 15:22

：
1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种朱顶红优质种苗组织培养快速繁殖方法。

背景技术：
：
2.朱顶红为石蒜科朱顶红属(hippeastrum)多年生草本植物，原产于中南美洲，原生种约有100个，但目前市场上流行的商品种多为杂交种，其商品化生产的种苗多采用切球方式繁殖而来，但从一个新品种的育成到产业化推广一般需要10年左右的时间。我国朱顶红育种起步较晚，但也通过杂交等方法选育出的一些新品种，如果采用切球方式，短期内很难进行种苗的规模化生产而进行推广，利用组织培养技术能有效地解决这个问题，1－2年就能进行其种苗的规模化生产。在植物的组织培养中，通过愈伤组织或体细胞再生体系，存在较大的变异风险，利用丛生芽增殖变异较少。以朱顶红鳞茎为外植体时，存在内生菌而去污难、增殖系数较低等难题。本发明通过独特的处理方法和培养方式及独特的培养基有效地解决了这个问题。

技术实现要素：
：
3.本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种朱顶红优质种苗组织培养快速繁殖方法，从而进行朱顶红新品种优良株系的优质种苗的规模化生产。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：一种朱顶红优质种苗组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
5.a、外植体消毒：将朱顶红鳞茎作为外植体去除叶片和根系，将鳞茎盘切下并切割，鳞茎盘带长度为2
‑
3厘米的鳞茎，将切割后的鳞茎盘进行消毒处理后，接种到不定芽诱导培养基上进行初代培养，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，所述的不定芽诱导培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤5.0
‑
10.0毫克、噻苯隆0.5
‑
1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6.0
‑
6.5克，余量为ms培养基，ph 5.8
‑
6.0；
6.b、不定芽诱导：将初代培养的鳞茎盘转入新的所述的不定芽诱导培养基上继续初代培养，培养基表面加头孢霉素溶液，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，鳞茎盘基部形成不定芽；
7.c、不定芽初代增殖：将初代培养形成的不定芽转入不定芽初代增殖培养基上继代培养，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，获得丛生芽；所述的不定芽初代增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤5.0
‑
10.0毫克、噻苯隆0.5
‑
1.0毫克、硝酸银1.0
‑
5.0毫克、蔗糖30克、琼脂6.0
‑
6.5克，余量为ms培养基，ph 5.8
‑
6.0；
8.d、不定芽壮苗培养：将继代培养获得的丛生芽切割成单芽后放入壮苗培养基上进行壮苗培养，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，单芽基部形成鳞茎；所述的壮苗培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤3.0
‑
5.0毫克、蔗糖40
‑
60克、琼脂6.0
‑
6.5克，余量为改良ms培养基(nh4no3和kno3改变为原来的1.5倍，其余成份不变)，ph 5.8
‑
6.0；
9.e、小鳞茎分切增殖：将步骤d获得的鳞茎切割后接种到增殖培养基上培养，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，鳞茎形成丛生芽；获得的丛生芽能用于生根培养或重复步骤d和e进行继代增殖培养；所述的增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤5.0
‑
10.0毫克、噻苯隆0.5
‑
1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6.0
‑
6.5克，余量为ms培养基，ph5.8
‑
6.0；
10.f、生根培养：将获得的丛生芽切成单芽后接种到生根培养基上进行生根，培养温度24
‑
30℃，光照3000
‑
3500lx，光照12
‑
16小时/天，获得试管苗；所述的生根培养基每升含有：吲哚丁酸0.5
‑
1.0毫克、萘乙酸0.5
‑
1.0毫克、蔗糖40
‑
60克、香蕉匀浆50
‑
100克、琼脂6.0
‑
6.5克，余量为改良ms培养基(nh4no3和kno3改变为原来的1.5倍，其余成份不变)，ph 5.8
‑
6.0；
11.g、试管苗移栽：将试管苗转移到自然光下炼苗，然后洗净根部的培养基，移入栽培基质中培养，获得朱顶红种苗。
12.所述的将切割后的鳞茎盘进行消毒处理具体为：将切割后的鳞茎盘浸泡在体积分数75％酒精中10
‑
30秒，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡8
‑
10分钟，无菌水冲洗4
‑
5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒8
‑
10分钟，无菌水冲洗4
‑
5次，然后置于医用链霉素1500
‑
2000倍稀释液中振荡24小时。
13.所述的外植体是通过以下预处理方法获得的：选择成年朱顶红鳞茎为材料，在选取外植体消毒之前的42天前，先用50％多菌灵可湿性粉剂500
‑
800倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，7天后用72％农用链霉素可溶性粉剂3000
‑
4000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，然后每过7天，用72％农用链霉素可溶性粉剂3000
‑
4000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，最后1次浇灌72％农用链霉素可溶性粉剂3000
‑
4000倍稀释液后7天，选取处理过的朱顶红鳞茎为外植体。
14.所述的栽培基质包括泥炭、椰糠和珍珠岩，所述的泥炭、椰糠和珍珠岩的体积比为3：3：1。
15.所述的朱顶红为圣茵1号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.1’)、圣茵3号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.3’)或双艳朱顶红(hippeastrum
‘
shuangyan’)。
16.优选，所述的头孢霉素溶液为浓度为30
‑
50毫克/升的头孢霉素水溶液。
17.所述的ms为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)；所述的改良ms培养基是将ms培养基中的nh4no3和kno3改变为原来的1.5倍，其余成份不变。
18.本发明采用观赏价值高的朱顶红新品种鳞茎为外植体，经过材料选择和处理、外植体消毒，消毒成功率可达90
‑
95％，采用独特的培养基进行丛生芽的诱导、增殖和生根培养等过程进行优质种苗快速繁殖，移栽的成活率均可达95％以上，试管苗移栽1.5至2年就可开花，本发明的方法生产出的朱顶红新品种种苗具有一致性好，遗传稳定性高，种苗品质好、开花早等特点，实现了朱顶红优质种苗的规模化生产，能为满足朱顶红新品种优质种苗市场的需要提供一条有效的途径。
19.本发明技术切实可行，应用价值高。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式：
20.以下实施例是对本发明进一步说明，而不是对本发明的限制。
21.实施例1：圣茵1号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.1’)的组织培养
22.(1)材料选择和处理
23.圣茵1号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.1’)是2008年以本菲卡朱顶红(h.sandra otway)为母本、红孔雀朱顶红(h.red peacock)为父本进行杂交选育出来并于2020年通过广东省审定的朱顶红新品种。选择成年圣茵1号朱顶红鳞茎为材料，在选取外植体消毒之前的42天前，先用50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，7天后用72％农用链霉素可溶性粉剂3000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片。然后每过7天，用72％农用链霉素可溶性粉剂3000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，最后1次浇灌72％农用链霉素可溶性粉剂3000倍稀释液后7天，选取处理过的鳞茎为外植体。
24.(2)外植体消毒
25.在超净工作台上将鳞茎外植体去除叶片和根系后用体积分数75％酒精棉擦拭干净后将鳞茎盘切下，分成8块，鳞茎盘带长度为3厘米的鳞茎。然后将切割后的鳞茎盘浸泡在体积分数75％酒精10秒，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗4次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次。然后置于医用链霉素1500倍稀释液中在摇床中振荡24小时后，接种到不定芽诱导培养基上进行初代培养，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天。不定芽诱导培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)5.0毫克、噻苯隆(tdz)1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6克，余量为ms培养基，ph 5.8。培养基表面初代培养消毒成功率90％。
26.(3)不定芽诱导
27.由于朱顶红鳞茎中存在较多的内生菌及易褐变，在初代培养30天时要转入新的上述的不定芽诱导培养基上继续初代培养，培养基表面加一层0.5mm高的30毫克/升头孢霉素(cefotaxime sodium)水溶液，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天，再培养25
‑
30天左右能在外植体上鳞茎盘基部形成不定芽。
28.(4)不定芽初代增殖
29.将初代培养形成的不定芽转入不定芽初代增殖培养基上继代培养，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天，不定芽初代增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)5.0毫克、噻苯隆(tdz)1.0毫克、硝酸银1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6克，余量为ms培养基，ph 5.8。无内生菌污染。在45天左右每个外植体能形成1个丛生芽，增殖倍数较低。
30.(5)不定芽壮苗培养
31.将继代培养获得的丛生芽切割成单芽后放入壮苗培养基上进行壮苗培养，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天，壮苗培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)3.0毫克、蔗糖40克、琼脂6克，余量为改良ms培养基，ph 5.8。培养40天单芽基部会形成直径1.0厘米的小鳞茎。
32.(6)小鳞茎分切增殖
33.将每个小鳞茎切取4等份接种到增殖培养基上培养，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天，增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)5.0毫克、噻苯隆(tdz)1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6克，余量为ms培养基，ph 5.8。50天左右每个小鳞茎能形成3个丛生芽。
34.(7)继代增殖
35.将小鳞茎形成的丛生芽切成单芽后重复步骤(5)和(6)进行增殖培养，能获得大量丛生芽。
36.(8)生根培养
37.将增殖获得的丛生芽切成单芽后接种到生根培养基上进行生根，培养温度24℃，光照3000lx，光照16小时/天，生根培养基每升含有：吲哚丁酸(iba)0.5毫克、萘乙酸(naa)1.0毫克、蔗糖40克、香蕉匀浆100克、琼脂6克，余量为改良ms培养基，ph 5.8。生根率100％，60天后可以形成鳞茎直径1.0厘米的完整试管苗。
38.(9)试管苗移栽
39.将具5
‑
6厘米高完整植株的培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗5天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭：椰糠：珍珠岩体积比为3：3：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％，试管苗移栽2年就可开花。
40.实施例2：圣茵3号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.3’)的组织培养
41.(1)材料选择和处理
42.圣茵3号朱顶红(hippeastrum
‘
shengyin no.3’)是2005年以
‘
粉红少女朱顶红’(h.
‘
pink girl’)为母本、
‘
花孔雀朱顶红’(h.
‘
blossom peacock’)为父本进行杂交并于2018年通过广东省审定的朱顶红新品种。
43.选择成年圣茵3号朱顶红鳞茎为材料，在选取外植体消毒之前的42天前，先用50％多菌灵可湿性粉剂700倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，7天后用72％农用链霉素可溶性粉剂3500倍稀释液浇灌一次并喷施叶片。然后每过7天，用72％农用链霉素可溶性粉剂3500倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，最后1次浇灌72％农用链霉素可溶性粉剂3500倍稀释液后7天，选取处理过的鳞茎为外植体。
44.(2)外植体消毒
45.在超净工作台上将鳞茎外植体去除叶片和根系后用体积分数75％酒精棉擦拭干净后将鳞茎盘切下，分成8块，鳞茎盘带长度为2.5厘米的鳞茎。然后将切割后的鳞茎盘浸泡在体积分数75％酒精20秒，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡8分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒9分钟，无菌水冲洗5次。然后置于医用链霉素1800倍稀释液中在摇床中振荡24小时后，接种到不定芽诱导培养基上进行初代培养，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天。不定芽诱导培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)7.5毫克、噻苯隆(tdz)0.8毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph 5.9。培养基表面初代培养消毒成功率93％。
46.(3)不定芽诱导
47.由于朱顶红鳞茎中存在较多的内生菌及易褐变，在初代培养30天时要转入新的上述的不定芽诱导培养基上继续初代培养，培养基表面加一层1.0mm高的40毫克/升头孢霉素(cefotaxime sodium)水溶液，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天，再培养58天左右能在外植体上鳞茎盘基部形成不定芽。
48.(4)不定芽初代增殖
49.将初代培养形成的不定芽转入不定芽初代增殖培养基上继代培养，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天，不定芽初代增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)7.5
毫克、噻苯隆(tdz)0.8毫克、硝酸银3.0毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph5.9。无内生菌污染。在45天左右每个外植体能形成1.5个丛生芽，增殖倍数较低。
50.(5)不定芽壮苗培养
51.将继代培养获得的丛生芽切割成单芽后放入壮苗培养基上进行壮苗培养，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天，壮苗培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)4.0毫克、蔗糖50克、琼脂6.5克，余量为改良ms培养基，ph 5.9。培养45天单芽基部会形成直径1.2厘米的小鳞茎。
52.(6)小鳞茎分切增殖
53.将每个小鳞茎切取4等份接种到增殖培养基上培养，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天，增殖培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)7.5毫克、噻苯隆(tdz)0.8毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph 5.9。50天左右每个小鳞茎能形成3.5个丛生芽。
54.(7)继代增殖
55.将小鳞茎能形成的丛生芽切成单芽后重复步骤(5)和(6)进行增殖培养，能获得大量丛生芽。
56.(8)生根培养
57.将增殖获得的丛生芽切成单芽后接种到生根培养基上进行生根，培养温度27℃，光照3300lx，光照14小时/天，生根培养基每升含有：吲哚丁酸(iba)0.8毫克、萘乙酸(naa)0.8毫克、蔗糖50克、香蕉匀浆50克、琼脂6.5克，余量为改良ms培养基，ph 5.9。生根率100％，60天后可以形成鳞茎直径1.2厘米的完整试管苗。
58.(9)试管苗移栽
59.将具5
‑
6厘米高完整植株的培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗8天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭：椰糠：珍珠岩体积比为3：3：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达97％以上，试管苗移栽20个月就可开花。
60.实施例3：双艳朱顶红(hippeastrum
‘
shuangyan’)的组织培养
61.(1)材料选择和处理
62.双艳朱顶红(hippeastrum
‘
shuangyan’)是2009年以引进的米娜瓦朱顶红(h.minerva)为母本、桑德拉奥薇朱顶红(h.sandra otway)为父本进行杂交选育出来并于2020年通过广东省审定的朱顶红新品种。
63.选择成年双艳朱顶红鳞茎为材料，在选取外植体消毒之前的42天前，先用50％多菌灵可湿性粉剂800倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，7天后用72％农用链霉素可溶性粉剂4000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片。然后每过7天，用72％农用链霉素可溶性粉剂4000倍稀释液浇灌一次并喷施叶片，最后1次浇灌72％农用链霉素可溶性粉剂4000倍稀释液后7天，选取处理过的鳞茎为外植体。
64.(2)外植体消毒
65.在超净工作台上将鳞茎外植体去除叶片和根系后用体积分数75％酒精棉擦拭干净后将鳞茎盘切下，分成16块，鳞茎盘带长度为2厘米的鳞茎。然后将切割后的鳞茎盘浸泡在体积分数75％酒精30秒，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒8分钟，无菌水冲洗4次。然后置于医用链霉素2000倍稀释液中在摇床中振荡24小时后，接种到不定芽诱导培养基上进行初代培养，培养温度30℃，光照
3500lx，光照12小时/天。不定芽诱导培养基每升含有：6
‑
苄基嘌呤(6
‑
ba)10.0毫克、噻苯隆(tdz)0.5毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph 6.0。培养基表面初代培养消毒成功率95％。
66.(3)不定芽诱导
67.由于朱顶红鳞茎中存在较多的内生菌及易褐变，在初代培养30天时要转入新的上述的不定芽诱导培养基上继续初代培养，培养基表面加一层1.5mm高的50毫克/升头孢霉素(cefotaxime sodium)水溶液，培养温度30℃，光照3500lx，光照12小时/天，再培养30天左右能在外植体上鳞茎盘基部形成不定芽。
68.(4)不定芽初代增殖
69.将初代培养形成的不定芽转入不定芽初代增殖培养基上继代培养，培养温度30℃，光照3500lx，光照12小时/天，不定芽初代增殖培养基每升含有：6
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苄基嘌呤(6
‑
ba)10.0毫克、噻苯隆(tdz)0.5毫克、硝酸银5.0毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph6.0。无内生菌污染。在45天左右每个外植体能形成2个丛生芽，增殖倍数较低。
70.(5)不定芽壮苗培养
71.将继代培养获得的丛生芽切割成单芽后放入壮苗培养基上进行壮苗培养，培养温度30℃，光照3500lx，光照12小时/天，壮苗培养基每升含有：6
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苄基嘌呤(6
‑
ba)5.0毫克、蔗糖60克、琼脂6.5克，余量为改良ms培养基，ph 6.0。培养50天单芽基部会形成直径1.5厘米的小鳞茎。
72.(6)小鳞茎分切增殖
73.将每个小鳞茎切取4等份接种到增殖培养基上培养，培养温度30℃，光照3500lx，光照12小时/天，增殖培养基每升含有：6
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苄基嘌呤(6
‑
ba)10.0毫克、噻苯隆(tdz)0.5毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，余量为ms培养基，ph 6.0。50天左右每个小鳞茎能形成4个丛生芽。
74.(7)继代增殖
75.将小鳞茎形成的丛生芽切成单芽后重复步骤(5)和(6)进行增殖培养，能获得大量丛生芽。
76.(8)生根培养
77.将增殖获得的丛生芽切成单芽后接种到生根培养基上进行生根，培养温度30℃，光照3500lx，光照12小时/天，生根培养基每升含有：吲哚丁酸(iba)1.0毫克、萘乙酸(naa)0.5毫克、蔗糖60克、香蕉匀浆100克、琼脂6.5克，余量为改良ms培养基，ph 6.0。生根率100％，60天后可以形成鳞茎直径1.5厘米的完整试管苗。
78.(9)试管苗移栽
79.将具5
‑
6厘米高完整植株的培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭：椰糠：珍珠岩体积比为3：3：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％以上，试管苗移栽1.5年就可开花。