一种杜鹃花组织培养快速繁殖方法与流程
本发明涉及一种组织培养快速繁殖方法，具体涉及一种杜鹃花组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
杜鹃花的组织培养快速繁殖过程包括：外植体的选择、消毒、丛生苗诱导、继代培养、生根培养及试管苗移栽。一般情况下，杜鹃花的组织培养选择当年生的幼嫩茎段、茎尖、花蕾或者叶片作为外植体；外植体的消毒剂一般选择中性洗涤剂、升汞、酒精及NaClO等，各个消毒剂的消毒时间要控制在一个适当的时间才能达到较好的消毒效果。如专利CN201010240170公开了一种大白杜鹃组培快速繁殖方法，采用组织培养技术对种子胚的子叶和胚轴进行愈伤组织诱导继而形成丛生芽而后分化成完整植株的一种快速繁殖方法。该专利需要生根培养和试管苗移植两个过程。
现有技术存在以下缺点：
(1)组织培养繁殖所需成本高并且技术要求也高，怎么缩短组织培养繁殖时间从而节省成本，并有效提高组培苗的炼苗驯化成活率成为组培繁殖的关键。
(2)花蕾的分化较为困难，周期长；茎尖的取材受到一定时间的限制，一般采用茎节或者叶片作为初代培养的外植体，但是杜鹃花的枝叶上有腺毛，且黏性大，会沾有很多污物和细菌，不易消毒杀菌，但如果消毒剂过量使用又会导致枝叶的枯萎。
(3)升汞时间处理过长容易造成外植体材料的褐变死亡，处理过短消毒不彻底，控制升汞处理的时间成为一个难题。
(4)杜鹃花在幼芽培养中激素的种类及用量不容易控制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种杜鹃花组织培养快速繁殖方法，该方法简化了杜鹃花组织培养的步骤，节约了组培成本，提高了瓶外生根率和组培苗的炼苗驯化成活率。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种杜鹃花组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)杜鹃花无菌播种苗获取：选取杜鹃种子，经赤霉素处理后再用含有吐温80的酒精浸泡，接着用升汞和次氯酸钠消毒，再用无菌水冲洗，获得消毒过的杜鹃种子，将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，获得杜鹃花无菌播种苗；
(2)丛生苗诱导：将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导，获得大量的组培苗；
(3)组培苗瓶外生根：选取栽培基质，剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，并控制湿度、温度和光照，待组培苗生根后再进行育苗即可。
在上述杜鹃花组织培养快速繁殖方法中：
步骤(1)中赤霉素的浓度为140～160mg/L，更佳为150mg/L，赤霉素处理时间优选为7～9h，更佳为8h。
步骤(1)中酒精的体积百分含量为70～75％，更佳为75％，吐温80的用量优选为酒精总体积的0.8～1.2％，更佳为1.0％，优选用含有吐温80的酒精浸泡4～6min，更佳为5min。
步骤(1)中升汞的质量百分含量优选为0.1～0.14％，更佳为0.1％，消毒时间优选为6～8min，更佳为7min，NaClO的质量百分含量优选为8～12％，更佳为10％，消毒时间优选为8～10min，更佳为9min。
步骤(1)中将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，25～35天后获得杜鹃花无菌播种苗，更佳为30天后获得杜鹃花无菌播种苗。
步骤(2)中玉米素ZT(zeatin)的用量优选为1L Read培养基中含有0.8～1.2mg，更佳为1.0mg。
步骤(2)中将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导28～32天后，更佳为30天，获得大量的组培苗。
步骤(3)中所述的栽培基质为泥炭土和蛭石，二者的体积比为1～2:1；所述泥炭土和蛭石使用前先经18目筛过筛处理和高压蒸汽灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌时间为1.5～2.5h，更佳为2h。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部前，所述组培苗先从培养室中移出，并逐渐打开组培瓶的盖子，使组培苗适应外界光照和温度条件，并保持空气湿度为80～85％，经6～8天(更佳为7天)后再剪取组培苗的茎部进行瓶外生根。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗，洗去培养基，并去掉组培苗茎段下部的叶片，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆盖保持湿度和温度，并遮荫培养，14～16天(更佳为15天)后去掉薄膜，保持湿度为80～85％，待组培苗生根后移植到育苗盘上育苗即可。
本发明具有以下优点：
(1)本发明方法取代了传统上的生根培养和试管苗移植两个过程，只需进行瓶外生根过程，简化了杜鹃花组织培养的步骤，节约了组培成本，同时，本发明的瓶外生根率可达90％，并进一步大大提高了组培苗的炼苗驯化成活率；
(2)本发明方法以种子为材料获得无菌播种苗，以无菌苗为外植体，组培材料不仅容易获取，而且容易消毒；
(3)本发明方法采用升汞和NaClO消毒，不仅保障种子污染率低，又保障了种子的萌发率；
(4)本发明方法中组培苗(丛生苗)诱导培养基选择Read基本培养基，并添加激素ZT，可使丛生苗密而壮；
(5)本发明方法中瓶外栽培基质(生根基质)用18目的筛子过筛，以便利于根系附着，这大大提高了组培苗瓶外生根率；
(6)本发明方法也可适用于杜鹃花杂交种子试管发芽中，提高杜鹃花新品种育苗。
附图说明
图1是采用实施例1中杜鹃花组织培养快速繁殖方法培育获得的杜鹃花无菌播种苗；
图2是采用实施例1中杜鹃花组织培养快速繁殖方法培育获得的杜鹃花组培苗(瓶外生根)。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的杜鹃花组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)获得杜鹃花无菌播种苗，将杜鹃种子用150mg/L的赤霉素处理8个小时后用75％(体积百分含量)的酒精(每100mL酒精中添加1mL已灭菌的吐温80)浸泡5min，之后在超净工作台上用0.1％(质量百分含量)的升汞消毒7min，再用10％(质量百分含量)的NaClO消毒9min，最后用无菌水冲洗4～5遍，用已灭菌的镊子将消过毒的杜鹃种子接种到不含任何激素的1/2Read培养基上无菌培养大约30天后获得无菌苗，如图1所示；
(2)获得大量的无菌丛生苗，将上述无菌播种苗去根后接种到Read+ZT1.0mg/L培养基上进行丛生苗诱导，玉米素ZT的用量为1L Read培养基中含有0.8～1.2mg，1个月后获得大量的无菌组培苗；
(3)组培苗的瓶外生根，从培养室里移出组培苗使得组培苗适应外界光照条件及温度一段时间，7天之后将培养瓶的盖子松开并每天逐渐打开，保持培养苗的空气湿度为85％，经过7天之后开始移栽进行组培苗瓶外生根，将进口泥炭和蛭石用18目的筛子过筛作为栽培基质，泥炭土与蛭石按体积1∶1混合后并在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌2小时后待用，作为无菌苗瓶外生根的培养基质，剪取丛生苗，洗去培养基，并去掉茎段下部的叶片，扦插于培养基质中，用透明的塑料薄膜覆盖保持湿度和温度，并适当的遮荫培养。15天后去掉薄膜，并每天雾喷保持一定的湿度(保持湿度为80～85％，)，待组培苗生根后可移植到育苗盘上育苗。
步骤(2)中Read培养基成分含量如表1所示。
表1Read培养基成分含量
步骤(1)中的1/2Read培养基，其大量元素为Read培养基大量元素的一半，其他成分与Read培养基含量相同。
培养获得的组培苗如图2所示，从图2中可以看出组培苗的瓶外生根效果好，因此使用本发明中的瓶外生根方法不仅缩短了组培繁殖的时间，还大大提高了组培苗瓶外生根率和炼苗成活率。
实施例2
本实施例提供的杜鹃花组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)杜鹃花无菌播种苗获取：选取杜鹃种子，经赤霉素处理后再用含有吐温80的酒精浸泡，接着用升汞和次氯酸钠消毒，再用无菌水冲洗，获得消毒过的杜鹃种子，将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，获得杜鹃花无菌播种苗；
(2)丛生苗诱导：将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导，获得大量的组培苗；
(3)组培苗瓶外生根：选取栽培基质，剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，并控制湿度、温度和光照，待组培苗生根后再进行育苗即可。
步骤(1)中赤霉素的浓度为140mg/L，赤霉素处理时间为9h。
步骤(1)中酒精的体积百分含量为70％，吐温80的用量为酒精总体积的0.8％，用含有吐温80的酒精浸泡6min。
步骤(1)中升汞的质量百分含量为0.12％，消毒时间为8min，NaClO的质量百分含量为8％，消毒时间为10min。
步骤(1)中将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，35天后获得杜鹃花无菌播种苗。
步骤(2)中玉米素ZT的用量为1L Read培养基中含有0.8mg。
步骤(2)中将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导28天后，获得大量的组培苗。
步骤(3)中所述的栽培基质为泥炭土和蛭石，二者的体积比为1.5：1，泥炭土和蛭石使用前先经18目筛过筛处理和高压蒸汽灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌时间为1.5h。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部前，所述组培苗先从培养室中移出，并逐渐打开组培瓶的盖子，使组培苗适应外界光照和温度条件，并保持空气湿度为80％，经8天后再剪取组培苗的茎部进行瓶外生根。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗，洗去培养基，并去掉组培苗茎段下部的叶片，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆盖保持湿度和温度，并遮荫培养，14天后去掉薄膜，保持湿度为85％，待组培苗生根后移植到育苗盘上育苗即可。
实施例3
本实施例提供的杜鹃花组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)杜鹃花无菌播种苗获取：选取杜鹃种子，经赤霉素处理后再用含有吐温80的酒精浸泡，接着用升汞和次氯酸钠消毒，再用无菌水冲洗，获得消毒过的杜鹃种子，将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，获得杜鹃花无菌播种苗；
(2)丛生苗诱导：将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导，获得大量的组培苗；
(3)组培苗瓶外生根：选取栽培基质，剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，并控制湿度、温度和光照，待组培苗生根后再进行育苗即可。
步骤(1)中赤霉素的浓度为160mg/L，赤霉素处理时间为7h。
步骤(1)中酒精的体积百分含量为72％，吐温80的用量为酒精总体积的1.2％，用含有吐温80的酒精浸泡4min。
步骤(1)中升汞的质量百分含量为0.14％，消毒时间为6min，NaClO的质量百分含量为12％，消毒时间为8min。
步骤(1)中将消毒过的杜鹃种子接种到1/2Read培养基上无菌培养，25天后获得杜鹃花无菌播种苗。
步骤(2)中玉米素ZT的用量为1L Read培养基中含有1.2mg。
步骤(2)中将步骤(1)中获得的杜鹃花无菌播种苗去根后接种到含有玉米素ZT的Read培养基上进行丛生苗诱导32天后，获得大量的组培苗。
步骤(3)中所述的栽培基质为泥炭土和蛭石，二者的体积比为2：1，泥炭土和蛭石使用前先经18目筛过筛处理和高压蒸汽灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌时间为2.5h。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗的茎部前，所述组培苗先从培养室中移出，并逐渐打开组培瓶的盖子，使组培苗适应外界光照和温度条件，并保持空气湿度为82％，经6天后再剪取组培苗的茎部进行瓶外生根。
步骤(3)中剪取步骤(2)中获得的组培苗，洗去培养基，并去掉组培苗茎段下部的叶片，扦插于栽培基质中进行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆盖保持湿度和温度，并遮荫培养，16天后去掉薄膜，保持湿度为82％，待组培苗生根后移植到育苗盘上育苗即可。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。
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