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中科院1区-南中医等揭示桔梗提取物通过与肠道菌群的相互作用改善代谢综合征机制

花匠小妙招
2024-12-11 17:50

桔梗提取物通过与肠道菌群的相互作用改善代谢综合征研究成果发表于《Phytomedicine》

代谢综合征是以胰岛素抵抗为核心的症状集合，包含中心性肥胖、血脂异常、肝脂肪变性等一系列代谢紊乱病理状态。中医学认为痰瘀阻滞既是代谢综合征脏腑功能失调的病理产物，同时又是影响该病发展演变的关键病机环节。

祛痰是药食两用中药桔梗的主要功效之一。痰有“有形和无形、狭义和广义”之分，既往对桔梗“祛痰”功效主要关注于“有形、狭义之痰”，而对“无形、广义之痰”关注甚少。元代医家朱丹溪在《丹溪心法》中提出“肥白人多痰”，就是指肥胖的人体内多有“无形之痰”。脂肪具有“痰”的污浊、黏滞、稠厚的特性，由体内水湿中的污浊部分凝聚而成。

已有研究报道桔梗具有改善代谢综合征相关症状、提高胰岛素敏感性的作用，但机制尚不明确。团队前期研究发现，桔梗皂苷的口服生物利用度极低（J Ethnopharmacol, 2015），后以皂苷类成分为对象，提出了低口服生物利用度中药活性成分可能通过与肠道菌群的相互作用改善代谢综合征的假说模型（Pharmacol Res, 2020）。2023年1月，南京中医药大学单进军、狄留庆团队在植物医学领域国际著名期刊Phytomedicine（IF=6.656，中科院1区）发表了题为Platycodon grandiflorus root extract activates hepatic PI3K/PIP3/Akt insulin signaling by enriching gut Akkermansia muciniphila in high fat diet fed mice的研究性论文。该工作基于桔梗“祛痰”功效，围绕肠道菌群探讨了其防治代谢综合征的潜在机制。

研究背景

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MetS）通常由不健康的饮食和久坐不动的生活方式引起，是多种代谢症状的集合，包括胰岛素抵抗、肥胖、血脂异常和脂肪肝等。PI3K/PIP3/AKT信号通路受损导致的胰岛素抵抗是代谢综合征的核心症状。近年来发现肠道菌群与胰岛素信号密切相关。高脂肪饮食可以重塑肠道菌群，产生过多的细菌脂多糖（LPS），导致肠道屏障破坏。肠道屏障受损进一步导致宿主代谢性内毒素血症和炎症，磷酸化肝JNK，从而磷酸化IRS的丝氨酸残基，减少酪氨酸残基的磷酸化，阻断PI3K/PIP3/Akt 胰岛素信号传导。因此，逆转肠道菌群失调和修复肠道屏障正成为激活胰岛素信号的新靶点。Akkermansia muciniphila作为一种在人类和小鼠肠道中含量丰富的微生物，被发现有益于缓解MetS症状。

研究发现，桔梗可显著减少与代谢综合征相关的症状。体内研究表明，它下调ACC、FAS等脂肪生成蛋白，并上调CPT1、HSL、UCP2等脂肪分解蛋白，以减轻肥胖和肝脂肪变性。也有报道表明其可以激活小鼠的肝脏PI3K/Akt/GSK3β信号通路，增加葡萄糖耐量。然而，其抗MetS机制的细节尚不清楚。研究人员通常将之归因于桔梗皂苷，据报道说明，这些五环三萜皂苷可以激活脂肪组织中的AMPK通路或肝脏中的PPARα通路。虽然三萜皂苷是桔梗根提取物（PRE）中最独特的成分，但它们在胃肠道中的吸收较差，进而导致体内靶标的直接激活不足，但另一方面可能会增加与肠道菌群相互作用的机会。因此，在这项工作中，我们探究了PRE是否以肠道微生物群依赖性方式缓解代谢综合征，以及它通过肠道微生物群发挥作用的潜在机制。

研究内容

Results 1 PRE减轻高脂肪饮食小鼠的MetS症状。

肥胖、胰岛素抵抗、肝脂肪变性和血脂异常是代谢综合征的主要症状。低剂量桔梗提取物（PRE_L）和高剂量桔梗提取物（PRE_H）处理12周都可以显着抑制HFD小鼠的体重增加（图 1A）。通过CT扫描进行的身体成分分析显示，经过预处理的HFD小鼠的内脏脂肪组织（VAT）和皮下脂肪组织（SAT）体积显著减少（图 1B-C），与此一致的是，在 eWAT 中可以观察到脂肪细胞的大小减少（图 1E）。同时，OGTT和ITT显示PRE治疗明显改善了HFD小鼠的胰岛素敏感性（图 1D）。此外，PRE减少了肝脏中脂滴、TAG和TC的积累（图 1E-F），这表明它具有抑制肝脂肪变性的作用。PRE还显着降低了HFD小鼠的血清TAG、TC、HDL-c和LDL-c浓度（图 1G）。值得一提的是，PRE对ND小鼠的上述指标无显著影响，对HFD小鼠和ND小鼠的摄食也无影响（图 1H）。

图1 PRE减轻了HFD小鼠的MetS症状。C57 BL/6J小鼠分别用ND、ND+PRE_H、HFD、HFD+PRE_H和HFD+PRE_L处理12周。（A）体重增加，n=10。（B）CT，n=5。VAT标记为黄色，SAT标记为绿色。（C）VAT和SAT体积。（D）OGTT和ITT的血糖曲线和曲线下面积（AUC），n=5。（E）eWAT和肝组织的HE染色，n=3；肝组织油红O染色，n=3。（F）肝脏TC和TAG，n=8。（G）血清LDL-c、HDL-c、TC和TAG，n=10。（H）每只小鼠的每日食物摄入量。所有值均表示为平均值±标准差。与ND小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与HFD小鼠相比，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。

Results 2 PRE逆转了HFD小鼠的肝脏脂质紊乱并激活了肝脏胰岛素信号传导。

胰岛素抵抗的发生与肝脏脂质代谢异常密切相关。为了全面研究PRE对肝脏脂质代谢的影响，对ND、ND+PRE_H、HFD和HFD+PRE_H小鼠进行了脂质组学分析。总体而言，HFD小鼠的肝脂质谱与ND小鼠显著不同，尤其是在TAG和磷脂（PLs）的相对丰度方面，而PRE_H逆转了这种不平衡趋势（图 2A-C）。接下来，共鉴定出来自24个脂质亚类的397种脂质，其中252种在HFD和ND小鼠之间的丰度存在显着差异，其中186种被PRE_H逆转。PRE_H逆转的最显著50种脂质的热图如图2D所示。PRE_H处理的HFD小鼠的肝TAG、甘油二酯（DAG）和多不饱和脂肪酸（PUFA）水平降低，而甘油磷脂如磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）丰度增加（图2D-F）。这些甘油脂或PLs的变化与肝脏胰岛素敏感性有关。值得注意的是，PI通过肌醇磷酸代谢途径相关产生PIP3。因此，进一步测定了肝脏PIP3的水平，发现PRE_H处理的HFD小鼠中PIP3增加，表明PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路可能被激活（图 2G）。实际上，在PRE_H处理的HFD小鼠中，PI3K p110的肝脏表达和Akt（Ser 473）的磷酸化增加，而IRS-1（Ser 307）的磷酸化减少（图 2H）。

图2 PRE逆转了HFD小鼠的肝脏脂质紊乱并激活了肝脏胰岛素信号传导。肝脏脂质组学是通过UPLC-MS/MS进行的。（A）正离子模式下脂质的总离子流TIC色谱图。（B, C）分别在正离子和负离子模式下鉴定的脂质的主成分分析（PCA）。（D）由PRE逆转的最显著的50种差异脂质的热图。（E）ChemRich分析HFD和ND小鼠之间的脂质；红色代表上升趋势，蓝色代表下降趋势，紫色代表两者势均力敌；气泡越大，富集的显着差异脂质越多。（F）ChemRich分析HFD+PRE_H和HFD小鼠之间的脂质变化。（G）肝脏PIP3，n=6。（H）肝脏pS307IRS-1、IRS-1、p110、pS473Akt 和Akt，n=3。所有值均表示为平均值±标准差。与ND小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与HFD小鼠相比，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。

Result 3 PRE重塑HFD小鼠的肠道微生物组，尤其是A. muciniphila的丰度增加。

PRE中的主要成分，如皂苷和多糖，不易被吸收，有机会与肠道微生物相互作用。我们假设PRE通过肠道菌群激活PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路。对ND、HFD和 HFD+PRE_H小鼠的粪便进行16S rDNA测序，发现PRE_H明显重塑 HFD喂养小鼠的肠道微生物群落（图 3A）。尤其是粪便厚壁菌门与拟杆菌门的比例在HFD小鼠中显着增加，并被PRE_H逆转，尽管没有统计学意义（图 3B）。HFD和HFD+PRE_H小鼠之间的LDA分析表明，在HFD小鼠粪便中，有20种占优势，而在PRE_H处理的小鼠粪便中，有17种占优势。LDA分数图如图3C所示。其中，我们对A. muciniphila特别感兴趣，它是一种抗代谢综合征的微生物，近年来被誉为“下一代益生菌”。为了进一步确认组间A. muciniphila丰度的变化，我们提取了粪便微生物的宏基因组，并设计了靶向A. muciniphila的引物。响应于PRE_H处理，HFD小鼠的A. muciniphila丰度增加了470倍（图 3D）。A. muciniphila降解宿主肠黏膜的黏蛋白或益生元作为其生存来源。尽管PRE没有上调HFD小鼠中黏蛋白相关基因Muc2的结肠表达（图 3E），但共孵育表明它可以直接促进A. muciniphila的生长（图 3F），说明PRE是潜在的A. muciniphila益生元。肠道A. muciniphila富集有益于肠道屏障的完整性，并且HFD+PRE_H小鼠在结肠表达中显示出紧密连接蛋白1基因Tjp1和occludin 蛋白基因Ocln的显著上调（图 3G），并显著减少血清LPS和TNF-α水平（图 3H）。降低的炎症水平减轻了肝脏JNK的磷酸化（图 3I）。由于JNK可以在丝氨酸307等抑制位点磷酸化IRS-1蛋白以阻断胰岛素信号通路，重塑肠道微生物组以改善肠道屏障并减少代谢性炎症可能是PRE的抗代谢综合征机制 .

图3 HFD小鼠的PRE重塑肠道微生物组，尤其是A. muciniphila的丰度增加。（A）粪便微生物组的PCoA β多样性分析（n=4）。（B）厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比，n=4。（C）HFD小鼠和HFD+PRE_H小鼠之间由LDA确定的区分分类群（log10 LDA>2）。（D）通过qPCR测量的粪便A. muciniphila丰度，n=8。（E）结肠 Muc2基因表达，n=6。（F）A. muciniphila和1.12 mg/mL PRE（n=3）的体外共孵育；*p<0.05，***p<0.001。（G）结肠Tjp1和Ocln基因表达，n=5。（H）血清LPS和TNF-α（n=5）。（I）肝脏pT183/Y185JNK和JNK，n=3。所有值均表示为平均值±标准差。与ND小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与HFD小鼠相比，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。

Results 4 口服A. muciniphila可刺激HFD小鼠的肝脏胰岛素信号传导，显示出与PRE相似的代谢益处。

PRE重塑HFD小鼠肠道菌群，改善肠道屏障，降低肝脏JNK的磷酸化，这可能是其激活肝脏PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路的机制。由于A. muciniphila是响应PRE给药后富集程度最高的微生物之一，且据报道其可以修复宿主的肠道屏障，我们推测它可能介导PRE的抗MetS作用。因此，我们研究了A. muciniphila给药对激活HFD小鼠胰岛素信号传导的影响。12周的治疗显著增加了粪便A. muciniphila的水平（图 S3A）。与PRE给药类似，A. muciniphila在12周治疗后显着减轻了MetS相关症状，例如肥胖、胰岛素抵抗、肝脂肪变性和高脂血症（图 4A-D），重塑了肝脂质谱，减少肝TAG、DAG、游离脂肪酸，增加PC、PI（图 4E-F）。值得注意的是，HFD+AKK小鼠的肝脏PIP3水平也增加（图 4G）。最后，发现A. muciniphila治疗增加了结肠Tjp1表达（图 4H），并进一步降低了血清LPS和TNF-α水平（图 4I），这降低了JNK的肝磷酸化，减轻了对PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路的抑制。

图4 口服A. muciniphila可刺激HFD小鼠的肝脏胰岛素信号传导。每天给HFD小鼠灌胃A. muciniphila，浓度为2×108 cfu/0.2 mL，持续12周。（A）体重增加，n=6-8。（B）OGTT和ITT中的血糖曲线和AUC，n=5。（C 血清LDL-c、HDL-c、TC、TAG和肝TC、TAG，n=6-8。（D）eWAT和肝组织的HE染色，肝组织油红O染色，n=4。（E）正离子模式下脂质谱的TIC色谱图。（F）ChemRich分析HFD小鼠和HFD+AKK小鼠之间的脂质。（G）肝脏PIP3，n=6。（H）结肠Tjp1和Ocln基因表达，n=5。（I）血清LPS和TNF-α，n=5。（J）肝脏pS307IRS-1、IRS-1、pS473Akt、Akt、pT183/Y185JNK、JNK、p110、n=3。所有值均表示为平均值±标准差。与ND小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与HFD 小鼠相比，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。

Result 5 PRE以肠道微生物群依赖的方式减轻了MetS。

进行FMT和肠道微生物群耗竭实验以研究PRE是否以肠道微生物群依赖性方式缓解MetS。FMT的研究设计如图5A所示。喂食12周后，Rec-HFD+PRE_H小鼠的粪便A. muciniphila丰度更高（图 5B），体重增加率显著下降（图 5C）、胰岛素抵抗（图 5D）、高脂血症（图 5E）和肝脏脂质积累（图 5F-G）缓解。总的来说，受体鼠表现出与各自供体鼠相似的表型，这表明肠道微生物可以传递PRE治疗的抗MetS作用。接下来，Abs用于消除HFD和HFD+PRE_H小鼠的肠道微生物。正如预期的那样，A. muciniphila在Abs处理后被耗尽（图 5J）。由于肠道微生物群的缺失，PRE无法进一步缓解肥胖（图 5H）、胰岛素抵抗（图 5I）、高脂血症和肝脂肪变性（图 5K）。上述结果表明PRE以肠道微生物群依赖性方式干预MetS。

图5 PRE以肠道微生物群依赖的方式减轻了MetS。在FMT实验中：（A）在喂养4周后，收集HFD小鼠和HFD+PRE_H小鼠的粪便用于微生物群提取。喂食HFD的受体用Abs预处理一周，每两天通过强饲法接受FMT，持续8周，并继续喂食HFD 3周。（B）粪便A. muciniphila丰度，n=6-8。（C）体重增加，n=6-8。（D）OGTT和ITT的血糖曲线和AUC，n=5。（E）血清LDL-c、HDL-c、TC和TAG，n=6-8。（F）肝脏TC和TAG，n=6-8。（G）肝组织HE染色和油红O染色，n=3-4。在肠道微生物群耗竭实验中，每天给 HFD小鼠和HFD+PRE_H小鼠注射Abs：（H）体重增加，n=6-8。（I）OGTT和ITT血糖浓度变化曲线及AUC，n=5。（J）粪便A. muciniphila丰度，n=6-8。（K）肝组织HE染色和油红O染色，n=3-4。所有值均表示为平均值±标准差。在FMT实验中，与Don-HFD 小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与 Rec-HFD小鼠相比，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001。在肠道微生物群耗竭实验中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

总结与思考

在这项工作中，我们建立了PRE干预、A. muciniphila富集和PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号激活之间的联系。证明了A. muciniphila的富集是PRE干预的直接结果，而不是症状改善的结果。同时，我们发现A. muciniphila治疗后肠道屏障损伤和血清炎症得到缓解，激活下游PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路，这与在接受PRE治疗的HFD小鼠中观察到的效果一致。因此，我们认为A. muciniphila是一个重要的媒介，PRE通过它调节肠道微生物群以激活肝脏胰岛素信号传导。这项工作的另一个关键点是揭示了肠道菌群变化与疾病改善之间的因果关系。通过FMT，我们发现PRE处理的HFD小鼠的表型可以传递给它们的受体，这似乎表明粪便微生物群可以介导PRE的抗代谢综合征作用。然而，一个潜在的争议是，PRE的成分可能保留在粪便提取物中，导致无法确定肠道微生物所起的作用。因此，我们进一步研究了PRE对肠道微生物耗尽的HFD小鼠的抗MetS作用。有趣的是，虽然缓解了一些症状，但在此基础上给予PRE无法进一步改善MetS 表型。因此，我们认为PRE以依赖于肠道微生物群的方式减轻代谢综合征。

总之，这项工作首次揭示了肠道微生物在桔梗缓解MetS中的决定性作用，且证明了A. muciniphila可能介导其激活肝脏胰岛素信号传导的作用。PRE逆转了MetS小鼠的肠道生态失调，尤其是增加了A. muciniphila的丰度，从而上调了结肠紧密连接蛋白的基因表达。肠道屏障的改善进一步减轻了代谢性内毒素血症和炎症，导致肝脏中JNK的磷酸化降低，并抑制IRS上丝氨酸残基的磷酸化。下游PI3K/PIP3/Akt胰岛素信号通路的受损减轻，症状减轻（图6）。我们建议进一步研究基于肠道菌群的PRE抗MetS作用机制，促进其临床应用。

图 6 A. muciniphila 介导 PRE 的抗 MetS 作用。

本工作获得国家自然科学基金（No. 81774156、81001499）、江苏省六大人才高峰项目（No. YY-022）、江苏省高等学校重点学科建设项目、江苏省高等学校重点学科建设课题南京中医药大学中医药学科开放项目（No. ZYX03KF050）、江苏省研究生科研与实践创新项目（No. SJCX21_0673、KYCX21_1782）。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711322006833?via%3Dihub

排版编辑：秦丽红、张瀚文

稿件审阅：狄留庆

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