巧克力文心兰离体培养优化及抗病基因克隆与表达分析
巧克力文心兰离体培养优化及抗病基因克隆与表达分析
【摘要】： 巧克力文心兰(Oncidium Sharry Baby 'Sweet Fragrance')又名香水文心兰,是文心兰的一个栽培品种,开花时具有浓郁的巧克力奶油香味,具有很高的研究价值。巧克力文心兰原球茎增殖培养时极易分化,不易稳定继代保持,成苗速度慢。文心兰切花高峰期又集中于高温高湿季节,极易遭受病害,严重阻碍了巧克力文心兰产业的发展,因此对巧克力文心兰离体培养条件进行优化和相关的抗病性研究是非常有必要的。本研究通过对巧克力文心兰进行培养基的优化,得到最适合巧克力文心兰组培快繁的培养基。同时利用文心兰转录组数据,克隆得到文心兰抗性相关基因EDS1、PAD4与PR1,并对PR1进行功能验证与瞬时转化研究,为文心兰抗性种质的培育提供了理论基础,主要结果如下:1巧克力文心兰原球茎增殖与分化培养的优化以巧克力文心兰原球茎为材料,通过正交试验研究6-BA、NAA、香蕉泥对巧克力文心兰原球茎增殖的影响。研究表明,巧克力文心兰原球茎增殖的最适培养基为:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/LNAA+20 g/L香蕉泥+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,各试验因素对其影响程度依次为:NAA>6-BA>香蕉泥。分化的最适培养基为:1/2MS+0.3mg/L NAA+0.5 mg/L KT+ 40 g/L苹果泥+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,各试验因素对其影响程度依次为:KT>苹果泥>NAA。试验数据表明激素和香蕉泥交替继代能够显著降低巧克力文心兰原球茎的褐化程度。2巧克力文心兰组培苗的壮苗生根培养以巧克力文心兰无根组培苗为材料,通过添加不同浓度的天然添加物(苹果泥、马铃薯泥、香蕉泥)研究巧克力文心兰组培苗壮苗生根的最适培养基。试验表明苹果泥对巧克力文心兰组培苗的苗高、生根数有促进作用,且有助于假鳞茎的生长。马铃薯泥对组培苗的苗高、生根数影响不大,但可以使组培苗保持颜色翠绿。香蕉泥在促进组培苗的苗高上作用显著。综上巧克力文心兰组培苗生根壮苗阶段的最适培养基为:1/2MS+0.5 mg/LNAA+100 g/L 苹果泥+30 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂。3巧克力文心兰组培苗的移栽驯化以巧克力文心兰生根后的组培苗为材料,通过不同的炼苗方式、移栽方式与移栽基质的选择,研究巧克力文心兰移栽成活率最高的移栽条件。试验表明,巧克力文心兰移栽驯化最优的方案为炼苗时先在室温下闭盖炼苗一周后再开盖炼苗,同时移栽前先在4草炭土:1珍珠岩比例的基质中成簇移栽进行定植培养90 d,然后再移栽到3树皮:1珍珠岩比例的基质中,成活率达100%。4文心兰EDS1、PAD4与PR1基因的克隆与生物信息学分析采用RT-PCR结合RACE法,以巧克力文心兰cDNA为模板,克隆文心兰抗病相关基因PAD4的全长序列,开放阅读框1 894 bp,预测可编码647个氨基酸,5'UTR为65bp,3'UTR为255bp。同时也获得抗病相关基因EDS1与PR1的ORF序列,分别为1 863 bp与474 bp,分别编码620与157个氨基酸。生物信息学显示EDS1与PAD4都属于水解酶家族,而PR1蛋白属于SRPBCC超家族,他们都不含信号肽,非分泌蛋白。5文心兰EDS1、PAD4与PR1基因的表达模式分析以健康文心兰为材料,以Actin基因为内参,利用qRT-PCR技术研究EDS1、PAD4与PR1在文心兰不同组织部位、病原菌侵染与抗病相关外源激素处理下的基因表达量。结果显示,EDS1、PAD4与PR1在文心兰不同组织部位中都有表达,其中PAD4表达量最高的部位为假鳞茎,而EDS1与PR1则在根中的表达量最高,说明他们的表达都具有组织特异性。病原菌与外源激素都可以诱导EDS1、PAD4与PR1的表达,且PR1在健康植株中的表达量微弱,但病原菌能显著提高PR1的表达量,SA与MeJA能一定程度上促进EDS1、PAD4与PR1的表达,推测EDS1、PAD4与PR1在文心兰抗病过程中能够发挥重要的作用。6文心兰PR1基因的初步功能研究PR1基因作为植物系统获得性抗性中的重要下游基因,在植物抗病过程中发挥着重要的作用。本研究构建文心兰PR1基因35S:PR1的植物过表达载体,采用农杆菌介导法将其转入文心兰原球茎中进行了瞬时表达。结果表明,过表达PR1后的文心兰原球茎中PR1基因的表达量显著高于对照,说明PR1基因已经转化至文心兰原球茎中,通过对文心兰PR1基因的初步转化为文心兰通过转基因技术获得抗病种质资源的培育奠定基础。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
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