一种与柑橘果皮红黄颜色性状相关的序列及其应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-12-16 22:26

本发明涉及柑橘育种领域，更特别地，涉及一种与柑橘果皮红黄颜色性状相关的序列及其应用。

背景技术：

柑橘是全球最重要的经济作物之一，是世界第一大类水果，是世界第三大贸易农产品。其果皮色泽是柑橘果皮外观的主要性状之一，也是衡量一个品种商品性高低的重要标志，就消费者的喜好而言，一般果皮红色是最受欢迎的柑橘外观色泽，但是目前很多栽培品种果皮都不是红色，某些具有红色果皮的品种又有其他的一些缺点，而不能大量的发展，因此果皮红色性状是柑橘育种过程中的一个重要目标。利用目标性状共分离的分子标记进行分子辅助育种具有高效，快速，且不受环境影响的优点，可以在苗期对目标性状进行提前鉴定，因此可以在一定程度上克服传统常规育种周期长，占地大，花费多等诸多限制，是目前比较重要的一个果树育种手段。

目前有关柑橘果皮红色性状的遗传机制研究仍属于起步阶段，陈力耕等在柑橘果皮色泽遗传规律的探究试验中发现，柑橘果皮的红色性状是一个显性性状，有可能通过两个基因所控制。但是尚未见该性状的具体的遗传位点、具体的分子遗传机制和筛选与柑橘果皮性状相关的snp分子标记的报道。

技术实现要素：

本发明通过柑橘果皮红色性状的遗传定位、解析红色性状形成的分子遗传机制、筛选与柑橘果皮红色性状精密连锁的snp标记，建立了苗期分子标记辅助筛选红色性状的方法。

基于此，本发明提供了一种与柑橘果皮红黄颜色性状相关的序列，其序列如seqidno:1所示，所述位于编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因上游。

本发明还提供了上述序列在柑橘育种中的应用。

本发明还提供了一种在育种过程中预测柑橘果皮颜色或其子代的果皮颜色的方法，包括检测编码类胡萝卜素裂解双加氧酶的基因的上游seqidno:1所示序列的存在与否和/或所述序列中的snp位点的多态性的步骤。

在一个实施方案中，所述snp位点为seqidno:1所示序列第8位的嘌呤。

当不存在seqidno:1所示序列，或者存在至少一份seqidno:1所示序列并且所述序列中第8位均为腺嘌呤时，预测所述柑橘植物体的果皮颜色为黄色；当存在至少一份第8位为鸟嘌呤的seqidno:1所示序列时，预测所述柑橘植物体的果皮颜色为红色。根据亲代基因组中的该序列的存在份数以及snp位点的多态性，可预测子代的柑橘果皮颜色。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

s1：从待测柑橘植物体中提取基因组；

s2：检测所述基因组中编码类胡萝卜素裂解双加氧酶基因上游是否存在seqidno:1所示序列，以及所述序列中第8位是腺嘌呤还是鸟嘌呤；

s3：通过s2的检测结果预测所述柑橘植物体的果皮颜色或其子代的果皮颜色。

在一个实施方案中，所述柑橘植物体为柑橘植株的根、茎、叶、花、果皮、种子，或者愈伤组织，或其他可提取柑橘完整基因组的部位、组织或衍生组织。

在一个实施方案中，在编码类胡萝卜素裂解双加氧酶基因上游0-1.8kb的范围。

可在杂交完成后，植株生长早期或愈伤组织培养时就能知晓未来果皮的颜色，由此，可在育种过程中及早剔除果皮颜色不合筛选条件的植株，或筛选出果皮颜色合乎筛选条件的植株，避免不必要的人工和资金成本的浪费。也可在杂交之前，先对亲代的基因组进行检测，挑选符合条件的亲本来杂交，以缩短选育时间。

本发明还提供了一种改变柑橘果皮颜色的育种方法，包括在柑橘细胞基因组中编码类胡萝卜素裂解双加氧酶基因上游插入、缺失seqidno:1所示序列或对seqidno:1所示序列的snp位点进行点突变并将所述柑橘细胞培育成植株的步骤。

在一个优选实施方案中，所述柑橘细胞为胚性细胞或愈伤组织细胞。

此外，对于其他性状的综合指数非常符合筛选条件，只是颜色不符合筛选条件的植株，可通过转基因的方式，在ciclev10028113m.g的上游插入或缺失或突变seqidno:1所示的鉴别序列，从而大大缩短育种时间。

因此，本发明对于柑橘外观色泽的遗传改良，提高育种效率，节约育种成本具有非常重要的指导意义。

附图说明

图1为红/黄果混池的bsa-seq结果统计图；

图2为caps标记精细定位示意图；

图3为杂交子代的红果和黄果中ciclev10028113m.g的相对表达量统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照生化试剂制造厂商的说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

红橘与枳壳的杂交群体(2004年定植)的dna和果皮样品从湖北省武汉市华中农业大学柑橘育种工程中心获得；100多份自然群体的dna和果皮样品从湖北省武汉市华中农业大学获得。

1.果皮红色性状相关的鉴别序列的鉴定

以红橘为母本、枳壳为父本杂交，通过胚抢救获得f1代群体(95株)，利用百迈克公司的slaf简化基因组测序，获得高密度的遗传图谱，通过色差测定和人眼观察将果皮类胡萝卜素的hplc检测，发现杂交子一代的果皮颜色性状出现了分离现象，其中部分果皮为红色，另一部分果皮为黄色。通过混池20株黄果和红果测10g数据量，对获得的数据进行bsa分析(图1)和交换单株遗传定位(图2)，筛选的到候选基因ciclev10028113m.g，该基因编码类胡萝卜素裂解双加氧酶。然后，对于红果和黄果的果皮基因表达谱进行比较结果如图3所示，ciclev10028113m.g在红果中高表达，而在黄果中几乎不表达。

进一步对植株基因组中的ciclev10028113m.g基因进行研究，发现红果和黄果基因组中ciclev10028113m.g的编码区并没差异，但是启动子区中有一段鉴别序列能够在该群体中与果皮颜色性状紧密连锁，该鉴别序列位于ciclev10028113m.g基因的起始密码子上游第1534bp处，5’-tacaactrtggcacc-3’(seqidno:1，r表示嘌呤)，该序列的第8位嘌呤具有snp多态性，当存在该序列并且第8位的嘌呤为鸟嘌呤时，宽皮柑橘或其杂柑品种表现为红色或橙红性状，当该序列的缺失或存在该序列并且第8位上的嘌呤为腺嘌呤时，宽皮柑橘或其杂柑品种表现为黄色或橙黄性状。

2.鉴别序列与红橘与枳壳的杂交子一代中性状相关性的鉴定

设计引物检测红橘与枳壳的杂交子一代中鉴别序列与果皮颜色性状的相关性。发明人设计了检测snp位点多态性的引物对来扩增包含以上鉴别序列的片段，其中，正向引物为5’-tgttcagttccacaatgc-3’(seqidno:2)，反向引物为5’-ggtagatatgtagagtgg-3’(seqidno:3)，还设计了sanger测序引物来检测该snp位点，引物序列为5’-gtggttgataattctttacagg-3’(seqidno:4)。

具体方法如下：

1)从植株的树叶中提取待测柑橘的基因组dna；

2)以上述基因组dna为模板，seqidno:2和3所示的序列扩增含有目的序列的片段，其中，pcr反应所用到的扩增体系为50μl：100ng/μl的dna模板1μl，10μm的引物f和r各1μl，pcr-suretm2xmastermix25μl，余量为ddh2o，此试剂盒购自于abm公司，cat.no为：g065-9；

pcr反应条件为：第一步：94℃变性4min；第二步：94℃30s，60℃30s，72℃2min，此步进行3个循环；第三步：94℃30s，55℃30s，72℃2min，此步进行3个循环；第四步：94℃30s，50℃30s，72℃2min，此步进行25个循环；第五步：72℃，8min进行总的延伸；

3)回收扩增产物，用seqidno:4对pcr扩增产物(如果只有一条带，则利用pcr产物回收试剂盒回收，并进行ta克隆，检测阳性克隆的序列；如果有两条带(排除杂带)，则切胶分开回收，再将pcr产物连接pclone007载体，进行ta克隆，测序)。

用上述方法检测了80株样品的snp位点，snp位点与性状相关性结果如表1所示。从表中可知，当植株的基因组中存在seqidno:1，并且该序列的第8位的嘌呤为鸟嘌呤g时，该植株的果皮表现为红色性状；当植株的基因组中存在seqidno:1，并且该序列的第8位的嘌呤为腺嘌呤a时，该植株的果皮表现为黄色性状。

表180株红橘与枳壳的杂交子一代样品的snp位点与果皮颜色的相关性

注：+/-代表该座位处存在两个等位基因，一个等位基因中含有seqidno:1序列，一个中不含有该序列。

3.其他柑橘品种中的鉴别序列检测及其与性状的相关性

对多种其他柑橘品种进行测序，检测该鉴别序列的存在与否以及其中的snp位点。结果如表2所示，在其他柑橘品种中仍然体现出跟上文中揭示的鉴别序列与性状之间的连锁关系，并且在检测过程中还存在杂合的snp位点的现象，在杂合体中，鸟嘌呤序列对腺嘌呤序列呈显性关系。即，当存在一份或两份该鉴别序列，并且第8位均为鸟嘌呤时，果皮成熟时呈现红色性状(或采后处理后果皮能够着红色，多数橙类需要采后处理，才能显现出其果皮红色性状)；当缺失该鉴别序列，或存在一份或两份该鉴别序列并且第8位均为腺嘌呤时，果皮呈现黄色性状；当存在两份该鉴别序列，其中一份的第8位为鸟嘌呤并且另一份的第8位为腺嘌呤时，果皮呈现红色性状。

表2

以上实验说明，seqidno:1所示的鉴别序列及其中的snp位点能够有效预测果皮的色泽。

4.鉴别序列在育种中的应用

通过上文的实验已经论证，通过检测植株其他部位的基因组中seqidno:1所示的鉴别序列及其snp位点的多态性，可有效地预测果皮颜色。利用这个特点，可在杂交完成后，植株生长早期或愈伤组织培养时就能知晓未来果皮的颜色，由此，可在育种过程中及早剔除果皮颜色不合筛选条件的植株，或筛选出果皮颜色合乎筛选条件的植株，避免不必要的人工和资金成本的浪费。

此外，对于其他性状的综合指数非常符合筛选条件，只是颜色不符合筛选条件的植株，可通过转基因的方式，在ciclev10028113m.g的上游插入或缺失或突变seqidno:1所示的鉴别序列，从而大大缩短育种时间。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种与柑橘果皮红黄颜色性状相关的序列及其应用

<130>1

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>15

<212>dna

<213>柑橘

<400>1

tacaactrtggcacc15

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgttcagttccacaatgc18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggtagatatgtagagtgg18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtggttgataattctttacagg22

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