一种矮牵牛花器官发育基因PhDof28及其应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-11-30 17:44

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种矮牵牛花器官发育基因phdof28及其应用。

背景技术：

dof基因家族蛋白是植物特有的一类转录调控因子，除了与本家族蛋白互作，还与其它家族蛋白成员互作，其在植物组织分化、种子发育、逆境胁迫、植物生理代谢等方面具有重要的调控作用。自1993年从玉米中鉴定报道了第一个zmdof1(mnb1a)转录因子以来，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了dof基因。其中拟南芥基因组中存在37个dof基因(yanagisawa，2002)，水稻基因组中存在30个(lijavetzkyetal，2003)，大麦中有26个(moreno-risuenoetal，2007b)，大豆中有28个(wangetal，2007)，南瓜(kisuetal，1998)、烟草(baumannetal，1999)、小麦(chenetal，2005)和马铃薯(pleschetal，2001)等植物中也都存在dof基因。dof蛋白一般由200～400个氨基酸组成，具有特异和高度保守的dna结合域，即位于n末端由52个氨基酸组成的dof域。dof蛋白以其dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用，在每一个dof蛋白的dna结合序列中均存在有aaag序列。aaag序列和其反向互补序列cttt是dof蛋白识别的核心序列。除了dof结构域外，dof蛋白包含的另一个主要的结构域是位于c末端的调控结构域。与保守的dof结构域不同，转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是dof功能多样性的基础之一。

矮牵牛(petuniahybrida)属茄科(solanaceae)碧冬茄属(petunia)，是世界上最重要的园艺观赏植物之一，因生长周期短，遗传背景清晰，生长周期短，可进行种子、扦插、嫁接等繁殖，一直以来作为研究花卉基因功能与花发育分子机制的模式植物。从矮牵牛中分离并克隆相关的基因dof基因并揭示其功能，有利于研究dof基因家族在植物生长发育中的分子调控机理，以进一步应用于植物的性状改良。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种矮牵牛花器官发育基因phdof28。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述矮牵牛花器官发育基因phdof28的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种矮牵牛花器官发育基因phdof28，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述的矮牵牛花器官发育基因phdof28的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有所述的矮牵牛花器官发育基因phdof28的载体、重组菌或细胞。

进一步地，所述的矮牵牛花器官发育基因phdof28的载体，为植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体为pcambia2300-phdof28。

所述的矮牵牛花器官发育基因phdof28，在改良植物花观赏性状中的应用。

进一步地，所述的应用，包括以下步骤：

1)构建矮牵牛花器官发育基因phdof28的载体；

2)将所构建的矮牵牛花器官发育基因phdof28的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到花冠直径变大、花朵变长或花色加深的转基因植株。

所述的应用中，所述的植物为矮牵牛或烟草。

所述的应用中，所述的矮牵牛花器官发育基因phdof28的载体为pcambia2300-phdof28。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

(1)本发明提供的矮牵牛花器官发育基因phdof28是一个新的花发育基因，该基因可调控植物花器官的发育，可改变植物花器官大小尤其是花瓣大小，从而可应用于转基因改良植物的观赏性状；

(2)本发明为探究dof转录因子在花瓣伸展过程中的调控关系，加深对花瓣大小调控网络的认知奠定了分子基础，提供了新的基因资源。

附图说明

图1为phdof28基因全长扩增图；

图2为pcambia2300-phdof28超表达载体阳性检测结果图；

图3为phdof28基因亚细胞定位图；

图4为转phdof28基因矮牵牛植株pcr阳性检测结果图；

图5为超量表达phdof28基因的转基因矮牵牛96号株系的表型图；注：a为花冠，b为花朵，c为花梗，d为花药；e为柱头，f为花萼；

图6为矮牵牛花瓣明显伸长部位图；

图7为转phdof28基因烟草植株pcr阳性检测结果图；

图8为烟草转phdof28基因阳性株系进行半定量分析结果图；

图9为转基因烟草不同花期phdof28基因real-timepcr表达分析结果图；

图10为超量表达phdof28的转基因烟草31株系的表型图；

图11为phdof28转基因烟草28株系和31株系扫描电镜分析图；注：花瓣图片展示扫描电镜取样部位；up指花瓣上半部分细胞形态；mid指花瓣中部分细胞形态；down指花瓣下半部分细胞形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：矮牵牛花器官发育基因phdof28的克隆

实验材料：矮牵牛(petuniahybrida)品种“幻想”由南京林业大学风景园林学院重点实验室提供，播种于南京林业大学风景园林学院生长室，自然条件下生长。

基因来源：基于前期课题组已有的矮牵牛花药转录组数据库(未发表)挑选而出并命名为phdof28。

矮牵牛总rna中扩增phdof28具体步骤为：

1)按照北京艾德莱公司rna提取试剂盒提取矮牵牛花组织样品总rna，然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提rna质量及浓度。

2)按照北京全式金反转录试剂盒将稀释十倍的矮牵牛总rna反转录为cdna，存于-20℃备用；

反转录体系：反转录体系(20μl)：1μlgdnaremover，1μlanchoredoligo(dt)18primer(0.5μg/pl)，1μlrt/rienzymemix，10μl2×txreactionmix，7μltotalrna。

反转录反应条件：42℃30min，85℃5s。

3)用primerpremier5设计扩增引物，如下：

上游引物phdof28-f：5′-gctaaggtgaagttttcataattgt-3′；

下游引物phdof28-r：5′aaaaaggagagatatagatcaaggtag-3′。

按照北京takara生物技术有限公司的primestar高保真酶进行目的基因全长扩增，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并进行产物回收，得到dna全长片段(图1)。

扩增全长基因反应体系(20μl)具体为：1μlcdna，1μlantisenseprimer(phdof28-f)(10mm)，1μlsenseprimer(phdof28-r)(10mm)，10μlprimestar高保真酶，7μl1ststrandcdna。反应条件：98℃10s；58℃25s，72℃1min，35个循环；72℃5min，16℃∞。

4)回收目的片段与peasy-blunt载体连接，转化大肠杆菌，检测阳性重组克隆后测序，最终获得具有完整编码区的矮牵牛phdof28的cdna核苷酸序列如seqidno.1所示，长度为966bp，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，长度为319aa。具体反应体系和反应条件如下：

pcr回收产物和peasy-blunt进行连接反应体系：

克隆体系(5μl)：4μlpcrproduct，1μlpeasy-blunt。反应条件：室温反应5min，25℃恒温克隆反应15min。

实施例2：植物表达载体pcambia2300-phdof28的构建

质粒的提取：

pcambia2300质粒、v097质粒、v197质粒和携带目的基因的t载体质粒的提取均采用北京天根生化科技有限公司高纯度质粒提取试剂盒。

提取含有目的片段的t载体和表达载体pcambia2300质粒dna并进行双酶切，将含有phdof28完整开放阅读框的片段和pcambia2300质粒片段分别回收。然后进行连接，将连接好的重组质粒pcambia2300-phdof28转化大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。

双酶切反应体系(50μl)：1μl质粒，1μlquickcut酶i，1μlquickcut酶ii，5μl10×quickcutbuffer，ddh2o补至50μl。

上述体系配好后，涡旋混匀，瞬时离心，放置于37℃恒温水浴锅反应1h，最后用1.5％琼脂凝胶检测双酶切情况，并进行切胶回收，最后用核酸测定仪检测回收产物浓度，并用1％琼脂凝胶检测回收是否正确(图2)。

主要步骤：

1)将载体质粒dna与插入目的基因dna按照摩尔数比为0.03pmol：0.03-0.3pmol混合制备成体积为5-10μl的dna溶液。

2)向上述的dna溶液中加入solutioni，涡旋混匀，瞬时离心，16℃恒温水浴锅反应1h。从所述溶液中取出1μl用于普通pcr模板，检测连接产物是否连接成功。

3)向连接成功的液体加1μlsolutioniii至剩余的溶液中，轻打混匀，然后吸取5μl加入50μl感受态细胞trans-t1中，涂板于含有kana抗性的培养基上，37℃倒置过夜培养。用无菌牙签于每个板子上挑取饱满单克隆，先在新的平板上备份，之后蘸至配成的20μl的pcr反应体系进行菌检，菌检结果较好的送测及保菌、提质粒。

4)pcr检测反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

实施例3：phdof28基因的亚细胞定位研究

根据实施例1得到的phdof28全长cdna序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在引物中引入sali和kpni酶切位点。引物设计如下：

f：5′-ctgcaggggcccggggtcgacatgcaagatatacatgcgattggt-3′；

r：5′-gcccttgctcaccatggtaccaggtagaaaattaagtgactgatcatttt-3′。

利用上述的引物进行rt-pcr从矮牵牛cdna中分离包含完整orf的phdof28。将其orf与pcambia1300中的gfp报告基因5′端融合成一个gfp：：pcambia1300-phdof28嵌合基因。酶切验证后，将其和空载体pcambia1300分别通过电转法转化农杆菌，再通过瞬时转化法转化本氏烟草，实验结果表明矮牵牛phdof28主要定位于细胞核(图3)。

具体步骤：

1)配菌液缓冲液：10mm·l-1mgcl2，10mm·l-1生物缓冲液mes，150μm·l-1乙酰丁香酮(不溶于水，用二甲基亚砜助溶)。

2)将成功转化农杆菌的gv3101、pcambia1300-phdof28融合表达载体、pcambia1300空载、p19辅助表达载体放在冰上融化。再分别取50μl加30mllb液体培养液(含有100mg·l-1卡那霉素)于28℃，200rpm摇床避光培养到od600在0.6-1.0之间。在4℃5000r·mjn-1离心机离心5min收集菌体，用缓冲液对菌体进行重悬，最后将重悬菌液按照比例(od600比值为7∶5)混合，于室温静置2-3h备用。

3)用1ml医用注射器将含混合菌液注入本氏烟草叶背面，培养箱中培养2-3d，激光共聚焦显微镜下观察pcambia1300-phdof28-gv3101在烟草下表皮细胞的表达情况，分别于gfp绿色荧光场(gfp)、叶绿体粉色荧光场(chloroplast)、白光场(brightfield)和前三者混合场(merged)下观察，同时以携带空载体pcambla1300的农杆菌gv3101在烟草下表皮细胞的表达情况为对照。如图3所示，结果表明矮牵牛phdof28主要定位于细胞核。

实施例4：phdof28植物表达载体转化矮牵牛表型观察

(1)表达载体电转法转化eha105感受态细胞

取1μl表达载体质粒(实施案例2所得产物)加入30-35μleha105感受态细胞，与清洗干净并晾干的电转杯一起冰浴30min，用电转仪进行电转，往电转杯加入400μl不含有抗生素的lb培养液进行活化，28℃摇床200rpm培养1h，菌液涂板于含有卡那抗性的固体培养基上，28℃培养箱暗培养2天，挑取单克隆进行检测，选取饱满的阳性菌落摇菌用于烟草和矮牵牛转化。

(2)矮牵牛的遗传转化

取上述菌液20μl加入30ml的新鲜lb培养液，200rpm28℃摇床过夜悬浮培养至od600值为0.5，5000rpm4℃离心10min收集菌株，加入30mllb培养液进行摇菌复苏。取矮牵牛和烟草两三片鲜嫩的叶片，用75％的酒精消毒10s，超纯水清洗3遍，再用0.1％氯化汞消毒杀菌30min，并在无菌的条件下用超纯水漂洗三次，最后将叶片切成5mm*5mm大小并浸泡在上述悬浮液中浸泡10min，然后在共培养基上培养3d，诱导生芽生根后进行移植。

(3)pcr鉴定及植物形态观察

1)dna检测

用北京天根生物公司的dna提取试剂盒提取叶片dna，将提取的dna稀释50倍以后跑pcr检测，pcr反应时反应体系为：上下游引物1μl，ddh2o7μl，绿酶10μl，稀释的dna模板1μl。pcr反应程序为94℃预变形3min，94℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸10min，35个循环，16℃终止反应。将pcr产物用1％琼脂凝胶电泳进行检测，紫外凝胶成像仪中观察结果，结果显示，phdof28成功转化了矮牵牛(图4)。

2)植物形态观察(图5，图6)

对pcr检测为阳性的矮牵牛植株进行表型观察，转基因植株从展开花芽开始观察花器官的变化。观察发现，转基因阳性植株的花器官，包括花萼、花瓣都比野生型大而长。主要增大伸长的部位为花瓣上部(花冠)、花瓣下部和花瓣中部(花托)，特别是花瓣，在开展期明显比野生型大的多。

实施例5：phdof28植物表达载体转化烟草表型观察

1、烟草无菌苗的培养

(1)准备工作：

灭菌：1000μl和200μl的枪头(1000μl的枪头部分预先剪去一小段头部，以免种子太大，吸不上来)，牙签，1.5ml离心管，ddh2o，200ml锥形瓶(装废液用)。

(2)准备样品与试剂：1000μl和200μl的枪和枪头，少量封口膜，ms培养基，8％次氯酸钠(避光保存)，75％酒精(避光保存)，牙签，1.5ml离心管，ddh2o，锥形瓶(装废液用)。

(3)具体操作步骤如下：

1)取适量的种子于1.5ml无菌离心管，加入1ml8％次氯酸钠，充分涡旋振荡5min，静置1min-3min，彻底消毒后用灭过菌的枪头吸出次氯酸钠(尽量避免吸出种子)，消毒一次。

2)加入1ml75％酒精，涡旋振荡30s，静置30s，立即吸出酒精，避免降低种子活性，消毒一次。

3)立即加1ml无菌的ddh2o，涡旋振荡1min，静置1min，清洗3-5遍。

4)将事先配好的ms培养基打开吹风，将清洗好的种子加少量的ddh2o后用剪去一小段头部的1000μl的枪头一并吸出打在ms培养基表面，为了避免种子生长过密，用灭好菌的牙签轻轻将其均匀铺开，用封口膜将培养基封口并做好标记。

5)密封好的培养基用锡箔纸封好，放在4℃冰箱春化两天，然后放在培养架上进行光照培养。

6)待长出两片真叶即可转移到灭好菌的营养土中进行栽培。

2、植物表达载体转化植株

(1)表达载体电转法转化eha105感受态细胞

取1μl表达载体质粒(实施案例2所得产物)加入30-35μleha105感受态细胞，与清洗干净并晾干的电转杯一起冰浴30min，用电转仪进行电转，往电转杯加入400μl不含有抗生素的lb培养液进行活化，28℃摇床200rpm培养1h，菌液涂板于含有卡那抗性的固体培养基上，28℃培养箱暗培养2天，挑取单克隆进行检测，选取饱满的阳性菌落摇菌。

(2)叶盘法转化烟草

取上述菌液20μl加入30ml的新鲜lb培养液，200rpm28℃摇床过夜悬浮培养至od600值为0.5，5000rpm4℃离心10min收集菌株，加入30mllb培养液进行摇菌复苏。取烟草两三片鲜嫩的叶片，用75％的酒精消毒10s，超纯水清洗3遍，再用0.1％氯化汞消毒杀菌30min，并在无菌的条件下用超纯水漂洗三次，最后将叶片切成5mm*5mm大小并浸泡在上述悬浮液中浸泡10min，然后在共培养基上培养3d，诱导生芽生根后进行移植，可以先在壮苗培养基和生根培养基上进行培养，使苗尽量长得健壮，根系尽量粗壮再进行移植。

各种培养基配方：

共培养培养基：ms+0.3mg/lnaa+2.0mg/l6-ba

壮苗培养基：ms+0.01mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+50mg/lkana+300mg/lcef

生根培养基：1/2ms+50mg/lkana+300mg/lcef

3、pcr鉴定及植物形态观察

(1)dna检测

用北京天根生物公司的dna提取试剂盒提取叶片dna，将提取的dna稀释50倍以后跑pcr检测，pcr反应时反应体系为：上下游引物1μl，ddh2o7μl，绿酶10μl，稀释的dna模板1μl。pcr反应程序为94℃预变形3min，94℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸10min，35个循环，16℃终止反应。将pcr产物用1％琼脂凝胶电泳进行检测，紫外凝胶成像仪中观察结果，结果显示，phdof28成功转化烟草(图7)。

检测引物如下：

35sf：5′-acgcacaatcccactatccttc-3′；

dof28-r：5′-aaaaaggagagatatagatcaaggtag-3′。

pcr阳性检测体系(20μl)如下：1μldna(稀释50倍模板)，1μl35sf，1μldof28-r，10μl绿酶，7μlddh2o。

pcr阳性检测反应条件如下：94℃3min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10mjn；16∞。

(2)半定量检测表达量

对dna检测为阳性的，有表型的转基因植株，提取总rna并进行反转录(具体参考实施案例1)，然后半定量检测模板质量和表达量。

设计引物序列如下：

phdof28基因的qrt-pcr引物为：

qphdof28-f：5′-gggaactttacaaatctgatgacg-3′；

qphdof28-r：5′-gaaacccgaactattaccaccc-3′。

烟草actin基因的引物为：

actin-r：5′-tggttgtgacttttggtccca-3′；

actin-f：5′-acaaacccacgcttgagatcc-3′。

半定量体系如下：

检测模板质量(20μl)：1μlcdna稀释10倍模板，1μlactin-f，1μlactin-r，10μl绿酶，7μlddh2o。

检测引物特异性和表达量：1μlcdna稀释10倍模板，1μlqphdof28-f，1μlqphdof28-r，10μl绿酶，7μlddh2o。

pcr反应程序为94℃预变形3min，94℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸10min，30个循环，16℃终止反应。将pcr产物用1％琼脂凝胶电泳进行检测，紫外凝胶成像仪中观察结果。结果表明，cdna模板质量良好，引物特异性较好(图8)。

(3)real-timepcr检测不同花期phdof28表达量

以烟草花瓣的大蕾期、半开放期、盛花期三个时期的cdna为模板，设计qrt-pcr的特异性引物，以烟草的actin基因作为内参进行qrt-pcr，其中引物序列见步骤(2)。

反应体系如下(10μl)：1μlcdna(稀释10倍模板)，0.4μlactin-f/qphdof28-f，0.4μlactin-r/qphdof28-r，5μlsybrgreenmastermix，0.2μl校正液dye，3μlddh2o。

反应程序为：预变性95℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，读板79℃1s，共40cycles，反应完成后从57℃到95℃进行溶解曲线分析，试验结果每份样品做3次重复。每个pcr反应的扩增效率视为100％。phdof28基因在花瓣各时期都有表达，但表达水平不同，在大蕾期和盛花期相对较高，在开放期表达最高(图9)。

(4)植物形态观察(图10)

对pcr检测为阳性的烟草植株和野生型植株进行表型观察，转基因植株从展开花芽开始观察花器官的变化。观察发现，转基因阳性植株的花器官，包括花萼、花冠筒、花瓣等都比野生型大而长。在花瓣即将开展时期，主要伸长的部位为花冠筒下半部分(down)、上半部分(mid)和花瓣部分(up)；此外花冠筒下半部分伸长最为明显，而且有变窄的趋势，变得细长；花冠筒上半部分和花瓣部分除了伸长之外，整体表面积也变大，特别是花瓣，在开展期明显比野生型大的多，颜色更深。为了进一步验证表型观察的结果，对这三个部位的表皮细胞进行了扫描电镜观察，进一步验证我们的结果(图11)。扫描电镜结果显示，转基因阳性植株花冠筒下半部分细胞形态变得细长，单个细胞长度变长，宽度变窄，细胞排列更加的紧密有序。而花冠筒上半部分的细胞相对于野生型植株，单个细胞体积明显变大。花瓣部分的细胞则表现出细胞数量不变，但细胞空隙变大，细胞排列更加松散。以上结构都表明phdof28与矮牵牛花器官的大小发育调控相关，可通过调控细胞体积大小和细胞排列的方式调控花器官的形态建成。下表1展示了烟草phdof28转基因阳性植株的瓣茎大小和花朵长度统计结果，验证了上述观察。

表1：phdof28转基因阳性植株的瓣茎大小和花朵长度统计表

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种矮牵牛花器官发育基因phdof28及其应用

<130>100

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>966

<212>dna

<213>petuniahybrida

<400>1

gctaaggtgaagttttcataattgtattgagatatgcaagatatacatgcgattggtggt60

ggaggtgcgcgatttttcggaggtggtggtggaggagatagaaggctaaggcctaacaat120

caacataatcttcaagcactaaagtgtccgcgttgcgactctatcaatacaaaattttgt180

tactacaacaactacaatctctctcaaccacgtcacttctgcaaaagttgcagaaggtac240

tggactaaggggggcgttcttcggaacgtccccgttggtggtggatgccgaaaaagcaaa300

cgttccaaacccaaatcaaaccccacaactacaactgatgttgtagttgatggttcagaa360

gaacctaaatcgaactctcactcgagtagtgagagttcgagtctcaccgctaccacaact420

gctgcagcagcgaatactggaacaacttccagttctgctgctgctgcagcagaagttgtg480

tcagcaaattcttccaatgtctcttcagcaatgtttctcaacttttcagaatccaacttc540

tttgtacctaacagtacgaacagtggctttgatcatcatcatcatcatcaacccgcgtta600

attgatcatactacagaaggtcagatgttccaagatattgggaactttacaaatctgatg660

acgccatcgaacgacccagggtcgtttaatatggtggaaattccggcctggaatcatcaa720

cattcgaagatggatatggaaactgatcacgtgaagatggaacagatgggtggtaatagt780

tcgggtttcatgagtcaaacgagtcgtgttggacataacagtgaagttggtgcactggat840

tggcaaattggacatgggttgtatgatttaacagggaccgttgatcaatcttactggagt900

caaacacagtggggtgaaaatgatcagtcacttaattttctaccttgatctatatctctc960

cttttt966

<210>2

<211>319

<212>prt

<213>petuniahybrida

<400>2

alalysvallyspheserleutyraspmetglnaspilehisalaile

151015

glyglyglyglyalaargphepheglyglyglyglyglyglyasparg

202530

argleuargproasnasnglnhisasnleuglnalaleulyscyspro

354045

argcysaspserileasnthrlysphecystyrtyrasnasntyrasn

505560

leuserglnproarghisphecyslyssercysargargtyrtrpthr

65707580

lysglyglyvalleuargasnvalprovalglyglyglycysarglys

859095

serlysargserlysprolysserasnprothrthrthrthraspval

100105110

valvalaspglyserglugluprolysserasnserhisserserser

115120125

gluserserserleuthralathrthrthralaalaalaalaasnthr

130135140

glythrthrserserseralaalaalaalaalagluvalvalserala

145150155160

asnserserasnvalserseralametpheleuasnphesergluser

165170175

asnphephevalproasnserthrasnserglypheasphishishis

180185190

hishisglnproalaleuileasphisthrthrgluglyglnmetphe

195200205

glnaspileglyasnphethrasnleumetthrproserasnasppro

210215220

glyserpheasnmetvalgluileproalatrpasnhisglnhisser

225230235240

lysmetaspmetgluthrasphisvallysmetgluglnmetglygly

245250255

asnserserglyphemetserglnthrserargvalglyhisasnser

260265270

gluvalglyalaleuasptrpglnileglyhisglyleutyraspleu

275280285

thrglythrvalaspglnsertyrtrpserglnthrglntrpglyglu

290295300

asnaspglnserleuasnpheleuproserileserleuleuphe

305310315

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>phdof28-f引物序列(artificial)

<400>3

gctaaggtgaagttttcataattgt25

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>phdof28-r引物序列(artificial)

<400>4

aaaaaggagagatatagatcaaggtag27

<210>5

<211>45

<212>dna

<213>phdof28f引物序列(artificial)

<400>5

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