德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因的筛选及应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-11-22 21:41

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及德国鸢尾花发育不同时期荧光定量pcr内参基因的筛选及其应用。

背景技术：

德国鸢尾（irisgermanical.）属鸢尾科鸢尾属多年生草本植物，为“有髯鸢尾”的泛称。其花形奇特、花色丰富、叶片常绿、株型紧凑，观赏价值极高。因此，德国鸢尾在盆栽观花、园林绿化等领域具有良好的应用前景。德国鸢尾单朵花花期仅3-5天，一般在春季4-5月开花，仅极少数品种可在夏秋季7-10月开放。花期短且集中，严重制约了其周年生产供应。因此，开展德国鸢尾促成开花及开花调控的分子机制研究，是培育德国鸢尾不同花期种质创新与新品种遗传改良的关键。筛选合适的内参基因，利用实时荧光定量pcr技术分析德国鸢尾花发育不同时期相关基因的表达水平，有助于阐明德国鸢尾开花的分子机理。然而，目前关于德国鸢尾花发育不同时期内参基因的鉴定工作还尚未见报道。

实时荧光定量pcr具有特异性强、灵敏度高、特异性强且重复性高的优点，目前已广泛应用于微生物学、农学及医学等众多研究领域。但该技术的检测结果常受到样本的影响，因此内参基因常被用来校准样本间的误差，以保证定量结果的精确性。理想的内参基因应该不受发育时期、组织器官及试验处理条件的影响。然而，研究表明，没有哪个内参基因能够适用于所有的反应体系，因此，根据不同的物种、样品类型及不同的试验体系，筛选合适的内参基因是精确分析rt-qpcr的前提。

本发明基于德国鸢尾rna-seq测序结果，选取8个候选内参基因，并通过genorm、normfinder、bestkeeper和refinder四种软件从不同统计学角度分析验证候选基因在花发育整个阶段的表达稳定性。本发明成功挖掘出德国鸢尾花发育过程中稳定的内参基因，为今后大规模开展德国鸢尾花发育关键基因特性及功能研究奠定坚实的基础。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供适用于德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因，该基因能够满足荧光定量实时pcr技术检测德国鸢尾中基因表达水平的要求，提高德国鸢尾基因表达的稳定性和精确性，为挖掘德国鸢尾花发育过程中的关键基因奠定基础。

本发明采用的技术方案如下：

1.德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因，包含以下（1）~（3）中的至少一种：

（1）德国鸢尾品种‘00246’花发育不同时期荧光定量内参基因为iggapdh，该内参基因iggapdh的核苷酸序列如seqidno.1所示；

（2）德国鸢尾品种‘2010200’花发育不同时期荧光定量内参基因为igtub，该内参基因igtub的核苷酸序列如seqidno.2所示；

（3）德国鸢尾品种‘elizabeth’花发育不同时期荧光定量内参基因为igubc，该内参基因igubc的核苷酸序列如seqidno.3所示。

2.上述德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因的特异性引物，其在于：

（1）所述iggapdh基因的特异性引物如seqidno.4和seqidno.5所示；

（2）所述igtub基因的特异性引物如seqidno.6和seqidno.7所示；

（3）所述igubc基因的特异性引物如seqidno.8和seqidno.9所示。

3.上述的内参基因或上述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。

4.一种德国鸢尾花发育不同时期荧光定量试剂盒，其包含上述特异性引物中的至少一种。

5.上述的德国鸢尾花发育不同时期荧光定量试剂盒中还包含rt-pcr技术常用试剂。

6.基因iggapdh、igtub和igubc中的至少一种作为德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因的应用，基因iggapdh的核苷酸序列如seqidno.1所示；基因igtub的核苷酸序列如seqidno.2所示；基因igubc的核苷酸序列如seqidno.3所示。

7.上述的应用，其在于：

（1）所述的基因iggapdh作为德国鸢尾品种‘00246’花发育不同时期荧光定量内参基因；

（2）所述的基因igtub作为德国鸢尾品种‘2010200’花发育不同时期荧光定量内参基因；

（3）所述的基因igubc作为德国鸢尾品种‘elizabeth’花发育不同时期荧光定量内参基因。

8.上述的应用，其在于：

（1）所述iggapdh基因的特异性引物如seqidno.4和seqidno.5所示；

（2）所述igtub基因的特异性引物如seqidno.6和seqidno.7所示；

（3）所述igubc基因的特异性引物如seqidno.8和seqidno.9所示。

9.上述的内参基因iggapdh、igtub和igubc或上述的试剂盒在相对定量法实时荧光定量pcr中的应用。

10.上述的内参基因iggapdh、igtub和igubc或上述的试剂盒在相对定量法实时荧光定量pcr中的应用，其在于：德国鸢尾品种‘00246’、‘2010200’和‘elizabeth’花发育不同时期功能基因表达定量试验中采用所述的内参基因定量，所述基因在相对定量法实时荧光定量pcr中作为内参基因使用。

11.本发明所述德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因的筛选过程为：

（1）结合德国鸢尾品种‘00246’、‘2010200’和‘elizabeth’从花发育蕾期到衰败期动态过程转录组测序结果分析，筛选到在德国鸢尾花发育过程中表达水平相对稳定的基因作为候选内参基因；

（2）在每个德国鸢尾品种中，选取更多花发育阶段的花瓣，利用反转录技术将高质量的rna转录成cdna，再通过荧光定量pcr检测候选内参基因的表达定量。

（3）根据每个品种花发育不同时期的表达水平，通过genorm、normfinder和bestkeeper软件进行各内参基因的稳定性分析，最后运用refinder软件计算出内参基因稳定性综合排名。

有益效果

本发明经过严格的内参基因筛选程序，首次从8个候选基因中筛选出三个不同花期的德国鸢尾品种‘00246’（早花品种）、‘2010200’（中花品种）和‘elizabeth’（晚花品种）花发育不同时期最为稳定的内参基因。

本发明筛选出的内参基因适用于花发育过程中功能基因的表达分析。其应用较为广泛，操作简单，成本较低，灵敏度高，稳定性及精确度极高。

附图说明

图1为候选内参基因的引物特异性琼脂糖凝胶电泳图。

图2为候选内参基因的实时定量pcr得到的cq值图。

图3为genorm软件对8个候选内参基因表达稳定值（m）的排序图；图a为‘00246’、图b为‘2010200’、图c为‘elizabeth’。

图4为normfinder软件对8个候选内参基因的表达稳定度排序图；图a为‘00246’、图b为‘2010200’、图c为‘elizabeth’。

具体实施方式

本发明结合以下实例进一步说明，但不用于限制本发明的范围。

本发明研究德国鸢尾不同花期三个品种‘00246’（早花品种）、‘2010200’（中花品种）和‘elizabeth’（晚花品种）花发育内参基因。下面主要以‘00246’为例，结合附图和实施例详细阐述：

1.候选内参基因的获得：基于已有的德国鸢尾rna-seq测序结果，选取表达量较高，并且表达水平较为稳定的8个候选内参基因。

2.引物设计：根据候选内参基因的cds序列及rt-qpcr设计原则，利用primerpremier5.0软件设计8对特异性实时荧光定量pcr检测引物（表1），并对其进行目的片段的pcr扩增检测（图1）。

表1本发明中8个候选基因的基因名、引物序列、扩增长度、扩增效率和回归系数

3.实时荧光定量pcr模板的准备：选取3个品种不同开花时期（蕾期、初花期、盛花期和衰败期）的花瓣，用去离子水洗净后迅速放入液氮中速冻，以备rna提取。采用rna提取试剂盒（北京天根生化科技公司）提取样品总rna，以1μgrna为模板，采用cdna反转录试剂盒（maximareversetranscriptase，ep0743，thermoscientific）反转录cdna的第一链，作为荧光定量pcr的模板。

4.实时荧光定量pcr反应：使用sybrgreenmaster（roche）试剂盒，按照试剂盒说明书进行具体操作。pcr反应条件为：95℃预变10min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。每个样品均设3个重复。实时荧光定量pcr获得的所有内参基因的cq平均值见图2。

5.genorm软件分析：本发明中，通过genorm软件首先计算每个候选内参基因的表达稳定度m值，判定标准为m值越小，表明内参基因稳定性越高，反之稳定性越低；其中m＝1.5是上限。从而获得8个候选内参基因表达稳定性的排序，其中最稳定两个内参基因为igubc和iggapdh（图3）。

6.normfinder软件分析：normfinder软件是基于方差分析对8个候选内参基因的稳定性进行排序，并引入不同样品组间表达差异。与genorm类似，稳定值m越小，候选内参基因的表达就越稳定。结果表明，8个候选内参基因按照m值由高到低排列依次为：igubq＞igpgk＞igef1ɑ＞igef1β＞igact6＞igtub＞igubc＞iggapdh（图4），表明iggapdh最稳定，其次为igubc和igtub。

7.bestkeeper软件分析：bestkeeper软件是基于cq值获得每个获选基因在所有样品中的基因间相关系数（r）、标准偏差（sd）和变异系数（cv），来评判其稳定性。sd值越小，内参基因稳定性越好，反之稳定性越差。sd＜1时表明该基因表达稳定，可以作为内参基因使用。结果显示，8个候选基因稳定性排序为：igubq＞igpgk＞igef1ɑ＞igact6＞igef1β＞igtub＞igubc＞iggapdh（表2）。

表2bestkeeper软件分析8个候选基因表达稳定性

8.refinder软件分析：refinder软件是对以上三种软件分析得到的稳定性排名求几何平均值，得到综合排名指数，指数越小，说明稳定性越高。由表3可见，德国鸢尾品种‘00246’花发育过程中最稳定的内参基因为iggapdh，其次为igubc和igtub。

表38个候选基因稳定性的综合排名

序列表

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>德国鸢尾花发育不同时期荧光定量内参基因的筛选及应用

<141>2021-01-12

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1828

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<213>德国鸢尾(irisgermanica)

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