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一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18及其应用

花匠小妙招
2024-11-08 23:28

一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因pearf18及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因pearf18及其应用。

背景技术：

2.随着人们生活水平的提高，花卉植物越来越受到人们的喜爱，人们对于不同形状的花卉有了更高的要求。为了提供更具有观赏价值和收藏价值的奇特花卉和名贵花卉，人们越来越注重研究花卉的发育机制。目前兰科植物有超过20000多种，是植物界包含种类最多的科之一。兰花花型包括外轮的三片花萼，内轮的两片花瓣以及由花瓣特化成各种形式的唇瓣，此外兰花具有雄蕊和雌蕊融合而成的合蕊柱，这种高度分化的花结构为研究兰花器官提供了良好的条件，研究观赏花卉发育机制对兰花发育模型的挖掘具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

3.本发明提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因pearf18，用于提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因，使其具有独特的观赏和应用价值。
4.本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因pearf18，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：
5.1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
6.2)seq id no.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；
7.3)与seq id no.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
8.本发明第二方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的蛋白，所述蛋白由本发明第一方面提供的基因编码得到。
9.本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体包含本发明第一方面提供的核苷酸序列。
10.进一步地，所述重组载体为cymmv病毒。
11.本发明第四方面提供一种重组转化体，所述重组转化体包含本发明第三方面提供的重组载体。
12.进一步地，所述重组转化体为农杆菌。
13.本发明第五方面提供本发明第一方面提供的基因在调控蝴蝶兰花器官发育中的应用。
14.本发明第六方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的方法，对所述蝴蝶兰沉默如本发明第一方面提供的核苷酸序列。
15.进一步地，将所述核苷酸序列连接到cymmv病毒质粒上面得到重组载体，然后将所述重组载体转入农杆菌，得到重组转化体，使用所述重组转化体侵染蝴蝶兰。
16.进一步地，将所述重组转化体在含有100μm的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中培养；
17.培养结束后在含有100μm乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中继代培养，直到od600达到0.8-1.0；离心去除上清液，使细胞沉淀重悬得到转化液，将所述转化液注射到无病毒的蝴蝶兰叶片与花序中。
18.本发明通过基因工程的手段有效调控了蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣蝴蝶兰的假唇瓣变成真唇瓣，从而利于昆虫对植物的传粉，同时也为蝴蝶兰的花型育种提供了重要的基础。
附图说明
19.图1为现有技术提供的野生型三唇瓣小兰屿蝴蝶兰的表型；
20.图2为本发明实施例提供的pearf18的保守结构域预测图；
21.图3为本发明实施例提供的pearf18系统进化发育分析图；
22.图4为本发明实施例提供的pearf18转录自激活功能的验证；
23.图5为本发明实施例提供的pearf18在本氏烟草中的亚细胞定位；
24.图6为本发明实施例提供的pearf18在小兰屿花芽不同发育时期的表达量；
25.图7为本发明实施例提供的pearf18在小兰屿蝴蝶兰不同组织中的表达量；
26.图8为本发明实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射cymmv-pearf18，30天后的对照和沉默突变株系表型；
27.图9为本发明实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射cymmv-pearf18，30天后的对照和沉默突变株系不同部位中pearf18的表达量。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂、载体，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的。
30.实施例1pearf18基因的克隆
31.提取如图1所示的野生型三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花瓣总rna，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna。根据转录组测序结果设计引物，引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示，采用rt-pcr方法从小兰屿蝴蝶兰cdna中扩增出一条2514bp的条带。pcr产物回收，获取核苷酸序列如seq id no.1所示的基因，命名为pearf18；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.2所示，由837个氨基酸残基组成，分子量为82.76kda千道尔顿。
32.实施例2pearf18的生物信息学分析
33.1、将pearf18编码的氨基酸序列放入ncbi数据库，检索同源蛋白。
34.2、运用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在线分析pearf18编码蛋白与同源氨基酸序列之间的保守结构域，分析结果如图2所示，pearf18具有典型的n末端的dna结合结构区域(dbd)，中间区域(mr)，c末端的二聚化结构区(ctd)。
35.3、选取拟南芥中arf基因家族氨基酸序列，运用mega5，分析pearf18系统发育关系，分析结果如图3所示，pearf18与拟南芥中的arf2聚类在一起，并且亲缘关系较近。
36.实施例3pearf18转录自激活功能的验证
37.1、将pearf18基因的开放阅读框2514bp可操作地连接于pgbkt7酵母表达载体，形成含有该基因片段的pgbkt7-pearf18载体；
38.2、将步骤1中的pgbkt7-pearf18载体、阴性对照组pgbkt7空载以及阳性对照组postive载体分别转入酵母菌感受态y2h；
39.3、将步骤2中的三种酵母菌株在trp选择缺陷型固体培养基上培养；
40.4、将步骤3中长出的三种酵母菌株在新的trp选择缺陷型固体培养基划线活化，随后在trp选择缺陷型液体培养基中进行摇菌；
41.5、将步骤4培养的酵母菌液分别在两种trp选择缺陷型固体培养基和trp/his/ade选择缺陷型固体培养基上分别培养，观察其生长状态。
42.如图4所示，阴性对照组pgbkt7空载在trp-his-ade选择缺陷型固体培养基未长，阳性对照postive载体有生长，带有pearf18基因的pgbkt7-pearf18载体未有生长，说明pearf18是非转录激活因子。
43.实施例4pearf18在本氏烟草中的亚细胞定位
44.1、将pearf18基因的开放阅读框2514bp可操作地连接于peg104-gfp表达载体，形成含有该基因片段的peg104-pearf18载体；
45.2、将该载体转入农杆菌gv3101；
46.3、取步骤2中农杆菌gv3101，在5ml含有100μm的乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素以及10μg/ml利福平的lb培养基中，在28℃、200rpm条件下培养过夜；
47.4、将取步骤3中农杆菌菌液在4℃、3700rpm下离心10分钟，弃上清并用0.5m的mgcl2反复吹打重悬三次，得到农杆重悬菌菌液；
48.5、测量农杆重悬菌菌液od值，并用0.5m的mgcl2稀释使其od值在0.6左右；
49.6、在步骤5得到的菌液中，加入总体积1.5倍的100μm as(乙酰丁香酮)、总体积20倍的mes(吗啉乙磺酸)，使细胞沉淀重悬，在室温下静置3-4h；
50.7、使用1ml带有针头的注射器吸取步骤6的农杆菌转化液，注射至生长四周龄的本氏烟草叶片中，培养2-3天并观察peg104-pearf18在细胞水平的位置。
51.观察如图5所示，在本氏烟草叶片细胞的显微结构中能清楚观察到荧光，根据荧光的位置来表明pearf18基因定位在细胞核结构。
52.实施例5不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的表达谱验证
53.1、提取图6中a所示，不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰的rna，分别命名为b1-b5，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
54.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
55.3、以不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cdna为模板，对pearf18进行不
同发育时期的表达谱验证。
56.验证结果如图6中b所示，pearf18的表达在不同发育时期受到了显著诱导，说明pearf18可能参与了小兰屿蝴蝶兰的花器官发育形成。
57.实施例6pearf18在不同组织小兰屿蝴蝶兰表达谱验证
58.提取如图7中a所示，不同组织部位的小兰屿蝴蝶兰的rna，提取部位分别为根、茎、叶、萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、花枝，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
59.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
60.3、以不同组织部位的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cdna为模板，对pearf18进行不同组织部位的表达谱验证，验证结果如图7中b所示，在不同组织中，pearf18的表达量不同，其中，在花瓣、唇瓣中表达量较低，说明pearf18可能参与小兰屿蝴蝶兰花器官发育的形成。
61.实施例7cymmv病毒诱导小兰屿蝴蝶兰pearf18基因沉默
62.1、将pearf18基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于cymmv病毒载体，形成含有该基因片段的cymmv-pearf18载体；
63.2、将该载体转入农杆菌gv3101；
64.3、取步骤2中农杆菌gv3101，在5ml含有100μm的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，在28℃、200rpm培养16h；
65.4、将取步骤3中农杆菌在含有100μm乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的50ml lb培养基中继代培养，并在28℃、200rpm下孵育13-16h，直到od600达到0.8-1.0；
66.5、取步骤4中农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃、3000rpm下离心10分钟；
67.6、离心后，除去上清液，加入300μl含100μm乙酰丁香酮的ms培养基，使细胞沉淀重悬，在室温下静置0.5h；
68.7、使用带有针头的1ml注射器吸取步骤6的农杆菌转化液，注射到无病毒的小兰屿蝴蝶兰叶片与花序中，培养30-40天观察小兰屿蝴蝶兰花瓣。
69.如图8所示，与对照组mock相比，小兰屿蝴蝶兰沉默突变株系的花器官的假唇瓣变成真唇瓣(如图箭头所指位置)。
70.实施例8cymmv病毒诱导小兰屿蝴蝶兰突变株系中，pearf18基因在萼片、唇瓣、合蕊柱中的表达验证
71.1、选取如图8所示的对照和沉默突变株系的花瓣、萼片、唇瓣、合蕊柱，提取其总rna，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
72.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示。
73.3、对照和沉默突变株系花瓣的反转录得到cdna为模板，对pearf18基因在花瓣、萼片、唇瓣、合蕊柱中进行基因沉默效率验证。
74.验证结果如图9所示，在小兰屿蝴蝶兰突变株系中，pearf18在花瓣、萼片、唇瓣、合蕊柱中的表达均显著降低，证明pearf18沉默效率较高，也进一步说明了pearf18参与小兰屿蝴蝶兰花器官发育的形成。
75.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。