中国蒿属花粉过敏原分子生物学分析和组分诊断
中国蒿属花粉过敏原分子生物学分析和组分诊断
【摘要】： 蒿属(Artemisia spp.)植物花粉是我国北方地区最重要的花粉过敏来源之一,拥有广泛的交叉过敏性。过敏反应是某些外来物质刺激引起,由IgE抗体介导的适应性免疫应答,而蒿花粉-食物综合症是引起严重过敏性休克最常见的诱因。近年来,随着分子生物学技术的不断发展和精准医疗时代的来临,过敏原组分诊断已成为过敏性疾病诊断和治疗中的重要方法。目前,已知的欧洲北艾(Artemisia vulgaris)花粉过敏原组分共有七种,分别被命名为Artvl-Artv6以及未知分子特性的Art v 60 kDa,这些信息是研究我国蒿花粉过敏原的重要参考。我国目前对于蒿属花粉过敏原的分子生物学研究以及关于过敏组分诊断的研究极少,大大阻碍了精准的诊断和治疗的发展。本文通过转录组、蛋白组和质谱测序相结合,鉴定推导黄花蒿花粉中62 kDa半乳糖氧化酶为新的过敏原,将其命名为Art an 7,并测定其理化性质和免疫活性。对六种蒿属花粉进行转录组和表达谱测序,分析了七类蒿过敏原基因序列差异,发现Art v 3在不同蒿种间序列差异最大。构建双夹心ELISA法定量过敏原Artvl、Artv2和Artv3,测定黄花蒿(A.annua)、艾蒿(A.argyi)、茵陈蒿(A.capillaris)、细裂叶莲蒿(A.gmelii)、野艾蒿(A.lavandulifolia)、大籽蒿(A.sieversiana)和北艾(A.vulgaris)七种蒿花粉提取物中的过敏原含量,并比较了不同蒿花粉提取物的IgE抗体结合活性,推测在过敏诊断和免疫治疗中,采用黄花蒿、艾蒿和大籽蒿花粉蛋白提取物混合试剂比单一蒿试剂更为全面有效。此外,还分析了中国蒿过敏患者slgE抗体对四种蒿过敏原组分(Artvl,Artar2,Artv3,Artan7)的识别模式与地域差异以及与过敏症状间的关系。主要研究结果如下:1、黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、野艾蒿、大籽蒿和北艾七种蒿花粉提取物与蒿过敏患者血清的免疫印迹均观察到三个主要过敏原蛋白条带,分子量分别位于12、25-35和60-70 kDa位置,中国蒿过敏患者的主要过敏原是Art v 1和Art v 3。在79位蒿过敏患者血清与六种蒿花粉提取物的ELISA结合实验中,IgE抗体结合程度以黄花蒿最高,野艾蒿最低,除大籽蒿外其余蒿均能完全抑制主要过敏原Artv1和Artv3与IgE抗体结合,大籽蒿只能部分抑制Artv3与IgE抗体结合,但大籽蒿在Art vl和Art v 3皆为阴性的血清中抑制效果较好。2、黄花蒿花粉转录组测序得到5.8 Gb数据和69,007个Unigene,蛋白组测序得到317,291个多肽蛋白质谱,鉴定出2035个蛋白。从黄花蒿花粉提取物中成功纯化出一个60-70kDa过敏原蛋白,推断为半乳糖氧化酶,并提交至国际过敏原命名委员会(IUIS)将其命名为新过敏原Art an 7.0101,94%的蒿过敏患者特异性IgE抗体(slgE)识别这一过敏原。该蛋白是一个酸性糖蛋白,分子量为61954Da,其基因ORF序列全长为1785bp,与同为菊科植物的向日葵假定半乳糖氧化酶基因序列相似度最高(74%),在412-414aa位置还发现一个天冬酰胺N联聚糖结合位点NTL。克隆了Art an l.01和Artan3.02的基因序列,并进行原核表达得到重组过敏原,蒿过敏病人的sIgE抗体与两种重组过敏原的结合程度都很高,可进一步开发作为过敏诊断试剂。3、对艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、碱蒿和大籽蒿花粉进行转录组测序,各得到7.3-7.7Gb转录组数据,艾蒿、碱蒿和茵陈蒿的Unigene中序列相似度高的序列较多,而细裂叶莲蒿和大籽蒿中较少,六种蒿表达谱测序结果显示艾蒿和北艾的基因表达量相关性最高(>0.97)。比对分析七类蒿过敏原的基因序列(Artv 1-Art v7以及同源过敏原蛋白),发现其中Art v3同源蛋白在不同蒿中序列变化最大(氨基酸序列相似度为85%-100%),七种蒿Art v1、Art v2、Art v3和Art an 7的过敏原基因序列已提交至NCBI数据库。依七类蒿过敏原的基因序列可将七种蒿聚为两大类:一类是黄花蒿、茵陈蒿和大籽蒿;另一类是北艾、艾蒿、野艾蒿和细裂叶莲蒿。对黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、大籽蒿和北艾花粉进行基因表达谱分析发现,Art v1.01、Arfv 4.02、Artv 4.01和Artv5.01分别在黄花蒿、艾嵩、细裂叶莲蒿和大籽蒿中表达量最高,Art2.01、Art v6.01和Art v7.01则在北艾中表达量最高,Art v3由于基因序列变化程度较高,表达量测定的精度随之降低,大致可看出在黄花蒿中表达量最高。4、用黄花蒿和艾蒿花粉提取物分别免疫小鼠和兔制备出单抗和多抗,成功通过Art v1和Art v2的单抗纯化得到天然蒿过敏原,可进一步开发并应用于过敏诊断和治疗。构建了检测Art vl、Art v2和Art v 3三种过敏原含量的单抗-多抗双夹心ELISA法,并依此测定七种蒿花粉提取物中的过敏原含量。Art v 1和Art v 2同源蛋白含量在各蒿提取物之间相差不大,分别以黄花蒿(7.1%)和野艾蒿(3.3%)中含量最高;Art v 3同源蛋白含量差异较大,最高的为艾蒿(13.9%),最低的是大籽蒿(0.07%);三种过敏原总含量在各蒿中依次为:艾蒿(22.3%)、北艾(12.6%)、野艾蒿(12.0%)、黄花蒿(11.2%)、茵陈蒿(8.5%)、细裂叶莲蒿(8.1%)和大籽蒿(7.3%)。5、应用ImmunoCAP检测331个中国蒿过敏病人北艾提取物、Artv 1和Art v3的sIgE抗体水平,以及209位病人Art ar2和Art an7的sIgE抗体水平,并结合病人年龄、过敏症状和地域进行数据分析,Artv 1、Artar2、Artv 3和Art an 7的过敏率分别为77%、48%、60%和85%,sIgE抗体中位数分别为6.4 1kUA/L、0.3 1kUA/L、6.6 kUA/L和2.8 kUA/L,北方病人比南方病人患哮喘的比例更高(42%vs6%),多组分过敏病人患哮喘的风险也更高,儿童、青少年与成人在北艾提取物、Art ar 2和Art an 7的sIgE抗体水平上存在显著差异。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
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