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一种金线草组织培养及快速繁殖的方法与流程

花匠小妙招
2024-12-24 00:54

技术领域：

本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种金线草组织培养及快速繁殖的方法。

背景技术：
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金线草(antenoronfiliforme)，别名毛蓼、山蓼、一串红、铁拳头、红花铁菱角、蓼子七、鸡心七、九龙盘。是蓼科金线草属多年生草本，金线草分布于山西、陕西、山东、安徽、江苏、浙江、江西、河南、湖北、广东、广西、四川、贵州等地。秋季采全草，割下茎叶，分别晒干备用，以根或全草入药。具有凉血止血，清热利湿，散瘀止痛之功效。用于吐血，肺结核咯血，子宫出血，淋巴结结核，胃痛，痢疾，跌打损伤，骨折，风湿痹痛，腰痛。近来年，金线草越来越受到人们的青睐，在园林景观和药用上得到广泛的应用。

然而，目前国内外许多学者和专家对其研究集中于药用成分和药用功效方面，而在生物特性、组织培养和快速繁殖等方面相关研究甚少，国内外均未见报道。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种成活率高，能快速繁殖并能大量得到金线草幼苗的金线草组织培养及快速繁殖的方法。该发明具有简单、快速、有效的特性，可直接运用于该物种的繁育和保护，具有可操作性，环保性以及发明的先进性。

为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：

一种金线草组织培养及快速繁殖的方法，以金线草种子为外植体，依次经a无菌苗的获取、b不定芽的初代诱导、c芽的继代增殖、d生根培养以及e试管苗的移栽，所述的b不定芽的初代诱导是将3-5cm的无菌苗去掉叶片，剪成1-2cm左右，接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，茎段外植体诱导形成新的不定芽，所用的诱导培养基为：每升1号改良ms培养基含有bap(苄氨基嘌呤)3.0-6.0μmol、tdz(n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲)0.1-0.5μmol、naa(萘乙酸)0.1-0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，ph为5.8-6.0，诱导系数为12.5-17.6。

作为优选，所述a无菌苗的获取是将消毒后的金钱草种子接种到培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20-30d，种子萌发长成约3-5cm的种苗，所用的培养基为：每升含有硫酸链霉素20-50mg，蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，种子萌发率约为60％-70％。

作为优选，所述c芽的继代增殖是将不定芽丛切开，3-4个芽为一丛(注意不用接种单个芽，单个芽容易死亡)，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，从生芽生长健壮成芽苗，增殖系数为8.7-11.4，所用的继代的培养基为：将bap(苄氨基嘌呤)1-3μmol、naa(萘乙酸)0.1-0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1号改良ms培养基中，ph为5.8-6.0，21℃灭菌20min后得到增殖培养基。

作为优选，所述b不定芽的初代诱导和c芽的继代增殖中用到的培养基为1号改良ms培养基，所述1号改良ms培养基是把国际通用的ms培养基大量元素中的nh4no3成分减少到原来重量的1/2，kno3成分减少到原来重量的3/4，其余微量元素、铁盐、有机成分不变，见表1。试验过程发现金线草不定芽在生长过程中容易玻璃化，适当的减少ms培养基配方中的nh4+和k+有利于减少不定芽玻璃化发生率，能获得更多健壮的芽苗。

作为优选，所述d生根培养是将高3-4cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：将iba(3-吲哚丁酸)1.0–3.0μmol、naa(萘乙酸)2.0-5.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于2号改良ms培养基，ph为5.8-6.0，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

作为优选，所述d生根培养用到的2号改良ms培养基是把国际通用的ms培养基大量元素中的kno3，nh4no3，kh2po4，mgso4·7h2o成分减少到原来重量的1/2，cacl2·2h2o不变，其余微量元素、铁盐、有机成分不变，见表1。

作为优选，所述e试管苗移栽是将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，每隔5d左右浇一次hoagland's营养液，培养10d，再将遮阴布移除，让金线草小苗得到充足光照，再培养15天左右，可得到生长健壮的金线草幼苗。

作为优选，所述e试管苗移栽中的移栽基质为：珍珠岩、河沙和腐殖质按质量比1∶1：2混合均匀。

作为优选，所述金线草种子的处理包括种子的采集和冷藏：将新采集的金线草种子于阴凉的地方晾干2天，用干净的信封袋装好放置于4℃冰箱中1个月；种子消毒处理：先用清水将种子冲洗干净，用无菌的纱布包住洗净的种子，用细线拴紧，用70％酒精浸泡30-40s，拿出用无菌水冲洗3-4遍，再使用10％双氧水溶液消毒12-15分钟，无菌水冲洗4-6遍，得到消毒后的外植体种子。

作为优选，所述的金线草种子为11月晴朗的上午采集到的野生金线草种子。

表1改良ms培养基配方表

本发明以金线草种子为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过无菌苗获取、不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现药用植物金线草种苗的快速繁殖，一般只需80-85天就可以获得金线草的幼苗，并且金线草幼苗的成活率可达90％以上，从而为该物种的遗传改良、种质资源保护和开发利用奠定基础。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

a、外植体消毒处理：以浙江磐安县大盘山风景区的野生金线草(antenoronfiliforme)种子为外植体，先用清水将种子冲洗干净，用无菌的纱布包住洗净的种子，用细线拴紧，70％酒精浸泡30-40s，拿出用无菌水冲洗3-4遍，再使用10％双氧水溶液消毒15分钟，无菌水冲洗4-6遍，得到消毒后的外植体；

b、无菌苗的获得：将消毒后的种子接种到培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20-30d，种子萌发长成约3-5cm的种苗，所用的诱导培养基为：每升含有硫酸链霉素50mg，蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，种子污染率为15％，种子萌发率约为70％。

c、不定芽的初代诱导：将3-5cm的无菌苗去掉叶片，剪成1-2cm左右，接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，茎段外植体诱导形成新的不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)6.0μmol、tdz(n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲)0.5μmol、naa(萘乙酸)0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为1号改良ms培养基，ph为5.8-6.0，诱导系数为17.6；每升诱导培养基的配制方法：将bap6.0μmol、tdz0.5μmol、naa0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l1号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

d、芽的继代增殖：将不定芽丛切开，3-4个芽为一丛(注意不用接种单个芽，单个芽容易死亡)，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)3μmol、naa(萘乙酸)0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为改良ms培养基，ph为5.8-6.0；增殖系数为11.4。每升继代增殖培养基的配制方法：将bap3μmol、naa-0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l1号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

e、生根培养：将高3-4cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：每升含有iba(3-吲哚丁酸)3.0μmol、naa(萘乙酸)5.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为2号改良ms培养基，ph为5.8-6；生根率为100％。每升生根培养基的配制方法：将iba3.0μmol、naa5.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l2号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

f、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，每隔5d左右浇一次hoagland's营养液，培养10d，再将遮阴布移除，让金线草小苗得到充足光照，再培养15天左右，可得到生长健壮的金线草幼苗，所用的移栽基质为：珍珠岩、河沙和腐殖质按质量比1∶1：2混合均匀，移栽成活率约为95％。

本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要80天左右，大大的加快了金线草幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得金线草幼苗。

实施例2：

a、外植体消毒处理：以浙江磐安县大盘山风景区的野生金线草(antenoronfiliforme)种子为外植体，先用清水将种子冲洗干净，用无菌的纱布包住洗净的种子，用细线拴紧，70％酒精浸泡30-40s，拿出用无菌水冲洗3-4遍，再使用10％双氧水溶液消毒12-15分钟，无菌水冲洗4-6遍，得到消毒后的外植体；

b、无菌苗的获得：将消毒后的种子接种到培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20-30d，种子萌发长成约3-5cm的种苗，所用的诱导培养基为：每升含有硫酸庆大霉素50mg，蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，种子污染率为25.5％，种子萌发率约为62％；

c、不定芽的初代诱导：将3-5cm的无菌苗去掉叶片，剪成1-2cm左右，接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，茎段外植体诱导形成新的不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)3.0μmol、tdz(n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲)0.1μmol、naa(萘乙酸)0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为1号改良ms培养基，ph为5.8-6.0，诱导系数为12.5；每升诱导培养基的配制方法：将bap(苄氨基嘌呤)3.0μmol、tdz0.1μmol、naa0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l1号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

d、芽的继代增殖：将不定芽丛切开，3-4个芽为一丛(注意不用接种单个芽，单个芽容易死亡)，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)1μmol、naa(萘乙酸)0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为改良ms培养基，ph为5.8-6.0，增殖系数为6.0。每升继代增殖培养基的配制方法：将bap1μmol、naa0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

e、生根培养：将高3-4cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：每升含有iba(3-吲哚丁酸)1.0μmol、naa(萘乙酸)2.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为2号改良ms培养基，ph为5.8-6；生根率为85％，根的基部容易形成愈伤组织。每升生根培养基的配制方法：将iba1.0μmol、naa2.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l2号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到生根培养基。

本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要85天左右，大大的加快了金线草幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得金线草幼苗。

实施例3：

b、外植体消毒处理：以浙江磐安县大盘山风景区的野生金线草(antenoronfiliforme)种子为外植体，先用清水将种子冲洗干净，用无菌的纱布包住洗净的种子，用细线拴紧，70％酒精浸泡30-40s，拿出用无菌水冲洗3-4遍，再使用10％双氧水溶液消毒12-15分钟，无菌水冲洗4-6遍，得到消毒后的外植体；

b、无菌苗的获得：将消毒后的种子接种到培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20-30d，种子萌发长成约3-5cm的种苗，所用的诱导培养基为：每升含有青霉素50mg，蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，种子污染率约为30％，种子萌发率约为58％；

c、不定芽的初代诱导：将3-5cm的无菌苗去掉叶片，剪成1-2cm左右，接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，茎段外植体诱导形成新的不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)4.5μmol、tdz(n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲)0.3μmol、naa(萘乙酸)0.2μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为1号改良ms培养基，ph为5.8-6.0，诱导系数为7；每升诱导培养基的配制方法：将bap4.5μmol、tdz0.3μmol、naa0.2μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l1号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

d、芽的继代增殖：将不定芽丛切开，3-4个芽为一丛(注意不用接种单个芽，单个芽容易死亡)，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有bap(苄氨基嘌呤)2μmol、naa(萘乙酸)0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为改良ms培养基，ph为5.8-6.0；增殖系数为8.4；每升继代增殖培养基的配制方法：将bap2μmol、naa0.1μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l1号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到继代增殖培养基。

e、生根培养：将高3-4cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：每升含有iba(3-吲哚丁酸)2.0μmol、naa(萘乙酸)3.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为2号改良ms培养基，ph为5.8-6，生根率为100％；每升生根培养基的配制方法：将iba2.0μmol、naa3.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1l2号改良ms培养基中，121℃灭菌20min后得到生根培养基。

本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要90天左右，大大的加快了金线草幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得金线草幼苗。

对比实施例，采用国际通用的培养基ms培养基，而非本发明的改良ms培养基a、外植体消毒处理：以浙江磐安县大盘山风景区的野生金线草(antenoronfiliforme)种子为外植体，先用清水将种子冲洗干净，用无菌的纱布包住洗净的种子，用细线拴紧，70％酒精浸泡30-40s，拿出用无菌水冲洗3-4遍，再使用10％双氧水溶液消毒12-15分钟，无菌水冲洗4-6遍，得到消毒后的外植体；

b、无菌苗的获得：将消毒后的种子接种到培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20-30d，种子萌发长成约3-5cm的种苗，所用的诱导培养基为：每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，污染率为40.2％，种子萌发率约为50％；

c、不定芽的初代诱导：将3-5cm的无菌苗去掉叶片，剪成1-2cm左右，接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度40μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，茎段外植体诱导形成新的不定芽，所用的诱导培养基为：每升ms培养基含有bap(苄氨基嘌呤)6.0μmol、tdz(n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲)0.5μmol、naa(萘乙酸)0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，其余为ms培养基，ph为5.8-6.0，诱导系数为6.5，芽的基部容易形成愈伤组织，芽苗容易玻璃化，影响了不定芽的诱导；每升诱导培养基的配制方法：将bap(苄氨基嘌呤)6.0μmol、tdz0.5μmol、naa0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1lms培养基中，121℃灭菌20min后得到诱导培养基。

d、芽的继代增殖：将不定芽丛切开，3-4个芽为一丛(注意不用接种单个芽，单个芽容易死亡)，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d，从生芽中有部分形成玻璃化苗，影响了不定芽的增殖；所用的继代的培养基为：每升ms培养基含有bap(苄氨基嘌呤)3μmol、naa(萘乙酸)0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g、其余为改良ms培养基，ph为5.8-6.0，增殖系数为4.7。每升继代增殖培养基的配制方法：将bap3μmol、naa0.3μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1lms培养基中，121℃灭菌20min后得到继代增殖培养基。

e、生根培养：将高3-4cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20d后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：每升ms培养基含有iba(3-吲哚丁酸)3.0μmol、naa(萘乙酸)5.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g，ph为5.8-6；生根率为70％，根的基部容易形成愈伤组织。每升生根培养基的配制方法：将iba3.0μmol、naa5.0μmol、蔗糖30g、琼脂7.5g溶于1lms培养基中，121℃灭菌20min后得到生根培养基。

f、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，培养20-30d，由此得到金线草幼苗，所用的移栽基质为：珍珠岩、河沙和腐殖质按质量比1∶1：2混合均匀，移栽成活率约为85％。

本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要120天左右，大大的加快了金线草幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得金线草幼苗。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。