作物土传病害病原真菌和卵菌的三种分子检测方法研究
作物土传病害病原真菌和卵菌的三种分子检测方法研究
【摘要】： 作物土传病害是指由生活史中部分在土壤中完成的病原物侵染作物根部和茎基部引起病害的总称,包括真菌、卵菌、细菌、病毒和线虫等病原物。作物土传病害在世界范围内广泛发生,为害粮、棉、油、菜、果、林、花、草、药等寄主植物,既造成农业生产的严重减产,也对生态环境造成巨大威胁。近年来,由于土地长年连作、秸秆还田、免耕栽培技术大面积推广实施等原因,作物土传病害的为害逐年加重,目前已成为我国农业生产上的重大障碍性问题。作物土传病害难以防控,缺乏安全有效的防控技术;作物土传病害的发病部位隐蔽、症状类似,在田间不易直接识别和诊断;并且传统的病原物检测以分离纯化和形态特征为基础,整个过程费时费力,需要专业人员完成,制约了土传病害的防控水平。有鉴于此,本研究拟开发不同的病原菌分子检测方法,为作物土传病害的防控奠定基础。为害黄瓜的五种病原物的多重PCR分子检测方法。作物土传病害常由多种病原物复合侵染造成,在田间不易区分和诊断,建立一种同时检测不同病原物的分子检测方法,对于病害的诊断及防控具有重要意义。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐反镰刀菌(Fusarium solani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)和灰霉菌(Botrytis cinerea)五种病原菌均能在黄瓜不同的生长时期侵染多个部位,造成巨大的经济损失。本文研究利用比较基因组学的方法,设计了尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、核盘菌和灰霉菌四种病原菌通用的正向引物和特异性的反向引物,通过对多重PCR反应体系不同参数的优化,建立了 一种简单高效的同时检测为害黄瓜的五种病原菌的多重PCR分子检测方法。特异性分析表明,本文建立的多重PCR分子检测方法不仅能够对五种靶标病原菌实现特异性的扩增,而且对其它真菌7个属9个种的21个菌株,卵菌2个属16个种的32个菌株无非特异性的扩增。灵敏度分析表明,多重PCR分子检测方法对瓜果腐霉菌基因组DNA的最低检测量为1 pg,对核盘菌和灰霉菌的最低检测量均为10 pg,对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌的最低检测量均为100 pg。将该多重PCR分子检测方法,用于黄瓜田块土壤和水体样品的检测分析,能够实现对病原菌的准确检测。本文建立的五种病原菌的多重PCR分子检测方法,为黄瓜病害的诊断提供了一种简易可行的方法。基于侧流层析试纸条重组酶聚合酶扩增(LF-RPA)技术的两种疫霉菌的无设备、可视化分子检测方法。疫霉菌是一类重要的土传病原卵菌,能够产生游动孢子并随灌溉水、雨水自由扩散,导致病害迅速扩展蔓延,易形成短时间内的大爆发。寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)和辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的寄主十分广泛,能够侵染为害多种作物,传播途径多样,能够在短短几日内造成毁灭性的为害。对于这两种疫霉菌引起的病害,在病害未发生时进行有效的监控,在病害发生早期进行快速的诊断是病害管理的关键一步。本文研究分别以寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌的Yptl(Yeast Protein Two,a Rab family GTPase)基因为靶标,设计了特异性的引物和探针,分别建立了基于侧流层析试纸条重组酶聚合酶扩增(Lateral flow strip recombinase polymerase amplification,LF-RPA)技术的可视化的分子检测方法。应用LF-RPA分子检测方法,在40℃孵育温度下反应,20分钟后即可肉眼判断检测结果;对寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌的灵敏度分别达到1 pg和10 pg的基因组DNA。特异性分析结果表明,该检测方法能够区分与寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌亲缘关系较近的不同种的卵菌。LF-RPA分子检测方法结合简易核酸提取技术能够在30分钟内实现从样品的制备到检测结果的读取,而且整个过程中无需离心机和PCR仪等设备,实现了无设备、可视化的等温检测,具有田间现场快速诊断的应用前景。基于LF-RPA技术的三种腐霉菌的无设备、可视化分子检测方法。腐霉菌是一类寄主广泛、世界性分布为害的土传病原卵菌,产生的卵孢子可在土壤中长期存活,引起播种后作物的猝倒病和根腐病,腐霉菌释放的大量游动孢子,导致病害的快速传播。终极腐霉菌(Pythiumnultimum)的寄主广泛,引起小麦、番茄、马铃薯、玉米、大豆等作物的猝倒病和根腐病,是农业生产上为害最严重的腐霉菌之一;畸雌腐霉菌(Pythiumirregulare)是一种喜凉型的腐霉菌,是美国中北部地区大豆根腐病的主要病原菌之一;旋柄腐霉菌(Pythium helicodes)是一种耐热型的腐霉菌,在温室环境中造成严重的为害,但我国对由畸雌腐霉菌和旋柄腐霉菌引发的病害的报道较少。本文研究分别以三种腐霉菌的ITS序列为靶标,建立了一种快速可视化的等温检测方法,即LF-RPA分子检测方法。利用LF-RPA分子检测方法,在40℃孵育温度下反应,20分钟后即可肉眼判断检测结果,对终极腐霉菌和畸雌腐霉菌的检测极限均为100 fg基因组DNA,对旋柄腐霉菌的检测极限为10 fg基因组DNA。特异性分析结果表明,LF-RPA检测方法能够区分与旋柄腐霉菌亲缘关系较近的不同种的卵菌。本文研究以三种腐霉菌为研究对象,分别建立了 LF-RPA检测方法,结合简易核酸提取技术,能够实现无设备、可视化的等温检测,有望成为病害田间诊断的有力工具,以增进对我国腐霉菌引起的病害的认识。瓜果腐霉菌real-time PCR分子检测方法。作物土传病害病原物能长期存活于土壤中,环境条件适宜时,侵染作物,易形成病害的流行与爆发,因此对土壤中土传病原物数量的动态监测,对于土传病害的防控具有重要的参考意义。瓜果腐霉菌(P.aphanidermatum)是一种典型的土传病原卵菌,能在土壤中长期存活,是许多重要作物苗期猝倒病的主要病原物之一。本文研究以瓜果腐霉菌为对象,建立了一种基于TaqMan探针的real-time PCR分子检测方法,可以用于植物和土壤样品中瓜果腐霉菌的检测和定量分析。Real-time PCR检测方法的特异性分析表明,只有瓜果腐霉菌为阳性反应,而所测试的其它卵菌2个属14个种32个菌株,真菌9个属10个种21个菌株均为阴性反应。Real-time PCR检测方法的检测极限为10 fg基因组DNA和10个拷贝标准质粒。应用real-time PCR检测方法,可以从人工接种瓜果腐霉菌游动孢子10分钟后的植物样品中检测出瓜果腐霉菌,而病斑在3小时后才出现。对接种游动孢子的土壤样品进行分析,能检测到的极限是1.67个游动孢子。Real time PCR检测方法既可以作为早期监测田间瓜果腐霉菌的一种有效工具,也可以用来研究病原菌基数与病害发生和损失的关系。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
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