首页 > 分享 > Studies on Antioxidant and α

Studies on Antioxidant and α

花匠小妙招
2024-12-26 08:30

摘要：为探究树葡萄果皮和种籽的抗氧化和对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，采用比色法测定了不同成熟度树葡萄果皮和种籽70%乙醇提取物的总多酚和总黄酮含量，并分析了他们与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的相关性。结果表明，绿果皮的总多酚含量最高（95.96 mg g-1 DW），红果皮的最低（18.31 mg g-1 DW）；绿果籽的总黄酮含量最高（43.48 mg g-1 DW），紫果籽的最低（16.50 mg g-1 DW）；抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均以绿果皮的最强，紫果籽的最弱。树葡萄果皮/籽清除·OH自由基能力均高于抗坏血酸，对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均强于阿卡波糖；其总多酚和总黄酮含量与抗氧化能力显著正相关（P < 0.05），抗氧化能力与对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈显著正相关（P < 0.05）。因此，树葡萄绿果的总多酚及总黄酮含量较高，抗氧化活性、对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用较强，可用于天然抗氧化剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发。

Studies on Antioxidant and α-Glucosidase Inhibitory Activities of Ethanol Extracts from Peels and Seeds of Jaboticaba at Different Maturities

LIN Bao-mei , ZHENG Kai-bin , ZHANG Shuai , HONG Jia-min , ZHENG Fei-yan , LIN Guo-rong , QIU Shan-lian

Abstract: In order to investigate the antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of jaboticaba (Myrciaria cauliflora) fruits at different maturities, the contents of total polyphenols (TP) and total flavonoids (TF) of 70% ethanol extracts from its peels and seeds were measured, and the correlation of TP, TF with antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity was analyzed. The results showed the contents of TP and TF, antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity in peels and seeds of jabuticaba at different maturities had obviously difference. The contents of TP and TF ranged from 18.31 to 95.96, 16.50 to 43.48 mg g-1DW, respectively. The content of TP was the highest in peels at green fruit stage, the lowest in peels at red fruit stage, while the content of TF was the highest in seeds at green fruit stage, the lowest in seeds at purple fruit stage. The peels of green fruits had the highest antioxidant capacity, while the seeds of purple fruits showed the lowest level. The capacity of scavenging ·OH of all extracts with EC50 ranged from 0.260 6 to 1.280 4 g DW L-1 was stronger than that of ascorbic acid (EC50=2.659 0 g DW L-1). The IC50 value of α-glucosidase inhibitory activity ranged from 1.134 0 to 11.414 1 mg DW L-1 showed lower than that of acarbose (IC50=3 133.47 mg L-1). The contents of TP and TF had positively significant correlation with the antioxidant capacity (P < 0.05), as well as α-glucosidase inhibitory activity and scavenging capacity of free radicals, such as DPPH·, ·OH and ABTS+. Therefore, the jaboticaba fruits at green stage were a good source of natural antioxidants and α-glucosidase inhibitors, due to its high contents of TP and TF, great antioxidation and strong inhibition on α-glucosidase.

Key words:Jaboticaba Total polyphenol Total flavonoid Antioxidant capacity α-Glucosidase inhibitory activity

树葡萄(Myrciaria cauliflora)是南美洲的一种常见水果，果实营养成分丰富，含有多种微量元素, 如钙、铁、锌, 维生素B、维生素C和多种氨基酸, 如色氨酸、赖氨酸等。果实中还含有多种挥发性成分和多酚类物质，挥发性成分有45种，如单萜烯类、烷酸类、芳香醇类等；多酚类物质有花青素、没食子酸、鞣花酸，以及黄酮类物质，如槲皮苷、异槲皮苷、杨梅苷等[1-2]。有研究表明树葡萄果实具有良好的抗炎[3]、舒张血管、降血压作用[4]，树葡萄籽具有抗氧化、抗癌细胞增殖作用[5]，果皮具有抗菌、降血脂、减少胰岛素抵抗等生物活性[6]。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前临床应用的一种能确切控制血糖水平、安全有效的降糖药物，它通过竞争性抑制小肠刷状缘上皮细胞的α-葡萄糖苷酶, 使淀粉或蔗糖分解成单糖的速度减慢，从而延缓葡萄糖吸收，达到降低餐后血糖的目的[7]。越来越多的研究已经证实氧化应激是糖尿病多种慢性并发症的不同发病机制的共同通路，抗氧化剂可阻断氧化应激损伤途径，在糖尿病的治疗中显现出日益重要的作用[8]。目前常用的抗氧化剂及α-葡萄糖苷酶抑制剂多为人工合成或微生物发酵而来，存在着安全性及毒性问题[9–10]，从植物中筛选兼有降糖和抗氧化活性的天然产物，有望获得安全高效的防治糖尿病及其并发症的天然药物。目前对于树葡萄不同成熟度果实的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究尚无相关报道。本研究选取树葡萄3个成熟阶段的果实，测定皮/籽醇提取物的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，以及总多酚和总黄酮含量，分析生物活性与总多酚、总黄酮含量的相关性，探讨可能的生物活性物质基础，为天然抗氧化剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发提供理论基础。

1 材料和方法1.1 材料

树葡萄(Myrciaria cauliflora)果实于2017年4月25日采自福建龙海市吉勇果蔬闽台合作农场, 随机选取9株树葡萄‘沙巴’品种果树，树龄15 a，采集不同成熟度果实，按照果色分为3个时期，即绿果期、红果期和紫果期。绿果为幼果期，果实颜色青绿，皮厚硬，无甜度，酸涩度高；红果为果实转色期，果实颜色呈红色或青红相间，皮逐渐变薄, 具甜味，略带酸涩；紫果为果实成熟期，颜色紫黑色，皮薄，甜度充分，无酸涩。

1.2 仪器和试剂

紫外可见分光光度计，L5S型，上海仪电分析仪器有限公司；超纯水机，UPW-20N型，北京历元电子仪器有限公司；分析天平，BS110S型，德国Sartorius集团；水浴锅，HH·S21-8-S型，上海新苗医疗器械制造有限公司；台式冷冻恒温振荡器, THZ-C-1型，苏州培英实验设备有限公司；粉碎机，WBL2521H型，佛山美的集团；旋转蒸发仪, RE- 52AA型，上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风干燥箱，GZX-9246MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1, 1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、2, 2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase, G5003-100UN)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG, N1377-1G)、邻二氮菲(P9375- 5G)均为Sigma产品；阿卡波糖水合物(acarbose hydrate, C25H43NO18·xH2O, A2485)、没食子酸、芦丁为日本东京化成工业株式会社产品。抗坏血酸、无水乙醇、95%乙醇、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠为国药集团化学试剂有限公司产品。

1.3 果实提取液的制备

将树葡萄果实去除果肉，分为果皮和种籽，分别用粉碎机(28 000 r min–1)粉碎30 s，取适量样品与70%乙醇按1:10 (m/V)混合，在摇床(30℃, 180 r min–1)中振荡提取16 h，然后以3 820×g离心15 min，取上清，经旋转蒸发仪浓缩，至冷凝管中无溶剂滴出为止，浓缩液用水溶解定容至10 mL，未见沉淀，4℃保存，待测。样品浓度单位为mg mL–1。

另取部分树葡萄果皮/籽，称鲜重后，烘干至恒重，计算干质量百分含量。绿果皮、绿果籽、红果皮、红果籽、紫果皮和紫果籽的干质量百分含量分别为14.73%、31.65%、18.76%、50.00%、22.94%和50.51%。

1.4 总多酚含量的测定

参照刘禹等[11]的方法并做适当修改。取0.1 mL样品，加入0.1 mL 1.0 mol L–1 Folin-Ciocalteu试剂和2.8 mL水，摇匀，静置8 min后加入2 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀，室温下密封避光2 h，于765 nm处测吸光度。以没食子酸为标准品，建立方程y=0.0020x+0.0614 (0~300 μg mL–1，R2=0.995 2)，式中, y为吸光度值，x为没食子酸浓度(μg mL–1)。树葡萄果皮/籽醇提取物的总多酚含量用每克干果皮/籽中所含的相当于没食子酸(GAE)的量表示，单位为mg g–1 DW。试验重复3次，每次设3个平行。

1.5 总黄酮含量的测定

参照刘禹等[11]的方法并做适当修改。取1 mL样品，加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min后加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，再摇匀静置6 min, 然后加入4 mL 4% NaOH溶液，加水定容至10 mL，静置15 min，于510 nm处测吸光度。以芦丁为标准品，建立方程y=1.2065x-0.0051 (0~60μg mL–1, R2=0.999 7)，式中, y为吸光度值，x为芦丁浓度(μg mL–1)。树葡萄果皮/籽醇提取物的总黄酮含量用每克干果皮/籽中所含的相当于芦丁(RE)的量表示, 单位为mg g–1 DW。试验重复3次，每次设3个平行。

1.6 抗氧化活性的测定

DPPH·自由基清除能力的测定参照Li等[12]的方法并稍做改动，DPPH·溶剂为95%乙醇，DPPH·清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，公式中：A0为溶剂空白对照吸光值；Ai为样品吸光值；Aj为样品本底值。·OH自由基清除能力的测定参照Caillet等[13]的邻二氮菲法，·OH清除率=[(A3-A2-A1)/(A0-A1)]×100%，式中, A0为未损伤管吸光值, A1为损伤管吸光值；A2为样品本底值；A3为样品吸光值。ABTS+自由基清除能力的测定采用Hu等[14]的方法, ABTS+清除率计算公式同DPPH·。以样品浓度(设立5个浓度梯度)为自变量，自由基清除率为因变量，绘制回归曲线，计算自由基清除率为50%时的样品浓度，以半数清除浓度(EC50)表示，每个自由基清除试验设3次重复，每次设3个平行。

1.7 α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定

取500 μL 0.2 mol L–1磷酸钾缓冲液(pH 6.8), 加入80 μL 15 mmol L–1 PNPG，200 μL样品和1.62 mL水，混合溶液在37℃恒温水浴5 min，然后加入100 μL α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U mL–1)，摇匀，37℃恒温水浴15 min，然后加入0.2 mol L–1碳酸钠溶液2.5 mL，于400 nm处测定吸光度，酶活性抑制率=[1-(A1-A2)/A0]×100%，式中：A0为溶剂空白对照管吸光值；A2为样品本底值；A1为样品管吸光值。以样品浓度(设5个浓度梯度)为自变量，α-葡萄糖苷酶活性抑制率为因变量，绘制对数回归曲线，计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率为50%时的样品浓度，以半数抑制浓度(IC50)表示，每个酶活性抑制试验设3次重复，每次设3个平行。

1.8 统计分析

采用Microsoft Excel 2007进行线性/对数回归曲线的制作；采用SPSS 22.0统计软件进行相关性和单因素方差分析。

2 结果和分析2.1 总多酚与总黄酮含量

从表 1可见，不同成熟度果皮/籽醇提取物的总多酚和总黄酮含量具有极显著差异(P < 0.01), 除绿果的果皮/籽总多酚含量接近外，红果和紫果的果皮总多酚和总黄酮含量极显著高于种籽(P < 0.01), 总多酚含量为(18.31±4.93)~(95.96±3.87) mg g–1 DW, 总黄酮含量为(16.50±0.48)~(43.48±0.55) mg g–1 DW。总多酚含量依次为绿果皮 > 绿果籽 > 紫果皮 > 红果籽 > 紫果籽 > 红果皮；总黄酮含量依次为绿果籽 > 紫果皮 > 绿果皮 > 红果籽 > 红果皮 > 紫果籽。

表 1 树葡萄果皮/籽的总多酚与总黄酮含量 Table 1 Contents of total polyphenols and total flavonoids in peels and seeds of jaboticaba

2.2 抗氧化活性2.2.1 对DPPH·自由基的清除能力

从表 2可见，3种成熟度果皮/籽醇提取物对DPPH·自由基均有一定的清除能力，且在一定的浓度范围内呈线性关系，线性系数为0.978 4 < R2 < 0.999 6，即DPPH·自由基清除率随提取物浓度的增加而升高。清除DPPH·自由基的能力依次为绿果皮 > 绿果籽 > 紫果皮 > 红果皮 > 红果籽 > 紫果籽。绿果皮的抗氧化性最强，EC50为0.180 0 g DW L–1, 紫果籽的最弱，EC50为0.731 4 g DW L–1。

表 2 树葡萄果实皮/籽醇提取物对3种自由基的清除效果 Table 2 Scavenging effect on DPPH·, ·OH and ABTS+ free radicals of 70% ethanol extracts of peels and seeds of jaboticaba

2.2.2 对·OH自由基的清除能力

从表 2可见，与清除DPPH·自由基略有不同的是红果籽醇提取物清除·OH自由基能力大于红果皮。醇提取物浓度与·OH自由基的清除率间呈现明显的量效关系，R2均大于0.98。抗氧化活性最强的为绿果皮，最弱的为紫果籽。不同成熟度树葡萄果皮/籽对·OH自由基的清除能力(EC50为0.260 6~1.280 4 g DW L–1)均高于抗坏血酸(2.659 0 g DW L–1)。

2.2.3 对ABTS+自由基的清除能力

从表 2可见，随着醇提取物浓度的增加，果皮/籽对ABTS+自由基的清除作用增强，二者呈线性关系，R2均大于0.97。不同成熟度树葡萄果皮/籽对ABTS+自由基清除能力与对·OH自由基的清除能力一致，均为绿果皮 > 绿果籽 > 紫果皮 > 红果籽 > 红果皮 > 紫果籽。绿果皮(EC50为0.258 4 g DW L–1)清除ABTS+自由基的能力最高，约为抗坏血酸(EC50为0.078 0 g DW L–1)的1/3。

2.3 对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

从表 3可见，醇提取物浓度与α-葡萄糖苷酶活性抑制率呈非线性关系，随着提取物浓度的增加, 对α-葡萄糖苷酶活性抑制率急速增高，随后变得较缓慢，成抛物线形，为对数曲线，R2均在0.96以上，趋势线拟合程度较好。果皮/籽对α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用(IC50为1.134 0~11.414 1 mg DW L–1)均远强于阿卡波糖(3 133.47 mg DW L–1)，果皮对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用明显高于相同成熟度的果籽，这与抗氧化活性相同，表明果皮中可能存在某种功能成分的含量高于果籽。不同成熟度树葡萄果皮/籽对α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用依次为绿果皮 > 绿果籽 > 红果皮 > 紫果皮 > 红果籽 > 紫果籽。绿果皮醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强，绿果籽次之，紫果籽最弱。

表 3 树葡萄果皮/籽醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 Table 3 Inhibitory activity on α-glucosidase of 70% ethanol extracts from peels and seeds of jaboticaba

2.4 相关性分析

从表 4可见，树葡萄果皮/籽醇提取物的总多酚含量与清除DPPH·、·OH和ABTS+能力均呈显著正相关(P < 0.05，0.815 7 < r < 0.902 1)；果皮/籽总黄酮含量与清除DPPH·和·OH能力呈显著正相关(P < 0.05，0.820 0 < r < 0.835 3)，与清除ABTS+能力的相关性较小(P > 0.05，r=0.774 3)。树葡萄果皮/籽的总多酚和总黄酮含量与α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的相关性较小(P > 0.05, 0.629 7 < r < 0.662 1)。

表 4 抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶活性抑制作用与总多酚、总黄酮含量的相关性 Table 4 Correlation between antioxidant capacity, inhibitory activity of α-glucosidase and contents of total polyphenols and total flavonoids

从表 5可见，树葡萄果皮/籽醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用与清除DPPH·、·OH能力呈极显著正相关(P < 0.01)，与清除ABTS+能力呈显著正相关(P < 0.05)。

表 5 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用与抗氧化活性的相关性 Table 5 Correlation between inhibitory activity of α-glucosidase and anti- oxidant activity

3 讨论和结论

本研究采用分光光度法测定了树葡萄3个成熟度果实皮/籽70%乙醇提取物的总多酚和总黄酮含量，结果表明，树葡萄从绿果期至紫果期，果皮的总多酚、总黄酮含量先降后升。杏(Armeniaca vulgaris)果皮在进入硬核期后，总多酚和总黄酮含量逐渐降低，至商熟期又有所升高[15]。李小龙[16]利用HPLC技术分析了葡萄3个红色品种果实发育过程中果皮及种子酚类物质含量的变化趋势，果皮的酚类物质在幼果期下降较为迅速, 果实转色后缓慢下降, 果实成熟后期又缓慢积累，呈先下降后上升趋势；而种子的酚类物质含量总体呈下降趋势。树葡萄果籽的总多酚、总黄酮含量随果实的成熟逐渐减少。有研究表明，黄酮类物质作为植物的次生代谢产物，在果实成熟过程中不断积累，在成熟期达到稳定或略下降[17–18]。黄酮类物质如槲皮素及其衍生物与花色苷的合成有相同的合成前体二氢黄酮醇，随着果实成熟，花色苷合成增加，总黄酮物质合成相应减少[19]，因此树葡萄果籽的总黄酮含量从绿果期至紫果期呈逐渐减少趋势可能是花色苷的大量合成，导致黄酮类物质含量不断减少。

不同的抗氧化剂通过不同的机制发挥抗氧化作用，如自由基清除、生物大分子结构保护、减缓或抑制脂质氧化等[20]。对DPPH·、·OH和ABTS+的清除能力常用于评价植物提取物的抗氧化性，其中·OH是人体内最活跃的氧自由基，对体内氧化还原反应有重大影响[21–22]。本研究采用3种方法评价树葡萄果皮/籽醇提取物对自由基的清除能力，结果表明，所有醇提取物清除·OH的能力(EC50为0.260 6~ 1.280 4 g DW L–1)均高于抗坏血酸(2.659 0 g DW L–1), 清除DPPH· (EC50为0.180 0~0.731 4 g DW L–1)和ABTS+ (0.258 4~0.902 8 g DW L–1)的能力低于抗坏血酸(分别为0.051 0和0.078 0 g DW L–1)。多数植物清除DPPH·、·OH的能力与多酚、黄酮含量具有显著相关性[23–24]，也有的相关性较小[25–26]。树葡萄果实皮/籽对DPPH·、·OH自由基的清除能力与总多酚和总黄酮含量呈显著相关性。有研究表明，甘薯(Ipomoea batatas)叶、金盏花(Tagetes erecta)清除ABTS+的能力与多酚、黄酮含量有显著相关性[27–28]，铁皮石斛(Dendrobium officinale)清除ABTS+的能力与总黄酮含量显著相关，与总多酚含量相关性较小[29]。本研究结果表明，树葡萄果皮/籽醇提取物清除ABTS+的能力虽然与总多酚含量显著相关，但与总黄酮含量的相关性较小。不同植物的活性物质组成不一样，清除自由基的能力也各异，但都保持与多酚、黄酮类物质含量密切的联系。

采用α-葡萄糖苷酶活性抑制酶学模型测量树葡萄3种成熟度果实皮/籽醇提取物体外对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果表明，所有醇提取物的酶活性抑制作用均远强于阿卡波糖，说明树葡萄果皮/籽在开发α-葡萄糖苷酶抑制剂方面可能具有很大的潜力和价值。相关性分析结果表明，树葡萄果皮/籽对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用与总多酚、总黄酮含量的相关性较小，与3种自由基清除能力具有显著或极显著正相关性(表 4)。金银花(Lonicerae japonicae)和朱砂根(Ardisia crenata)具有较强的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用[30–31]。闫淑霞[32]从杨梅(Myrica rubra)果实中分离得到矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、杨梅苷、槲皮苷和金丝桃苷等4种黄酮糖苷类化合物单体，这4种单体均有显著的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，同时抗氧化活性也与4种单体含量呈显著正相关性。因此，我们认为植物抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性有共同的物质基础，可能与多酚、黄酮中的某一类物质息息相关。树葡萄果皮/籽中可能仅是部分总多酚和总黄酮类物质发挥α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，因而α-葡萄糖苷酶活性抑制作用与总多酚、总黄酮含量相关性较小。

3种成熟度的树葡萄果皮/籽在抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶活性抑制作用、总多酚及总黄酮含量上存在显著差异，以绿果的皮/籽的抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶活性抑制作用、总多酚及总黄酮含量较高，清除·OH的能力高于抗坏血酸，对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用强于阿卡波糖。综上所述，树葡萄绿果可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂和抗氧化剂的良好来源，但树葡萄果皮/籽中究竟是哪种化学成分在发挥抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性，尚有待进一步研究。