首页 > 分享 > 一种霉菌孢子制品的制备方法与流程

一种霉菌孢子制品的制备方法与流程

花匠小妙招
2024-12-28 03:08

一种霉菌孢子制品的制备方法与流程

本发明涉及霉菌孢子培养领域，更特别地，涉及一种霉菌孢子制品的制备方法。

背景技术：

霉菌是自然界中广泛分布的一种微生物，在湿度大、温度高的环境中极易生长。当霉菌在军用装备、漆膜、包装、电子设备等表面大量生长时，不仅会影响其外观，更会造成相关设备故障，影响设备的正常工作。因此，国内外一直很重视防止霉菌生长的各种研究工作。而霉菌试验则是检验相关产品和材料防霉能力的有效手段。世界各国也先后制定了相关的霉菌试验标准，标准中都涉及到相关霉菌的培养及霉菌孢子悬液的制作方法。

国内关于防霉实验的标准中，大多采用传统的pda培养基进行霉菌的培养，活化及培养过程耗时较长，且产孢率低。同时孢子悬液的制备工艺繁琐复杂，孢子洗脱费时费力，效率难以提高。

此外，对于孢子悬液的保藏时间要求不超过14d，保存期相对较短。目前市面上出售的相关孢子悬液产品，存在保藏时间短、活力易减低、性能不可控、贮存运输不便等问题，给实际生产带来了极大的不便。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种霉菌孢子制品的制备方法，包括以下步骤：

s1：将霉菌接种至含有小米和麸皮的固体培养基上；

s2：待所述固体培养基表面长满所述霉菌后，用洗脱溶液从所述固体培养基上洗脱所述霉菌的孢子，得到孢子洗脱液；

s3：将所述孢子洗脱液进行过滤，离心洗涤，得到孢子沉淀物，然后将所述孢子沉淀物加工成所述霉菌孢子制品。

用麸皮+小米作为培养基，来代替传统的pda固体培养基进行霉菌的培养，不仅产孢量有了大幅度的提高，而且缩短了孢子成熟时间，极大的提高了工作效率。传统的pda固体培养基进行霉菌培养后，需要人工将培养基表面的孢子刮至无菌水中，这一过程耗时费力，大大降低了工作效率。而用麸皮+小米(1:1)作为培养基进行霉菌培养后，只需向其中加入无菌水就可直接进行下一步的震荡过滤工作，工作效率得到了很大的提高。

在一个优选实施方案中，s1中所述固体培养基通过以下方法配制得到：将50重量份的小米、50重量份的麸皮、2重量份的葡萄糖以及80重量份的蒸馏水混匀，高温灭菌15min。

在一个优选实施方案中，s1中，所述霉菌放置于三角瓶中28℃下培养。三角瓶培养方式，操作简便，易洗脱。

在一个实施方案中，s2中，所述洗脱溶液含有0.01％吐温80的水溶液。选择吐温80浓度为0.01％的无菌水溶液作为霉菌孢子悬液的洗脱液，更有利于孢子洗脱与计数。

在一个实施方案中，s2包括以下步骤：用所述洗脱溶液浸渍所述固体培养基上的霉菌，180-220r/min震荡30min，收集处理后的洗脱溶液，即得到所述孢子洗脱液。

在一个优选实施方案中，s1中，所述霉菌放置于三角瓶中28℃下培养。三角瓶培养方式，操作简便，s3中，所述过滤通过用8层纱布(21s*21s/30*28)来进行。纱布过滤操作方便，易回收利用，且适合孢子悬液的大批量生产。

在一个优选实施方案中，s3中，所述离心洗涤时的离心转速为5000-8500rpm，洗涤次数为3-5次。离心速度为5000-8500rpm之间时，离心效果比较好，但是当再提高离心速度，当离心速度为12000rpm时，离心效果反而下降。

在一个实施方案中，所述孢子制品为孢子悬液，通过将所述孢子沉淀物重悬至无菌水中，调节孢子浓度为106-107cfu/ml来得到。

在一个优选实施方案中，所述孢子制品为孢子粉，通过将所述孢子沉淀物干燥得到。孢子粉产品相对于传统的孢子悬液产品，其保存期有了极大的延长，传统孢子悬液要求保存期不超过14d，本孢子粉产品其保存期可至少延长至180d，复溶后孢子悬液浓度基本没有变化。以孢子粉的产品形式进行贮存运输，更加便利，可有效的避免保存运输时孢子悬液的洒漏等。

在一个优选实施方案中，所述孢子沉淀物在35℃、-0.09mpa条件下减压干燥。35℃下干燥大幅减少了干燥时间，但是对孢子的活力影响不大。

附图说明

图1为不同培养基培养霉菌产孢量的统计图；

图2为不同洗脱溶液效果比较；

图3为不同干燥温度的效果比较；

图4为不同干燥方式的效果比较。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.培养方式的选择

将黑曲霉、土曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、宛氏拟青霉、短柄帚霉、绳状青霉、赭绿青霉、球毛壳、绿色木霉等十株霉菌，分别接种于土豆琼脂平板、土豆斜面、土豆琼脂茄子瓶、麸皮平铺平板、麸皮平铺三角瓶培养，28℃培养。观察生长情况与生长速度，对比孢子成熟时产孢量，以及进行洗脱分离难易程度，以此选择最佳的培养方式。

霉菌的生长速度如表1所示。

表1各菌株在不同培养基中的生长情况

(注：+表示生长速度慢，成熟后孢子量少；++表示生长速度一般、成熟后孢子量少；+++表示生长速度较快，成熟后孢子较多；++++表示生长速度快，成熟后产孢子量多。)

从表1中可看出，麸皮培养基的平板和三角瓶培养均能使各菌株迅速生长，并且成熟后产孢子量多。然而，平板培养较易干燥，且容易污染；茄子平和斜面的培养速度稍慢，少数菌株如绿色木霉、短柄帚霉等产孢子量较少。从洗脱来看，麸皮三角瓶和平板均能快速洗脱。使用麸皮三角瓶培养霉菌操作简便，易洗脱，因此培养方式选择麸皮三角瓶平铺方式。

2.培养基的选择

将黑曲霉、赭绿青霉、宛氏拟青霉、土曲霉和绿色木霉等5种霉菌分别接种于pda固体斜面培养基、纯麸皮培养基、纯小米培养基、麸皮+小米(1:1)培养基中，28℃培养，观察霉菌生长情况与生长速度，对比孢子成熟时间，进行洗脱分离后于30℃真空烘干并称重得到孢子粉，对比孢子粉重量。结果显示，麸皮+小米(1:1)不仅缩短了霉菌包子的成熟时间，而且是孢子产量大大提高(图1)，极大提高了工作效率。传统的pda固体培养基进行霉菌培养好，需要将培养基表面的孢子刮至无菌水中，耗时耗力。而麸皮+小米(1:1)培养基进行霉菌培养后，只需向其中加入无菌水就可直接进行下一步的震荡过滤工作，工作效率得到了很大的提高。

3.霉菌孢子洗脱溶液的选择

以黑曲霉为研究对象，选择同一个平板上培养的黑曲霉，用直径10mm打孔器打孔30片，每个三角瓶中放入10片，分别加入浓度为0.005％、0.01％、0.015％的吐温80无菌水溶液中，震荡洗脱后检测孢子浓度。结果图2所示，0.01％的吐温80无菌水溶液，更有利于孢子洗脱与计数。

4.霉菌孢子悬液过滤工艺的选择

以黑曲霉为研究对象，将已经洗脱震荡后的孢子悬液，分别用滤纸、1层玻璃纤维、半层玻璃纤维、脱脂棉、8层纱布过滤，得到初始孢子悬液。将过滤后的滤料用无菌水进冲洗，得到冲洗液。将过滤后的孢子悬液分别进行离心，5000r/min，30min，弃掉上清液，在滤渣中加入无菌水，重新悬浮离心，如此重复，直至滤液变清。用5ml无菌水稀释离心的孢子沉淀物，充分震荡混合均匀后得到孢子重悬液。用血球计数法对初始孢子悬液、冲洗液和孢子重悬液孢子数量进行统计。结果如表2所示。

表2

通过对过滤过程的观察发现：经滤纸过滤后，滤液基本澄清，霉菌孢子难以透过滤纸，因此滤纸不适合作为滤料；一层玻璃纤维棉吸水性太强，并且滤料中的吸收的孢子也不易洗脱，因此一层玻璃纤维棉也不适合作为过滤滤料。半层玻璃棉纤维、8层纱布、脱脂棉作为滤料，过滤较为通畅，进一步比较其过滤效果。由表1统计结果显示，脱脂棉冲洗液中孢子数量明显高于其他两种滤料，说明脱脂棉对霉菌孢子具有很强的吸附性。对离心后的重悬液进行镜检观察，脱脂棉重悬液基本无菌丝，而纱布和半层玻璃纤维棉都有少量菌丝片段，说明脱脂棉对菌丝具有很好的去除效果。比较初始孢子悬液中孢子浓度，半层玻璃纤维棉浓度最高，脱脂棉浓度最低。因此用脱脂棉作为滤料，虽然其对菌丝具有很好的去除效果，但要获得高浓度的孢子悬液需对滤料进行反复冲洗，比较耗时，物料无法回收利用，不适用于孢子悬液大批量生产；而半层玻璃纤维棉裁剪不便，且回收利用时不易冲洗；纱布过滤操作方便，易回收利用，且适合孢子悬液的大批量生产，故采用8层纱布(21s*21s/30*28)进行过滤。

5.霉菌孢子悬液离心工艺的选择

以黑曲霉为研究对象，将过滤之后的黑曲霉孢子悬液，分别用5000rpm、8000rpm、12000rpm转速离心，离心后去上清，并用同体积无菌水重新悬浮，反复操作，进行镜检观察是否有菌丝残留，离心直至无菌丝残留，上清液呈清亮为止，记录离心次数并对重悬液进行血细胞计数统计。结果如表3所示。所得的孢子沉淀物可用适量无菌水复溶并调节孢子浓度为106～107cfu/ml，得到孢子悬液，也可干燥制备成孢子粉。

表3不同离心速度的效果比较

从表3中可看出，离心速度为5000-8500rpm之间时，离心效果比较好，但是当再提高离心速度，当离心速度为12000rpm时，离心效果反而下降。

6.孢子粉的制备

6.1干燥温度的选择

以黑曲霉孢子为实验对象，将一定浓度孢子悬液分别装入西林瓶中，装量体积为0.1ml，将西林瓶分别放置于20℃、35℃、50℃环境中烘干，每组三个平行样同时进行，记录干燥所需时间、各干燥温度对霉菌孢子活菌浓度的影响。结果如图3所示，温度越高干燥速度越快，但50℃环境下对孢子进行长时间干燥，会降低其孢子活菌数。因此，选择35℃为最佳干燥温度。

6.2干燥方式的选择

黑曲霉孢子悬液为实验对象，将一定浓度孢子悬液装入西林瓶中，装量体积分别为0.1ml、0.05ml，分别放置于35℃环境下进行常压与减压干燥，记录干燥所需时间、干燥前后对霉菌孢子活菌的影响。

结果如图4所示，装液深度对干燥时间有一定影响，因此，尽量选择广口平铺方式进行干燥；对比常压与减压两种干燥方式，结果表明，减压干燥效果好，速度快、孢子成活率高，为最佳的干燥方式。

6.3孢子粉的保存期验证

通过以上方法制备8种霉菌孢子悬液和孢子粉，于相同温度4℃下保存。孢子粉保存前后分别加入同等适量无菌水复溶，测定其孢子浓度。霉菌孢子悬液同样测定保存前后的孢子浓度，比较两种保存方式对孢子浓度的影响，结果如表4所示。孢子悬液保存30d后，孢子浓度即下降一个数量级。而孢子粉保存180d后，孢子浓度依然没有变化。由此可见，以孢子粉的形式保藏，可以大大的延长其保存期。

表4储存时间对活孢子数的影响

6.4孢子粉与孢子悬液的霉菌测试效果和活力比较

相同实验条件下，按照标准《gjb150.10a-2009》，用新制作的相同浓度的霉菌孢子悬液与孢子粉产品进行活力测试与霉菌测试。结果显示，孢子粉的霉菌试验效果以及活力(表4)与霉菌孢子悬液效果无差别。

表5孢子悬液与孢子粉产品活力测试结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。