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一种蝉花的人工培养方法与流程

花匠小妙招
2024-12-29 02:28

本发明涉及一种蝉花的人工培养方法，具体涉及一种通过控制固体培养基厚度提高蝉花孢梗束产量的人工培养方法。
背景技术：
：中药蝉花为蝉棒束孢isariacicadaemiquel(蝉拟青霉paecilomycescicadae(miquel)samson)寄生在蝉若虫上并利用寄主的营养形成的内菌核及孢梗束，是我国传统著名的中药材之一，其药用历史比冬虫夏草早800年。蝉花属药食兼用真菌，具有较高的营养价值和特定的功效。蝉花可产生多种在医疗和保健上有重要作用的生理活性物质，包括核苷类、环肽类、多糖类、醇类、甾醇类及有机酸等，在调节免疫、改善肾功能、调节脂类代谢、抗肿瘤、抗疲劳、镇痛、催眠、降压降血糖等方面作用明显。天然蝉花资源十分有限，远不能满足市场需求，加上野生蝉花因为产地不同、采收时间不一、易被杂菌污染霉变及含重金属等问题，其品质受到质疑。因此，人工培育蝉花越来越受到重视。目前，已经实现了蝉花的工厂化栽培。人工培育蝉花，主要是通过固体发酵的原理，利用谷物作为培养基。将蝉棒束孢通过斜面种子接种到摇瓶、发酵罐扩大培养，经固体发酵形成若花状分叉多枝的孢梗束，经采收干燥即可作食药用原料。固体培养蝉花，随着固体培养基厚度的增加，孢梗束得率会缓慢降低，因此为了充分利用原料以及获得较高的产品得率，现有技术中固体培养基的厚度均较薄，一般控制在2cm左右。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种蝉花的人工培养方法，该方法通过控制固体培养基厚度可显著提高孢梗束产量。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种蝉花的人工培养方法，该方法包括如下步骤：步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；步骤3，对孢梗束进行采收；其中，所述固体培养的培养基厚度大于或等于3cm。进一步，所述固体培养的培养基厚度为3～8cm；更进一步，所述固体培养的培养基厚度为3～6cm；更进一步，所述固体培养的培养基厚度为4～5cm。进一步，步骤1所述扩大培养包括斜面培养和液体培养；更进一步，所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的任意一种或几种。进一步，步骤1扩大培养的培养温度为20～25℃。进一步，步骤2固体培养的接种量为5％～15％；更进一步，接种量为7％～12％。进一步，步骤2固体培养过程分为光培养和暗培养，暗培养阶段培养温度20-24℃，相对湿度为70-85％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-85％。更进一步，步骤2光培养阶段光照强度为50-200lx。进一步，步骤3对孢梗束进行采收后还包括步骤4对孢梗束进行干燥；更进一步，所述干燥方法为先将孢梗束湿度降至30～45％，再进行干燥；更进一步，干燥温度低于60℃。本发明斜面培养、液体培养和固体培养所采用的培养基均为本领域常规培养基；所用液体培养基可以是马铃薯-蔗糖-琼脂培养基(psa)、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(pda)、马铃薯-葡萄糖-水培养基(psb)、酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基(saay)、酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基中的任意一种或几种。所述固体培养的培养基可以是谷物培养基、农作物秸杆培养基、农作物皮壳培养基、经济林木树枝培养基等。所述谷物培养基选自以小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物秸秆培养基选自以麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物皮壳培养基选自以麸皮、大豆皮、棉籽壳中的任意一种或几种为主要原料的培养基。更进一步，所述固体培养基优选谷物培养基。本发明的有益效果：固体培养蝉花，随着固体培养基厚度的增加，孢梗束得率会逐渐降低，因此为了充分利用原料以及获得较高的产品得率，现有技术中固体培养基的厚度均较薄，一般控制在2cm左右。本发明克服了上述技术偏见，将固体培养基厚度提高至3cm或3cm以上，意外的发现虽然孢梗束得率略有下降，但产量却获得显著提高(25.7-33.1％)，更重要的是能耗和人力成本几乎没有增加，这样生产效能提高了14.3-22.5％，且经检测产品的内在质量与对照相比无显著性差异。本发明所述蝉花广泛分布在我国秦岭-淮河以南的18个省、市、区。在我国长江以南的亚热带和热带地区，且多在低洼地带及滇藏高原的金沙江、怒江、澜沧江和雅鲁藏布江等河谷地带。只要在其生长季节，每年的6-8月，按照一般中药材的采集方法都可采到，是现有技术中已知菌种，并可以从商业途径购买获得。本发明实验用蝉花菌种系从安徽石台地区采集的天然蝉花上分离纯化所得，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(简称cgmcc)注册保藏，保藏号cgmcc3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)。实验例1固体培养基厚度考察取实施例1制备的液体种子，考察固体培养基厚度为2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm时培养的孢梗束产量和得率(每组设置5个重复)，固体培养方法参照实施例4，结果见表1。表1固体培养基厚度对孢梗束产量的影响注：表中所述“孢梗束得率”是指每个培养位收获的孢梗束干重与所投的原料小麦干重的比值；“产量”是指每个培养位收获的孢梗束干重。由表1可见，当固体培养基厚度高于2cm时，随着培养基厚度的增加，虽然得率稍有降低，但总产量却大幅提高，将培养基厚度控制在4-5cm时，与原工艺2cm相比，产量增加25.7-33.1％；当培养基厚度继续增加，产量增加不明显。以每日1000个培养位(原工艺2cm厚度日投料1吨)为例，将培养基厚度控制在4-5cm时，产量增加31.2-40.2kg，市售价值达到23.9-30.8万元；而制备固体培养基所用的小麦原料仅增加400-600kg，成本仅增加1520-2280元。综上所述，当固体培养基厚度大于或等于3cm时，随着培养基厚度的增加，孢梗束产量大幅提高；尤其是将培养基厚度控制在4-5cm时，既可大幅提高孢梗束产量，且不会导致成本的显著上升，经济效益十分显著。具体实施方式以下实施例中所用蝉花菌种系从安徽石台地区采集的天然蝉花上分离纯化所得。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)。实施例1蝉花菌种的扩大培养斜面培养：将蝉花菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；种子罐培养：在50l气升式发酵罐中装入20l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20l；发酵罐培养：在500l气升式发酵罐中装入200l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200l种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200l。斜面试管培养基：200g土豆煮汁，20g蔗糖，20g琼脂，余补水至1000ml，ph值为6.5；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：10g酵母浸出粉，5g复合氨基酸，35g白砂糖，余量补水至1000ml，ph值为6.5。实施例2蝉花菌种的扩大培养培养过程和培养条件同实施例1，区别在于：斜面试管培养基为：10g酵母浸出粉，40g葡萄糖，10g蛋白胨，20g琼脂，余量补水至1000ml，ph值6.0；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：40g麸皮煮汁，30g白砂糖，余补水至1000毫升，ph值为6.5。实施例3蝉花菌种的扩大培养培养过程和培养条件同实施例1，区别在于：斜面试管培养基为：40g麦芽糖，10g蛋白胨，20g琼脂，余量补水至1000ml；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：30g酵母浸出粉，30g白砂糖，5g大豆水解蛋白，余量补水至1000毫升，ph值为6.5。实施例4蝉花菌种的固体培养固体培养基的制备：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦：水为1：1.4，混合均匀；拌匀后装入培养容器中，培养基厚度控制在4cm。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30-50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按10％的接种量接种实施例1～3任一得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。培养条件：暗培养阶段培养温度为22-24℃，空气相对湿度70-85％；待菌丝体长满培养基时转为光培养，培养室温度为20-22℃，相对空气湿度70％～85％，保证有散射光(50lx～200lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜；至孢梗束成熟，尚未大量产生孢子(约23～26天)。实施例5蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基厚度为3cm。实施例6蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基厚度为5cm。实施例7蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基厚度为6cm。实施例8蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基厚度为7cm。实施例9蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基厚度为8cm。实施例10蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基为大米和水按1:1.3的比例混合而成。实施例11蝉花菌种的固体培养固体培养过程同实施例4，区别在于固体培养基为小米和水按1:1.3的比例混合而成。实施例12采收及干燥对实施例4～11任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度40％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度60℃，干燥时间8h-10h。实施例13采收及干燥对实施例4～11任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度45％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度55℃，干燥时间8h-10h。实施例14采收及干燥对实施例4～11任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度30％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度60℃，干燥时间8h-10h。对照实施例1固体培养过程同实施例4，区别在于，固体培养基厚度为2cm。不同培养基厚度培养的孢梗束质量比较取实施例1制备的菌种，按实施例4、5、6和对照实施例1进行固体培养，按照实施例12的采收及干燥方法对孢梗束进行采收及干燥，测定其蛋白质、腺苷、多糖含量，蛋白质参照gb5009.5，食品安全国家标准，食品中蛋白质的测定(含第1号修改单)、腺苷含量按《保健食品检验与评价技术规范》2003版，保健食品中腺苷的测定中规定的方法测定、粗多糖的测定按照《保健食品功效成分检测方法》(白鸿主编)的方法测定。结果见表2。表2有效成分含量比较由表2可见，随着培养基厚度的增加，有效成分含量无显著变化，说明增加培养基厚度不影响孢梗束质量。除湿干燥工艺考察取实施例1制备的菌种，按实施例4、6进行固体培养，并按照表3所示的方法进行采收及干燥，观察产品的外观。结果见表3。表3不同干燥方法效果比较固体培养方法干燥方法产品外观实施例4实施例12干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例12，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色实施例13干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例13，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色实施例14干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例14，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色实施例6实施例12干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例12，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色实施例13干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例13，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色实施例14干燥后颜色浅黄色-深黄色同实施例14，但不除湿干燥后颜色暗灰色-黑色上述结果表明，采用相同温度干燥，经过除湿后再干燥的孢梗束颜色为浅黄到深黄色，而不经除湿而直接干燥的孢梗束颜色为暗灰色到黑色。可见，先除湿再干燥的工艺能显著改善产品的外观，是产品具有更强的市场竞争力。当前第1页12