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大豆DELLA基因家族鉴定及分析

花匠小妙招
2024-12-29 09:48

大豆是世界上重要的油料蛋白作物，大豆油占全球食用油的25%。大豆也是重要的植物蛋白来源，全球主要的人用畜用蛋白均来自于大豆。大豆在中国有着几千年的种植历史[1]。大豆生长过程中需要大量氮元素，直接施用化学氮肥固然是一种可行的方法但限制诸多，氮肥过剩对生态环境易造成严重污染[2]。生物固氮的高效利用则可以有效减少化学氮肥的使用。植物和微生物互利共生是其中的典型代表，而DELLA基因家族是微生物共生信号通路的主要调控蛋白[3]。植物的发育是一个从发芽开始到成熟的有序过程，它受环境条件和内部植物激素的调节，如脱落酸、乙烯、生长素和赤霉素。赤霉素可以调节种子萌发、茎和花的发育过程，以及其他发育过程[4]，这些过程均有DELLA基因家族的参与。

DELLA在植物赤霉素（Gibberellic Acid，GA）信号通路中起关键作用。DELLA可以调节基因转录、限制植物发育并抑制GA信号传导[5]。DELLA最明显的特征是N端DELLA结构域。一些先前鉴定的DELLA域（PfamID：PF12041）被发现含有“DELLA”氨基酸序列[6]。DELLA属于GRAS家族，是一种植物特异性核蛋白。DELLA蛋白可以与许多转录因子相互作用，包括脱落酸响应因子ABI3、ABI5、生长素响应因子ARF6、植物色素相互作用因子PIFs以及油菜素内酯转录因子BZR1信号，它们参与多种植物激素信号通路，从而参与植物激素之间的复杂串扰[7]。

DELLA基因已在很多植物中被鉴定，如水稻、拟南芥、小麦、玉米和番茄等。在拟南芥中，全基因组鉴定了五个DELLA基因：RGALIKE1（RGL1）、RGL2、RGL3、GAI和RGA。RGA、RGL1、RGL2调节花的发育；RGL2抑制种子萌发；RGL3在种子萌发过程中抑制种皮破裂；RGA和GAI可抑制营养生长[8]。在玉米中，鉴定了两个DELLAD： WARF8（D8）和DWARF9（D9），其它DELLA基因，如HEIGHT-1（RHT-1）、SLENDERRICE1（SLR1）、PROCERA和VvGAI1分别在小麦、水稻、番茄和葡萄藤中被鉴定出来。

DELLA可以促进植物与微生物共生过程中侵染线的形成；它还可以控制植物与根瘤菌的共生[9]。此外，DELLA在植物生长发育中也很重要，可以与TCP转录因子相互作用，影响花序茎顶端的发育，从而控制植物高度[10]。DELLA可以调节植物生殖器官大小，影响受精，促进果实生长，DELLA也可以调节叶片衰老[11] 。目前对于大豆中的DELLA研究还是少之甚少，所以针对DELLA影响植物生长发育和促进植物与微生物共生这一特点，本文利用DELLA结构域在大豆基因组序列中鉴定大豆DELLA基因家族成员，对其理化性质、染色体定位、基因结构、蛋白结构域、保守基序分布、系统进化树、顺式作用元件分析、物种间共线性分析、基因表达进行了非常深入的探究，并对其进行阐述和说明，以期为后续研究大豆DELLA基因的生物学功能和生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 大豆DELLA基因家族的鉴定

根据DELLA基因相关研究，获得拟南芥和水稻DELLA家族的CDS序列和氨基酸序列，鉴定大豆DELLA基因家族的方法总共有以下几种方法。第一种方法通过Pfam （http://pfam.xfam.org/）数据库下载DELLA家族隐马尔可夫模型（HMM），在植物基因数据库Ensemblplants下载大豆基因组序列（DNA FASTA），蛋白序列文件（Protein sequence FASTA）和基因结构注释文件（GTF）, 利用HMMER 3.1 WINDOWS软件以HMM（DELLA）为模板在大豆Glycine max.v2.1组序列数据库中搜索（BLAST）大豆 DELLA基因。第二种方法在大豆数据库SoyBase搜索DELLA基因获得序列。第三种方法用文献中报道的拟南芥DELLA AT1G14920序列为对照，在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blast比对获取Expect threshold为0.0001的大豆DELLA基因，对以上三个结果进行去重处理，并用Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对筛选到的序列进行保守结构域鉴定，最终获得7个大豆DELLA基因家族成员。

1.2.2 大豆DELLA基因家族在染色体的位置和基因结构分析

通过植物基因数据库Ensemblplants（http://plants.ensembl.org/index.html）下载的大豆基因结构注释文件，得到7个DELLA基因家族成员在染色体上的具体位置信息、基因结构信息，利用TBtools v1.09857[12]软件绘制染色体定位图和基因结构图。

1.2.3 大豆DELLA基因家族的motif位置预测

利用在线软件MEME（https://meme-suite.org/meme/）预测7个DELLA基因家族的保守基序位置，其参数设置中，基序数量设置为20个，其余参数设置信息不变，预测结果利用TBtools v1.09857软件绘制。

1.2.4 大豆、拟南芥、水稻DELLA基因序列对比及家族系统进化树分析

在Phytozome13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载大豆、拟南芥、水稻基因序列，经过上述鉴定方法得到DELLA基因家族，利用MEGA10.1.8软件进行序列对比，以Neighbor jioning法、Bootstrap Replications值为1000，其余参数值为默认数值构建进化树；FigTree v1.4.3软件和iTOL[13]在线软件对进化树修饰美化。

1.2.5 大豆DELLA基因家族的顺势作用元件分析

利用TBtools v1.09857提取大豆DELLA基因家族各成员的上游2000 bp序列，在PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上进行数据分析预测，最后利用TBtools v1.09857绘制图像。

1.2.6 大豆DELLA基因家族物种内与物种间的共线性分析

在大豆数组库SoyBase（https://www.soybase.org/）和拟南芥数据库TAIR（https://www.arabidopsis.org/)下载大豆和拟南芥的全基因组序列和基因结构注释文件，利用McScan软件进行共线性分析预测，采用TBtools v1.09857软件绘制共线性分析结果图。

1.2.7 大豆DELLA基因家族的表达量情况

在Phytozome12下载大豆DELLA基因家族成员在不同组织中表达量的转录组数据，使用TBtools v1.09857软件HeatMap功能绘制热图，并进行层次聚类分析。

2 结果与分析

2.1 大豆DELLA基因家族成员全基因组鉴定

本研究通过生物信息学分析，在大豆全基因组中鉴定了7个DELLA基因，通过Web CD-Search Tool和Pfam工具分析其保守结构域，发现7个DELLA基因都含有DELLA这个典型的特征结构域，只是出现的位置略有差异（图1），通过MEME分析其保守基序（Motif），发现7个DELLA基因含有相同的保守基序，因此本研究成功鉴定了7个大豆DELLA基因家族成员。前人研究表明，拟南芥DELLA家族有5个基因，水稻DELLA家族有1个基因，大豆DELLA基因成员较多，这可能与大豆的全基因组复制有关。7个DELLA基因分别命名为GmDELLA1到GmDELLA7。利用Expasy（https://www.expasy.org/）分析了7个DELLA基因的氨基酸长度、分子质量和等电点。分析结果表明，7个大豆DELLA基因分别位于7条染色体，这些基因编码区序列，最长的为GmDELLA1（1788 bp），最短的为GmDELLA7（1467 bp）。其中GmDELLA2编码区序列长度与GmDELLA1相差不多，GmDELLA3，4，5，6编码区序列长度极为相似。其中，外显子数目均为1个，编码的氨基酸数目在488到595 aa之间，分子质量在54 187.50到64 978.02 Da之间，理论等电点分布在5.00到5.28之间，说明大豆DELLA普遍呈弱酸性（表1）。

图1 大豆DELLA基因家族保守结构域

Fig. 1 Conserved domain of soybean DELLA gene family

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表1 大豆DELLA基因家族基本信息

Table 1 Basic information of soybean DELLA gene family

基因编号

Gene symbol

基因名称

Gene ID

染色体

Chromosome

编码区长度 /bp

Length of CDS

外显子数目

Number of exons

编码质特性

Coding protein characteristics

氨基酸长度 /aa

Length

分子质量 /Da

等电点

GmDELLA1 Glyma.11G216500 11 1788 1 595 64978.02 5.00 GmDELLA2 Glyma.18G040000 18 1755 1 584 63889.00 5.16 GmDELLA3 Glyma.08G095800 08 1554 1 517 57260.74 5.21 GmDELLA4 Glyma.05G140400 05 1572 1 523 57870.21 5.28 GmDELLA5 Glyma.04G150500 04 1512 1 503 56008.33 5.00 GmDELLA6 Glyma.06G213100 06 1518 1 505 56288.29 5.05 GmDELLA7 Glyma.10G190200 10 1467 1 488 54187.50 5.28

2.2 大豆DELLA基因家族染色体定位

为了确定大豆DELLA基因家族在染色体上位置的具体分布，采用Ensemblplants（http://plants.ensembl.org/index.html）下载的大豆基因结构注释文分析，TBtools v1.09857软件进行可视化（图2），发现7个大豆DELLA基因分布在不同的染色体上，并没有出现同一条染色体出现多个DELLA基因拷贝的现象，其中Glyma.04G150500、Glyma.06G213100位于染色体中部，Glyma.05G140400、Glyma.10G190200和Glyma.11G216500位于染色体下端，Glyma.08G095800、Glyma.18G040000位于染色体上部。

图2 大豆DELLA基因家族染色体定位

Fig. 2 Chromosome mapping of soybean DELLA gene family

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2.3 大豆DELLA基因家族的MEME分析与基因结构分析

利用在线软件MEME（https://meme-suite.org/meme/），对大豆DELLA基因家族7个成员进行保守基序在线分析（图3），基序参数设置为20。Motif预测分析表明，大豆DELLA基因家族成员保守基序结构相似，其中7个大豆DELLA基因共有的保守基序为11个，分别是motif6、motif9、motif7、motif10、motif1、motif4、motif8、motif3、motif12、motif2和motif5，对这11个基序进一步分析发现，motif6、motif9是保守结构域DELLA的一部分，motif7、motif10、motif1、motif4、motif8、motif3、motif12、motif2和motif5是保守结构域GRAS的一部分。在Ensemblplants（http://plants.ensembl.org/index.html）下载GTF文分，利用TBtools绘制基因结构图。图4为大豆DELLA基因家族的基因结构图，其中7的DELLA基因均只含有一个外显子，没有内含子，CDS序列位置没有太大明显差异。

图3 大豆DELLA基因家族Motif分析预测

Fig. 3 Motif analysis and prediction of soybean DELLA gene family

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图4 大豆DELLA基因家族基因结构示意图

Fig. 4 Schematic diagram of gene structure of soybean DELLA gene family

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2.4 大豆DELLA基因家族的系统进化树分析

经过前人的研究表明，拟南芥有5个DELLA基因，分别为AT1G14920、AT1G66350、AT2G01570、AT3G03450和AT5G17490；水稻有1个DELLA基因，是LOC_Os03g49990，为了进一步明确DELLA基因家族的进化关系，利用拟南芥，水稻和本研究的7个大豆DELLA基因一起构建系统进化树。如图5所示，这些基因分为4个亚家族，黄色亚家族包含3个基因，分别是Glyma.04G150500 、Glyma.06G213100和Glyma.10G190200，皆为大豆基因；蓝色亚家族包含4个基因分别是Glyma.08G095800、Glyma.05G140400、AT1G14920和AT2G01570，其中大豆基因有2个，拟南芥基因有2个，AT1G14920和AT2G01570可以抑制营养生长，由此预测Glyma.08G095800和Glyma.05G140400抑制营养生长有关；绿色亚家族包含5个基因，其中大豆基因2个，拟南芥基因3个，AT1G66350、AT3G03450可以调节花的发育，AT3G03450还可以抑制种子萌发，AT5G17490在种子萌发过程中抑制种皮破裂，由此推测Glyma.11G216500、Glyma.18G040000有可能会参与大豆荚皮的发育和调控炸荚习性；红色亚家族只有水稻1个基因，LOC_Os03g49990可以诱导茎的伸长。

图5 大豆、拟南芥、水稻DELLA基因家族系统进化树

Fig. 5 Phylogenetic tree of DELLA gene family in soybean, Arabidopsis and rice

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2.5 大豆DELLA基因家族的顺式作用元件分析

提取大豆DELLA基因家族各成员上游2000 bp的启动子序列进行顺势作用元件分析，结果显示所有成员的启动子区域，都含有大量的顺式作用元件，包括参与脱落酸、赤霉素等植物激素反应的顺式作用元件，参与分生组织表达、胚乳表达、ATBP-1的结合位点、干旱诱导的MYB结合位点和光反应的顺式作用元件。其中，光反应元件分布在大豆DELLA基因家族的所有成员中，占比最多。从图6中可以看出，同一亚族中的大豆DELLA基因家族成员的顺式作用元件并未展示出一致的分步性。

图6 大豆DELLA基因家族顺式作用元件分析

Fig. 6 Analysis of cis acting elements of soybean DELLA gene family

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2.6 大豆DELLA基因家族的共线性分析

为了深入探究大豆DELLA基因家族的进化关系，对其分别进行物种内（图7A）和物种间（图7B）的共线性分析，大豆物种内的共线性关系如图7A所示，Glyma.11G216500和Glyma.18G040000存在共线性关系；Glyma.08G095800和Glyma.05G140400存在共线性关系；Glyma.06G213100和Glyma.04G150500存在共线性关系；Glyma.10G190200不存在共线性关系。

图7 大豆DELLA基因家族物种内和物种间的共线性分析注：A:大豆DELLA基因家族的物种内共线性关系,同一条红线上的大豆DELLA基因是线性关系; B:大豆DELLA基因家族和拟南芥DELLA基因家族的物种间共线性关系，同一条蓝色上的大豆DELLA基因和拟南芥DELLA基因是线性关系

Fig. 7 Synteny analysis within and between species of soybean DELLA gene family

Note: A: The intra species collinearity of soybean DELLA gene family, and the soybean DELLA gene on the same red line is linear; B: The species of soybean DELLA gene family and Arabidopsis DELLA gene family are collinear, and the soybean DELLA gene and Arabidopsis DELLA gene on the same blue line are linear

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对拟南芥和大豆的DELLA基因家族进行共线性分析发现,大豆中7个DELLA基因在拟南芥中只有4个有共线性关系，分别是Glyma.11G216500、Glyma.18G040000、Glyma.08G095800和Glyma.05G140400，拟南芥虽然有5个DELLA基因，却只有3个基因有共线性关系。

2.7 大豆DELLA基因家族的表达模式分析

为研究DELLA基因家族在大豆各组织器官中的表达情况，利用Phytozome12数据库获得大豆DELLA基因家族在大豆9种不同组织材料中的转录表达数据（图8）。大豆DELLA基因在不同组织器官中的表达模式存在差异，Glyma.18G040000和Glyma.11G216500在大豆各个组织中都有表达，且表达量相对较高，Glyma.05G140400和Glyma.08G095800表达量次之，Glyma.04G150500 、Glyma.06G213100和Glyma.10G190200表达量最低，其中Glyma.18G040000在种子中表达量最高，在荚中表达量最低；Glyma.11G216500在根毛中表达量最高，在花中表达量最低，这些基因在组织中的表达差异明显，说明该家族基因可能与器官分化和发育有关，由此推测他们在不同的组织部位中行使功能不同。

图8 大豆DELLA基因家族的组织表达分析

Fig. 8 Tissue expression analysis of DELLA gene family in soybean

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3 讨论与结论

近年来大豆的需求与日俱增，有充分证据表明，大豆是世界上的主要油料作物，为人类提供了重要的植物油分来源，在有限的技术基础之上想要提高大豆的产量，无疑是个巨大的挑战[14]。大豆产量取决于总氮吸收、氮利用效率和收获指数。氮吸收依赖于生物固定和土壤吸收[15]。DELLA不仅能影响植物生长发育，更重要的还是植物与微生物共生固氮通路上的重要调控因子[3]。如果能够提高固氮效率，那么不但大豆产量会得到提高，更会代替氮肥使用从而平衡农田生态系统，保护生态环境。大豆基因组测序的完成为大豆基因功能研究奠定了基础。近年来，大豆中有多个基因家族被鉴定发表，比如DELLA基因的同家族基因GRAS基因，还有WKRY、MYB、NAC、HD-Zip、ARF和MADS [16~21]等等。而DELLA基因也在拟南芥、水稻、玉米等重要植物中被鉴定。唯独大豆中的DELLA基因家族的研究和分析相对滞后。因此我们决定进一步研究大豆中的DELLA基因家族。

赤霉酸（GA）是一种主要的植物激素，参与从开花到与微生物共生的几个生物过程，能够促进细胞伸长和植物生长。DELLA 是GA信号转导途径中的重要调控蛋白 [22]。

细菌结瘤因子（NFs）和影响NF信号的植物调节途径控制根瘤菌感染和结瘤效率。DELLA介导的赤霉素（GA）信号抑制根瘤菌感染，并控制苜蓿中感染标记物ENOD11的NF诱导。在没有共生信号的情况下，组成活性DELLA在表皮中的异位表达足以促进ENOD11。DELLA可以与结瘤信号通路2（NSP2）和核因子NF-YA1相互作用，这是激活NF反应所必需的。此外，DELLA的GA依赖性作用可能直接使NSP1、NSP2和ERN1转录的NF-YA1激活，从而调节根瘤菌感染[9]。

在自然环境下，GA通过几种正调节因子，包括 GA受体GA-INSENSITIVE DWARF 1（GID1）、SPINDLY（SPY）和F-box（SLY1, SNE）来解除对DELLA的抑制，以刺激植物生长[23]。然而，一些研究表明DELLA的稳定性可以通过GA依赖和独立的水解进行调节[24]。OsmiRNA396先前已被证明与GA响应性生长调节因子（GRF）相互作用。OsmiR396通过在互补位点切割mRNA来调节水稻GRF。当OsmiR396过表达时，产生的植物具有矮化表型，这是由较少且较小程度的单个细胞引起的[25]。

DELLA基因已分别在水稻和拟南芥中鉴定了1和5个DELLA基因。其中，水稻DELLA基因LOC_Os03g49990可以诱导茎的伸长；拟南芥DELLA基因AT1G14920和AT2G01570可以抑制营养生长，AT1G66350、AT3G03450可以调节花发育，AT3G03450还可以抑制种子萌发，AT5G17490在种子萌发过程中抑制种皮破裂。在7个大豆DELLA基因中，Glyma.04G150500 、Glyma.06G213100和Glyma.10G190200为一个亚族，与LOC_Os03g49990进化关系较近，因此推测Glyma.04G150500 、Glyma.06G213100和Glyma.10G190200通过参与GA信号通路影响大豆株高；Glyma.08G095800、Glyma.05G140400、AT1G14920和AT2G01570为一个亚族，因此推测Glyma.08G095800和Glyma.05G140400与营养分配，生长发育有关，从而影响大豆产量；AT1G66350、AT3G03450、AT5G17490、Glyma.11G216500和Glyma.18G040000为一个亚族，因此推测Glyma.11G216500和Glyma.18G040000参与调控种子萌发、分蘖、开花的生理过程，从而增加种子重量和发芽[26]。本研究发现了大豆DELLA基因家族启动子中的多种顺式元件，包括光响应元件、激素响应元件和应激相关元件，然而，需要进一步的实验研究以更好地了解大豆DELLA基因家族在生物和非生物胁迫条件下的不同作用。

DELLA的特征在于DELLA的N端结构域和GRAS的C端结构域。本研究发现大豆DELLA基因家族共享相似类型的保守域。而且，大豆DELLA基因之间的基序编号及其组成分布均匀，表明大豆DELLA结构域高度保守。拟南芥、甘蓝型油菜、白菜型油菜和芥菜中的DELLA基因家族显示出包含单个外显子且没有任何内含子的基因结构。研究表明，没有内含子或内含子较少的基因在应对生物和非生物胁迫时会迅速表达[27~28]。

在本研究中，我们鉴定了7个大豆DELLA基因，这些基因分布在7条不同的染色体上。它们都只含有一个外显子，和一个N端结构域，证明大豆DELLA基因家族结构高度保守。保守域和Motif分析表明同一进化分枝上的DELLA具有相似性，表明他们的基因功能可能相似。此外，顺势作用元件和基因表达分析揭示了大豆DELLA基因家族参与了植物激素、光反应和生物胁迫过程中的潜在调控；系统进化树和共线性分析表明了大豆DELLA基因在物种内和物种间的同源性关系，以期更好地理解进化机制。本研究全面调查了大豆DELLA基因家族的基因特征，为理解大豆DELLA基因的生物学功能研究奠定了基础，为大豆遗传改良提供了参考依据。

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