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一种大花红景天快速繁殖的方法与流程

花匠小妙招
2024-12-31 21:01

一种大花红景天快速繁殖的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，主要涉及一种快速获得大花红景天温室苗的培养方法，更具体的说，先利用大花红景天种子萌发成无菌苗；再用无菌苗茎段和叶片，再生成完整小植株，扩大繁殖率；然后移栽小植株到温室培育，进行壮苗培养；再在温室中进行茎段繁殖，最终实现大花红景天温室苗的扩大繁殖。

背景技术：

2.大花红景天(rhodiola crenulata(hook.f.et thoms.)h.ohba)是景天科、红景天属多年生草本植物，是贵重藏药红景天的正品基源植物之一，被称为高原人参。大花红景天主要分布于中国西藏、云南西北部、四川西部，尼泊尔、印度、不丹等地，生长在海拔2000-5000多米的高原山坡草地、灌丛中、石缝中。其药用部位为根，含有丰富的红景天苷、黄酮、多种维生素和微量元素以及人体必需的多种氨基酸等，主要活性成分为酪醇、红景天苷和洛塞维。研究表明，红景天具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。
3.当前，大花红景天的药用资源完全依赖于野生资源。由于其生存环境恶劣、繁殖效率低下，以及野生资源过度采挖、低海拔下栽培困难、可用药材生长周期长等因素，导致原本就珍稀的野生资源面临更加严重的短缺和匮乏。因此，建立大花红景天的快速繁殖技术是解决其药用资源的重要途径。目前，虽然有利用种子萌发无菌苗、或利用愈伤组织再生成苗的研究报道，但在生产实践中存在的一些诸如过多过度依赖于自然种子资源、繁殖率低、愈伤组织来源苗实际移栽成活率低等问题，使得至今尚未能利用植物组织培养技术实现大花红景天的快速繁殖。
4.采用本发明所建立的由大花红景天无菌苗茎段和叶片再生成苗，再利用温室苗扩大繁殖的方式，可以弥补当前完全依赖于野生资源、以及野生资源不足等问题，对解决大花红景天的药用资源问题具有重要意义。

技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于运用植物组织培养方法，利用无菌苗茎尖和叶片再生小植株的快速扩大繁殖、温室苗茎尖再生成苗的快速扩大繁殖，从而实现大花红景天的快速繁殖。
6.根据本发明的技术方案，提供了一种快速繁殖大花红景天的方法，所述方法包括采用大花红景天种子萌发与无菌苗的快速扩增繁殖，以及温室苗培育与快速扩增繁殖。
7.本发明提供了一种快速培养大花红景天温室苗的方法，该方法包括下列步骤：
8.(1)种子萌发获得大花红景天无菌苗；
9.(2)进行种子萌发的无菌苗培养；
10.(3)无菌苗叶片外植体再生成完整小植株；
11.(4)再生小植株移栽到温室；
12.(5)温室苗培育；
13.(6)温室苗茎段再生成完整植株。
14.根据本发明的快速培养大花红景天的方法，包括下列步骤：
15.(1)将无菌种子在含有蔗糖和琼脂的ms基本培养基中培养，进行种子萌发与幼苗发育，得到无菌苗；
16.(2)将无菌苗在1#生根培养基中培养，进行种子萌发的无菌苗培养，所述1#生根培养基为含有活性炭、蔗糖和琼脂的ms基本培养基；
17.(3)取无菌苗茎尖，接种到2#生根培养基中培养，剪去茎尖的无菌苗剩余部分继续在1#生根培养基中培养，再生出新的茎尖后，剪下的茎尖在2#生根培养基中培养，生根，再生成完整植株；所述在2#生根培养基为含有琼脂糖、吲哚乙酸(iaa)、蔗糖和琼脂的怀特基本培养基；
18.(4)取无菌苗叶片，接种到3#生根培养基中，在室温和光照下培养，长成完整无菌苗小植株；所述3#生根培养基为含有iaa、蔗糖和琼脂的1/2ms培养基；
19.(5)将无菌苗小植株在温室中炼苗，移栽，在培养介质中进行温室苗培养，培养得到壮苗后的温室苗；
20.(6)取壮苗后的温室苗的茎尖，插入用4#生根培养基拌湿的培养基质中，所述4#生根培养基为含有iaa的怀特基本培养基。
21.更具体的说，本发明方法包括以下步骤：
22.1.将无菌种子在含有20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基中培养约4-6周，进行种子萌发与幼苗发育，得到无菌苗；
23.2.将无菌苗在1#生根培养基中培养约6-12周，进行种子萌发的无菌苗培养，所述1#生根培养基为含有0.5-1.5克/升活性炭、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基；
24.3.取无菌苗茎尖，接种到2#生根培养基中培养，剪去茎尖的无菌苗剩余部分继续在1#生根培养基中培养，约2-4周可再生出新的茎尖；剪下的茎尖2#生根培养基中培养约1-2周，可见根的发生，约3-4周后可再生成完整植株；所述在2#生根培养基为含有琼脂糖和0.3-1.0mg/l吲哚乙酸(iaa)、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的怀特基本培养基；
25.4.取无菌苗叶片，接种到3#生根培养基中，在室温和光照下培养约6-12周，长成完整无菌苗小植株；所述3#生根培养基为含有0.2-0.8mg/l iaa、30克/升蔗糖和5-7％琼脂的1/2ms培养基；
26.5.将无菌苗小植株在温室中炼苗，移栽，在含有泥炭土和赤玉土的培养介质中进行温室苗培养，培养约3-6周，得到壮苗后的温室苗；
27.6.取壮苗后的温室苗的茎尖，插入用4#生根培养基拌湿的培养基质中，所述4#生根培养基为含有0.3-1.0mg/l iaa的怀特基本培养基。
28.根据本发明的技术方案，还提供了一种用于快速培养大花红景的联合用培养基，其包括如下四种生根培养基：
29.(1)用于进行种子萌发的无菌苗的培养的1#生根培养基；
30.(2)用于进行无菌苗的茎尖培养的2#生根培养基；
31.(3)用于进行无菌苗的叶片培养以长成完整无菌苗小植株的3#生根培养基；
32.(4)用于壮苗后的温室苗的培养的4#生根培养基，所述4#生根培养基用于拌湿培
养基质进行温室苗培养。
33.在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于快速培养大花红景的联合用培养基，其包括如下四种生根培养基：
34.(1)用于进行种子萌发的无菌苗的培养的1#生根培养基，所述1#生根培养基为含有活性炭、蔗糖和琼脂的ms基本培养基；
35.(2)用于进行无菌苗的茎尖培养的2#生根培养基，所述2#生根培养基为含有琼脂糖、吲哚乙酸(iaa)、蔗糖和琼脂的怀特基本培养基；
36.(3)用于进行无菌苗的叶片培养以长成完整无菌苗小植株的3#生根培养基，所述3#生根培养基为含有iaa、蔗糖和琼脂的1/2ms培养基；
37.(4)用于壮苗后的温室苗的培养的4#生根培养基，所述4#生根培养基用于拌湿培养基质进行温室苗培养，所述4#生根培养基为含有iaa的怀特基本培养基。
38.在根据本发明的实施方案中，还提供了将上述联合用培养基用于快速培养大花红景天温室苗的用途。
39.根据本发明的实施方案，克服了依赖于种子繁殖的组织培养方法，提高了温室苗成活率，实现了大花红景天的快速扩增繁殖。本发明解决了大花红景天组织培养苗的快速繁殖方式，为大花红景天快速扩增繁殖提供了有效的方法。
附图说明
40.图1：种子萌发的无菌苗在不同培养基中培养2个月9天后对比图。
41.图2：大花红景天温室苗茎尖在不同培养基拌湿的介质中培养3周后对比图。
42.发明详细描述
43.本发明采用大花红景天无菌苗茎尖、无菌苗叶片、温室苗茎尖三阶段的扩增繁殖，由1粒种子经过8-12个月扩繁到10-30株适于室外移栽的温室苗，且由种子萌发而得到的无菌苗仍可继代培养，为后续无菌苗茎尖、叶片的快速扩增繁殖提供材料，每个植株再经过5-8个月又可扩繁到10-30株适宜于室外移栽的温室苗。
44.在本发明的具体实施方案中，培养在室温和光照条件下进行，室温通常可以为15-30℃，优选18℃-27℃，更优选温度为18℃-22℃，光照条件为：全光谱led灯光照2000-10000勒克斯，优选4000-10000勒克斯，9-16小时/天，更优选10-16小时/天，或者与之类似的自然光照。
45.在本发明的具体实施方案中，所提及的培养时间可根据具体情况进行调整和改变，例如，所述约1-2周的时间可包括约7-14天，例如5-18天。
46.在更具体的实施方案中，本发明提供了一种快速繁殖大花红景天的方法，所述方法包括以下步骤：
47.1.种子萌发与幼苗发育：
48.对种子进行无菌化处理，得到无菌种子，将无菌种子整齐的排列于含有20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基中，在室温和光照条件下培养约1个月，种子萌发，得到无菌苗。
49.2.无菌苗培养：
50.将无菌苗接种到含1#生根培养基的培养瓶中，在室温和光照条件下培养约2-3个
月，进行种子萌发的无菌苗培养，所述1#生根培养基为含有0.5-1.5克/升活性炭、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基。
51.3.由无菌苗茎尖再生成完整无菌小植株：
52.取步骤2培养的无菌苗，将无菌苗茎尖部位约1-3cm切下，接种到2#生根培养基中，剪去茎尖的无菌苗剩余部分继续在1#生根培养基中在室温和光照下培养，2-4周可再生出新的茎尖；剪下的茎尖在2#生根培养基中在室温和光照下培养1-2周，可见根的发生；3-4周可再生成完整植株；所述在2#生根培养基为含有琼脂糖和0.3-1.0mg/l吲哚乙酸(iaa)、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的怀特基本培养基。
53.4.由无菌苗叶片再生成完整无菌苗小植株：
54.取步骤3培养的完整无菌小植株，将其无菌苗叶片剪下，接种到3#生根培养基中，在室温和光照下培养1-2周，叶片伤口处发生根的分化；再过约4-10周，长成完整无菌苗小植株。所述3#生根培养基为含有0.2-0.8mg/l iaa、30克/升蔗糖和5-7％琼脂的1/2ms培养基。
55.5.将无菌苗小植株移栽进行温室苗培养：
56.将从步骤4获得的培养瓶中的无菌苗小植株连瓶从光照培养室转移到温室，2-3天后，打开瓶盖，炼苗1-2天；从培养瓶中取出无菌苗，用水清洗根部培养基，吸干根部水分，移栽入温室苗培养介质中培养约1个月，得到壮苗后的温室苗；所述的温室苗培养介质配制方法为：将营养土和赤玉土按体积比7-9:3-1的比例拌匀，所述培养土优选为泥炭土，所述赤玉土为中粒赤玉土。
57.6.从温室苗茎尖再生成完整温室苗：
58.取从步骤5获得的壮苗后的温室苗，从枝条茎尖2-4cm部位剪下，插入用4#生根培养基拌湿的培养基质中，所述4#生根培养基为含有0.3-1.0mg/l iaa的怀特基本培养基，所述的培养基质配制方法为：将蛭石和珍珠岩按7-9:3-1体积比拌匀；于温室条件下培养约1周，可见明显根的发生；3-4周长成完整植株。
59.在进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种快速繁殖大花红景天的方法，所述方法包括以下步骤：
60.1.种子萌发与幼苗发育：
61.1.将种子倒入离心管内，用60-80％乙醇(优选75％乙醇)处理20-60秒，吸去乙醇；加入5-15％(优选10％)次氯酸钠溶液反复震荡3-10分钟；吸去次氯酸钠，用无菌水冲洗3-6次，即得到无菌种子；将无菌种子整齐的排列于含有20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基中，在室温和光照的条件下培养3-6周；优选采用三基色荧光灯光照3000-4000勒克斯、9-12小时/天，温度22-27℃；种子萌发，得到无菌苗。
62.2.无菌苗培养：
63.将步骤1在培养皿中发芽得到的无菌苗，接种到含1#生根培养基的培养瓶中，在室温和光照条件下培养约2-3个月，优选采用全光谱led灯光照6000-7000勒克斯，11-14小时/天，温度22-27℃，进行种子萌发的无菌苗培养，所述1#生根培养基为含有0.5-1.5克/升活性炭、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基。
64.为了对实验条件进行筛选，发明人同时采用了其他生根培养基进行了对照实验，将步骤1在培养皿中发芽得到的无菌苗分别转接种到(1)本发明的第一生根根培养基、(2)
msoh、(3)ms和(4)1/2ms固体培养基的培养瓶中，结果表明，本发明的第一生根根培养基长势最好，并且植株大小均衡。具体结果参见图1。
65.3.由无菌苗茎尖再生成完整无菌小植株：
66.取步骤2培养的无菌苗，于超净台中，将无菌苗茎尖部位约1-3cm切下，接种到2#生根培养基中，剪去茎尖的无菌苗剩余部分继续在1#生根培养基中在室温和光照下培养，2-4周可再生出新的茎尖；剪下的茎尖在2#生根培养基中在室温和光照下培养1-2周，可见根的发生；3-4周可再生成完整植株；所述在2#生根培养基为含有琼脂糖和0.3-1.0mg/l吲哚乙酸(iaa)、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的怀特基本培养基。
67.4.由无菌苗叶片再生成完整无菌苗小植株：
68.取步骤3培养的完整无菌小植株，超净台上，将其无菌苗叶片剪下，接种到3#生根培养基中，所述3#生根培养基为含有0.2-0.8mg/l iaa、30克/升蔗糖和5-7％琼脂的1/2ms培养基。在光照和室温下培养1-2周，叶片伤口处发生根的分化，优选采用全光谱led灯光照6000-7000勒克斯、11-14小时/天，温度22-27℃；再过2周，发生芽点分化；再过2周，芽分化及生长明显；再过2-4周，可长成完整小植株。
69.5.将无菌苗小植株移栽进行温室苗培养：
70.将从步骤4获得的培养瓶中的无菌苗小植株连瓶从光照培养室转移到温室，2-3天后，打开瓶盖，炼苗1-2天；从培养瓶中取出无菌苗，用水清洗根部培养基，吸干根部水分，移栽入温室苗培养介质中培养约1个月，得到壮苗后的温室苗；优选采用全光谱led灯光照7000-10000勒克斯、11-14小时/天，温度18-25℃；所述的温室苗培养介质配制方法为：将营养土和赤玉土按体积比7-9:3-1的比例拌匀，优选营养土和赤玉土按体积比8:2的比例拌匀，使用前用含有多菌灵的水打湿，使其轻握成团。所述培养土优选为泥炭土，所述赤玉土为中粒赤玉土；更优选所述营养土为德国klasmann422泥炭土，所述赤玉土为三本线牌中粒土。
71.6.从温室苗茎尖再生成完整温室苗：
72.取从步骤5获得的壮苗后的温室苗，从枝条茎尖2-4cm部位剪下，插入用4#生根培养基拌湿的培养基质中，所述4#生根培养基为含有0.3-1.0mg/l iaa的怀特基本培养基，所述的培养基质配制方法为：将蛭石和珍珠岩按7-9:3-1体积比拌匀。在温室中，在室温和关照条件下培养，优选采用全光谱led等光照7000-10000勒克斯11-14小时/天，温度18-25℃，约1周，可见明显根的发生；3-4周长成完整植株；在温室培养过程中，2-3天淋水一次，3-4周用4#生根培养基淋灌一次。或置于育苗箱中，于温室和关照条件下培养3-4周长成完整植株，其中当培养1周后，气孔开放1/4，2周后气孔全部打开。期间不需要淋水或培养基。
73.为了对实验条件进行筛选，在该步骤中，发明人同时采用了多种组合物与4#生根培养基相对照，进行了平行实验。将步骤5获得的壮苗后的温室苗分别转接种到用下列组合物拌湿的基质中：
74.(1)水(h2o)，
75.(2)附加0.2mg/l iaa的水(h2o+0.2iaa)，
76.(3)附加0.5mg/l iaa的水(h2o+0.5iaa)，
77.(4)1/2ms，
78.(5)附加0.2mg/l iaa的1/2ms(1/2ms+0.2iaa)，
79.(6)附加0.5mg/l iaa的1/2ms(1/2ms+0.5iaa)，
80.(7)怀特基本培养基(wb)，
81.(8)附加0.2mg/l iaa的wb培养基(wb+0.2iaa)，
82.(9)附加0.5mg/l iaa的wb培养基(即本发明4#生根培养基)。
83.结果表明，本发明的第四生根根培养基长势最好，并且植株大小均衡。具体结果参见图2。
84.在该步骤中，所述培养基质的配制方法为：将蛭石和珍珠岩按照7-9:3-1的体积比拌匀，优选按照8:2体积比拌匀。
85.在更具体的实施方案中，所述的温室条件为：温度为18℃-27℃，光照条件为：全光谱led灯光照2000-10000勒克斯，优选4000-8000勒克斯，10-16小时/天。所述的三基色荧光灯为飞利浦t8 6500k日光灯管(36瓦)；所述的全光谱led灯为光一全光谱led植物生长灯(30瓦)。
86.在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于快速培养大花红景的联合用培养基，其包括如下四种生根培养基：
87.(1)用于进行种子萌发的无菌苗的培养的1#生根培养基，所述1#生根培养基为含有活性炭、蔗糖和琼脂的ms基本培养基；
88.(2)用于进行无菌苗的茎尖培养的2#生根培养基，所述2#生根培养基为含有琼脂糖、吲哚乙酸(iaa)、蔗糖和琼脂的怀特基本培养基；
89.(3)用于进行无菌苗的叶片培养以长成完整无菌苗小植株的3#生根培养基，所述3#生根培养基为含有iaa、蔗糖和琼脂的1/2ms培养基；
90.(4)用于壮苗后的温室苗的培养的4#生根培养基，所述4#生根培养基用于拌湿培养基质进行温室苗培养，所述4#生根培养基为含有iaa的怀特基本培养基。
91.在更优选的实施方案中，本发明提供了一种用于快速培养大花红景的联合用培养基，其包括如下四种生根培养基：
92.(1)所述1#生根培养基为含有0.5-1.5克/升活性炭、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的ms基本培养基；
93.(2)所述2#生根培养基为含有琼脂糖和0.3-1.0mg/l吲哚乙酸(iaa)、20-40克/升蔗糖和3-10％琼脂的怀特基本培养基；(3)所述3#生根培养基为含有0.2-0.8mg/l iaa、30克/升蔗糖和5-7％琼脂的1/2ms培养基；
94.(4)所述4#生根培养基为含有0.3-1.0mg/l iaa的怀特基本培养基。
95.培养基的ph值均为ph5.5-6.5，优选ph5.7-6.0，更优选ph5.85。
96.在根据本发明的实施方案中，还提供了将上述联合用培养基用于快速培养大花红景天温室苗的用途。
97.在根据本发明的实施方案中，还提供了根据本发明的方法获得的大花红景天温室苗。
98.本发明克服了现有大花红景天组织培养依赖种子萌发的繁殖周期长、难以由愈伤组织再生成苗、繁殖率低等缺点和不足，提供了一种快速获得批量大花红景天温室苗的培养方法，以获得便于快速进行室外移栽的、适应性强的大花红景天温室苗。根据本发明的实施方案，可以有效进行大花红景天的工业化生产，愈伤组织出芽速度快、生根率高、成活率
高，解决了大花红景天组织培养苗的快速繁殖，显著提高了温室苗成活率，并且植物根系和整个植株的发育状态优越，实现了大花红景天的规模化生产繁殖。
99.在根据本发明的具体实施方案中，其中所涉及的ms、1/2ms、msoh与wb基本培养基组成如下。本领域技术人员可以理解的是，其中所述各种成分的含量可根据实际情况适当调节，并可在一定误差范围内变化，如在
±
30％内变化，优选在
±
20％内变化，更优选在
±
10％内变化：
100.ms培养基，全称为murashige and skoog培养基，由murashige和skoog于1962年设计，在本发明具体的实施方案中，其配方组成为：1650毫克/升nh4no3、16.9毫克/升mnso4.h2o、332.2毫克/升cacl2、0.25毫克/升na2moo4.2h2o、180.7毫克/升mgso4、0.83毫克/升ki、1900毫克/升kno3，8.6毫克/升znso4.7h2o、170毫克/升kh2po4、2毫克/升glycine、6.2毫克/升h3bo3、100毫克/升moy-inos itol、0.025毫克/升cocl2.6h2o、0.5毫克/升nicotinic acid、0.025毫克/升cuso4.5h2o、0.5毫克/升pyridoxine hcl、36.7毫克/升fenaedta、0.1毫克/升thiamine hcl、30克/升蔗糖，ph值5.85。ms固体培养基的碳源为蔗糖，ms固体培养基的凝胶剂为琼脂。蔗糖在ms固体培养基中的浓度为25-40克/升，琼脂在ms固体培养基中的浓度为5-8克/升,优选6-7克/升。
101.1/2ms培养基，为ph值不变、所有成分减半的ms培养基。
102.msoh培养基，在本发明具体的实施方案中，包括以下成分：1900毫克/升kno
3、
170毫克/升kh2po
4、
180毫克/升mgso4、330毫克/升cacl2、0.83毫克/升ki、6.2毫克/升h3bo3、22.3毫克/升mnso4.4h2o、8.6毫克/升znso4.7h2o、0.25毫克/升na2moo4.2h2o、0.025毫克/升cuso4.5h2o、0.025毫克/升cocl2.6h2o、100毫克/升moy-inositol、0.5毫克/升thiamine hcl、0.4毫克/升pyridoxine hcl、0.5毫克/升nicotinic acid、2毫克/升glycine、37.3毫克/升na2edta、27.8毫克/升feso4.7h2o、1克/升水解酪蛋白、30克/升蔗糖，ph值5.85。
103.怀特(white)培养基，在本发明具体的实施方案中，包括以下成分：65毫克/升kcl、0.00085毫克/升h
32
mo7n6o
28、
80毫克/升kno
3、
200毫克/升na2so
4、
351.6毫克/升mgso
4、
2.67毫克/升znso4.7h2o、16.8毫克/升nah2po
4、
2毫克/升glycine、0.001毫克/升cuso4.5h2o、100毫克/升moy-inositol、3.47毫克/升feso4.7h2o、0.1毫克/升thiamine hcl、1.5毫克/升h3bo
3、
0.5毫克/升nicotinic acid、0.75毫克/升ki、0.5毫克/升pyridoxine hcl、5.31毫克/升mnso4.h2o、208.47毫克/升ca(no3)2.4h2o、30克/升蔗糖，ph值5.85。
104.以上培养基配制为固体培养基时，均附加5.0-7.5克/升琼脂。
105.各种培养基的ph值均为ph5.5-6.5，优选ph5.7-6.0，更优选ph5.85。
具体实施方式
106.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。
107.实施例1
108.1.大花红景天种子萌发
109.2.将大花红景天的种子倒入2毫升离心管内，加0.8毫升75％乙醇处理30秒，吸去乙醇。
110.3.加入0.8毫升10％次氯酸钠反复震荡6分钟。
111.4.吸去次氯酸钠，用无菌水，冲洗6次，即得到无菌种子。
112.5.将无菌种子用牙签整齐排列于附加30克/升蔗糖、6％琼脂的ms固体培养基上。
113.6.采用三基色荧光灯光照3000-4000勒克斯10小时/天，温度25℃，培养1个月。种子萌发率60-70％。
114.实施例2
115.无菌苗(瓶苗)生长
116.1.将在培养皿中发芽的无菌苗，转移到1#生根培养基(附加30克/升蔗糖、6％琼脂和1克/升活性炭的ms固体培养基)中。
117.2.全光谱led灯光照6000-7000勒克斯，12.5小时/天，温度25℃，培养2-3个月。
118.实施例3
119.无菌苗茎尖再生成完整小植株
120.1.超净台上，打开无菌苗培养瓶，用剪刀剪下约1-2cm无菌苗茎尖部位，接种到2#生根培养基(附加0.5mg/l iaa的改良怀特培养基)中。
121.2.光照下培养1-2周，可见根的发生；3-4周可再生成完整小植株。成苗率62.5％。
122.实施例4
123.无菌苗叶片外植体再生成完整小植株
124.1.超净台上，打开无菌苗培养瓶，将无菌苗叶片剪下，接种到3#生根培养基(附加0.5mg/l iaa、30克/升蔗糖、6％琼脂的1/2ms培养基)中。
125.2.全光谱led光照6000-7000勒克斯、12.5小时/天，温度25℃，培养3-4周后，可见部分叶片伤口处培养基中出现根的分化。
126.3.再过2-3周，出现明显的芽。再过3-4周后，长成完整小植株。再生率25.6％。
127.实施例5
128.温室苗培育
129.1.将培养瓶中无菌苗连瓶移入温室培养架上，放置3天；然后打开瓶盖，炼苗2天。
130.2.用自来水将无菌苗根部培养基清洗干净，吸干根部水分，转入温室苗培养介质中。培养介质组成为营养土：赤玉土(中粒)＝8：2。介质使用前用含有多菌灵的水打湿，使其轻握成团。
131.3.全光谱led在光照7000-10000勒克斯、12.5小时/天，温度20℃，培养2-3个月，成活率75％。可移栽到室外适宜条件下生长。
132.实施例6
133.温室苗茎尖再生完整植株
134.1.壮苗后的温室苗，用剪刀剪下约2-3cm茎尖部位，插入预先用4#生根培养基拌湿的基质(蛭石：珍珠岩＝8：2)中。
135.2.于全光谱led在光照(7000-10000勒克斯)12.5小时/天，温度20℃，培养1周，可见明显根的发生，3-4周长成完整温室苗植株。再过4-8周可移栽到室外。温室苗培养过程没2-3天淋一次水，每3-4个周用4#生根培养基淋灌一次。
136.实施例7
137.愈伤组织诱导培养与丛生芽分化、成苗培养
138.1.剪取无菌苗胚轴、叶片、茎尖、根等外植体，接种到附加1mg/l6ba、0.2mg/l naa、30克/升蔗糖、6％琼脂的ms固体培养基中，置于黑暗条件下培养，温度25℃，诱导愈伤组织。
139.2.将成团的大块愈伤组织转接到附加1mg/l 6ba、0.2mg/l naa、30克/升蔗糖、6％琼脂的ms固体培养基中。于25℃、三基色荧光灯光照3000-4000勒克斯、10小时/天的光照条件下，诱导丛生芽的分化。
140.3.将长至2-4厘米的丛生芽切下，接种到2#生根培养基(附加0.5mg/l iaa、30克/升蔗糖、6％琼脂的怀特基本培养基)中，于25℃、三基色荧光灯光照3000-4000勒克斯、10小时/天光照条件下培养1-2周；待叶绿素正常合成后转入全光谱led光照6000-7000勒克斯、12.5小时/天，诱导根的再生。
141.实施例8(种子萌发的无菌苗培养)
142.(1)种子萌发后，分别转接到附加活性炭的ms(1#生根培养基)、msoh、ms和1/2ms固体培养基中，置于温度20℃-27℃，光照条件下培养。
143.(2)培养2个月9天时，取出无菌苗，拍照(见图1)，结果归纳如下：
144.大花红景天无菌苗地上部分和根系在1/2ms培养基中均生长较差，在ms培养中长势一般，在msoh培养基中根系生长发达，在1#生根培养基中长势均衡、最好。
145.实施例9(温室苗茎尖诱导生根再生成完整温室苗)
146.(1)将壮苗后的温室苗枝条茎尖2-4cm部位，用剪刀剪下，分别插入用水(h2o)、附加0.2mg/l iaa的水(h2o+0.2iaa)、附加0.5mg/l iaa的水(h2o+0.5iaa)、1/2ms、附加0.2mg/l iaa的1/2ms(1/2ms+0.2iaa)、附加0.5mg/l iaa的1/2ms(1/2ms+0.5iaa)、怀特基本培养基(wb)、附加0.5mg/l iaa的wb培养基(wb+0.5iaa)(4#生根培养基)拌湿的基质中。
147.(2)置于育苗箱中，于20
±
2℃、光照下培养3周。光照条件为：全光谱led灯光照4000勒克斯，16小时光照/天。培养1周后，通气孔开放1/4，2周后通气孔全部打开.
148.(3)从基质中取出扦插的大花红景天茎尖，拍照(图2)，结果归纳如下：
149.①
在h2o、h2o+0.2iaa、h2o+0.5iaa、1/2ms、wb拌湿的基质中的茎尖均没有生根；1/2ms+0.2iaa中的生根率57.89％；1/2ms+0.5iaa中的生根率50.00％；wb+0.2iaa中的生根率47.62％；4#生根培养基中的生根率61.11％。
150.②
对四种生根率较高的培养基【1/2ms+0.2iaa、1/2ms+0.5iaa、wb+0.2iaa、wb+0.5iaa(4#生根培养基)】中大花红景天地上部分与根的发育情况进行统计，结果如表1所示，可以看出：4#生根培养基中生根的大花红景天小苗，地上部分平均高度为3.22
±
0.55里面，根的长度为4.75
±
1.84，均显著优于其它三种培养基。
151.综合上述结果，可以看出，大花红景天茎尖在4#生根培养基中的生根率最高，且植物根系和整个植株的发育状态均显著优于其它三种培养基，为最优培养基。
152.表1四种生根培养基中大花红景天地上部分和根的发育情况
153.培养基种类地上部分高度(厘米)根长度(厘米)wb+0.5iaa(4#生根培养基)3.22
±
0.554.75
±
1.841/2ms+0.2iaa3.05
±
0.822.50
±
2.02wb+0.2iaa2.68
±
0.602.53
±
1.761/2ms+0.5iaa2.81
±
0.801.84
±
1.35