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一种构树茎段诱导体胚发生的方法与流程

花匠小妙招
2025-01-04 07:20

一种构树茎段诱导体胚发生的方法与流程

本发明属于构树育苗方法技术领域，具体涉及一种构树茎段诱导体胚发生的方法。

背景技术：

构树（broussonetiapapyrifera）为桑科（moreceae）构树属（broussonetia）落叶乔木或灌木，分布于我国除东北北部、西北北部以外的大部分地区。构树适应性极强，是优良的生态绿化树种，同时可作为造纸和加工青储饲料等的原材料，发展前景广阔。

目前，构树种苗繁育的主要依靠传统扦插方式，很难满足市场对构树种苗的需求，限制了其良种的大规模推广。利用植物组织培养方法实现离体器官再生，可较好的解决优良种苗的大规模高效繁殖和商业化生产的问题。特别是通过植物体细胞胚再生途径生产种苗，具有繁殖系数高、遗传稳定等优点，还可为林木分子育种搭建平台。目前，已有学者对构树组织培养技术进行研究，但关于构树细胞胚的研究尚少，仅见张朝晖等以杂交构树叶片为材料，对影响构树体细胞胚发生的因素进行了初步探讨。但是目前以构树无菌苗茎段为材料，建立愈伤组织诱导及体胚发生技术途径尚未见有报道，这是对前人研究从构树叶片获得体胚发生的补充和突破，为构树的良种繁育及进一步遗传改良奠定基础。

技术实现要素：

本发明目的是针对现有技术中构树胚性愈伤组织诱导率低、体胚诱导难的问题，提供一种构树茎段诱导体胚发生的方法，以构树无菌苗茎段为材料，建立愈伤组织诱导及体胚发生技术途径，为构树的良种繁育及进一步遗传改良奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种构树茎段诱导体胚发生的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）外植体制备：取构树植株的嫩梢为材料，经过修剪、消毒洗涤，得到构树茎段；在超净工作台上，去掉茎段上粗壮的幼苗顶端和根部后，将茎段切成0.3~0.5cm作为外植体，每个外植体均不带芽点；

（2）胚性愈伤组织的诱导：将切好的外植体接种于构树胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养15天后更换一次培养基，30天后得到增殖后的愈伤组织；其中，所述的构树胚性愈伤组织诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，并添加浓度为0.05~0.08mg·l-1的tdz、浓度为0.8~1.0mg·l-1的naa、浓度为0.08~0.1mg·l-1的2,4-d、浓度为25~30g·l-1的蔗糖和浓度为6.0~6.5g·l-1的卡拉胶；

（3）体胚的诱导：挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上，进行体胚的诱导，30天后得到构树体细胞胚；其中，所述的体胚诱导培养基以ms培养基为基础培养基，并添加浓度为0.08~0.1mg·l-1的naa、浓度为1.0~1.2mg·l-1的6-ba、浓度为25~30g·l-1的蔗糖和浓度为6.0~6.5g·l-1的卡拉胶。

在上述构树胚性愈伤组织诱导培养基中，ms培养基是较稳定的离子平衡溶液，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长；tdz是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老；naa为萘乙酸，是一种广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大；2,4-d为2,4-二氯苯氧乙酸，是一种生长素类似物，具有较高的活性；卡拉胶是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐，可被酵解成co2、h2、沼气及甲酸、乙酸、丙酸等短链脂肪酸，成为益生菌的能量源；这些组分的组合以及各组分的用量是通过大量试验确定的，上述的组合以及组分的用量使本发明的构树胚性愈伤组织诱导培养基与现有技术相比，tdz是影响构树茎段胚性愈伤组织诱导的主要因素，naa和2,4-d是次要因素，能够显著促进构树茎段诱导胚性愈伤组织，验证了tdz对于构树胚性愈伤组织诱导的重要性。

本发明采用体胚发生的方法进行愈伤组织成苗，由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚，具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，叫做胚状体，也叫体细胞胚或者体胚。相比于不定芽等其他方式，体胚发生的技术具有明显二极性，结构完整，成苗率高；遗传稳定性，无须长期分化；发生数量大，增殖率高。在上述体胚诱导培养基中，ms培养基是较稳定的离子平衡溶液，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长；naa为萘乙酸，是一种广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大；6-ba为6-苄氨基嘌呤，用于促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生；卡拉胶是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐，可被酵解成co2、h2、沼气及甲酸、乙酸、丙酸等短链脂肪酸，成为益生菌的能量源；这些组分的组合以及各组分的用量是通过大量试验确定的，上述的组合以及组分的用量使本发明的体胚诱导培养基与现有技术相比，在体胚诱导过程中同时使用生长素naa和细胞分裂素6-ba，二者配合并经筛选，获得构树体胚发生诱导效果最佳的生长调节剂配比。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

上述的步骤（1）中，构树嫩梢消毒洗涤的具体过程包括：先采用70%浓度的酒精消毒40s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。

上述的步骤（2）中进行诱导培养的条件为温度25±2℃、光照度1500lx、光照时间16h·d-1。

上述的构树胚性愈伤组织诱导培养基的具体配置为：每升ms培养基中，添加0.05mg·l-1tdz、1.0mg·l-1naa、0.1mg·l-12,4-d、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8。

上述的步骤（3）中进行体胚的诱导的条件为温度25±2℃、光照度1500lx、光照时间16h·d-1。

上述的体胚诱导培养基的具体配置为：每升ms培养基中并添加0.1mg·l-1naa、1.0mg·l-16-ba、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8。

本发明的有益效果为：

本发明以构树幼嫩茎段为材料，建立构树胚性愈伤组织诱导和体胚发生技术途径，有效解决了构树胚性愈伤组织诱导率低、体胚诱导难的问题。本发明培养基和培养方法效果好，具有胚性愈伤组织诱导率高、质量高、培养周期相对较短的优点，为构树良种的快速繁殖提供了一种高效途径，对于加速构树优良材料的繁育，缓解社会对构树苗木的紧迫需求具有重要意义；首次成功利用幼嫩茎段诱导胚性愈伤组织和体胚发生，这是对前人研究从构树叶片获得体胚发生的补充和突破；本发明与常规的组织培养方法相比，体细胞胚的发生具有繁殖效率高，为构树良种自动化快速繁殖提供技术基础；同时，将本发明培养基及培养方法应用于构树遗传育种中，胚性愈伤组织具有遗传稳定、再生频率高的特点，可作为多数植物最理想的转化受体系统，可缩短育种周期，为构树遗传改良、分子育种搭建平台。

附图说明

图1本发明实施例1的构树体细胞胚诱导示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的发明内容作进一步地说明。

实施例1

（1）外植体制备：取构树植株的嫩梢为材料进行修剪，然后先采用70%浓度的酒精消毒40s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，得到构树茎段；在超净工作台上，去掉茎段上粗壮的幼苗顶端和根部后，将茎段切成0.3cm作为外植体，每个外植体均不带芽点；

（2）胚性愈伤组织的诱导：将切好的外植体接种于构树胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养15天后更换一次培养基，30天后，形成黄绿色胚性愈伤组织，质地较碎，结构疏松、表面瘤状突起；其中，所述的构树胚性愈伤组织诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中，添加0.05mg·l-1tdz、1.0mg·l-1naa、0.1mg·l-12,4-d、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8；

（3）体胚的诱导：经过2～3个周期继代培养，挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上，进行体胚的诱导；其中，所述的体胚诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中并添加0.1mg·l-1naa、1.0mg·l-16-ba、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8。

参见图1，为构树体细胞胚诱导的示意图；其中，a图和b图为愈伤诱导的示意图，c图为胚性细胞示意图，从c图标记的地方可以明显看出在诱导30天后，得到了绿色球状胚，d图中也可以看出形成了子叶胚的形状，因此验证了利用该技术途径进行构树茎段诱导体胚发生的可行性。

实施例2

（1）外植体制备：取构树植株的嫩梢为材料进行修剪，然后先采用70%浓度的酒精消毒40s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，得到构树茎段；在超净工作台上，去掉茎段上粗壮的幼苗顶端和根部后，将茎段切成0.4cm作为外植体，每个外植体均不带芽点；

（2）胚性愈伤组织的诱导：将切好的外植体接种于构树胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养15天后更换一次培养基，30天后，形成黄绿色胚性愈伤组织，质地较碎，结构疏松、表面瘤状突起；其中，所述的构树胚性愈伤组织诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中，添加0.05mg·l-1tdz、0.8mg·l-1naa、0.08mg·l-12,4-d、25g·l-1蔗糖和6.0g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8；

（3）体胚的诱导：经过2～3个周期继代培养，挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上，进行体胚的诱导，30天后得到绿色球状胚，验证了利用该技术途径进行构树茎段诱导体胚发生的可行性；其中，所述的体胚诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中并添加0.08mg·l-1naa、1.0mg·l-16-ba、25g·l-1蔗糖和6.0g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8。

实施例3

（1）外植体制备：取构树植株的嫩梢为材料进行修剪，然后先采用70%浓度的酒精消毒40s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，得到构树茎段；在超净工作台上，去掉茎段上粗壮的幼苗顶端和根部后，将茎段切成0.5cm作为外植体，每个外植体均不带芽点；

（2）胚性愈伤组织的诱导：将切好的外植体接种于构树胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养15天后更换一次培养基，30天后，形成黄绿色胚性愈伤组织，质地较碎，结构疏松、表面瘤状突起；其中，所述的构树胚性愈伤组织诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中，添加0.08mg·l-1tdz、1.0mg·l-1naa、0.1mg·l-12,4-d、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8；

（3）体胚的诱导：经过2～3个周期继代培养，挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上，进行体胚的诱导，30天后得到绿色球状胚，验证了利用该技术途径进行构树茎段诱导体胚发生的可行性；其中，所述的体胚诱导培养基配置方法为：每升ms培养基中并添加0.1mg·l-1naa、1.2mg·l-16-ba、30g·l-1蔗糖和6.5g·l-1卡拉胶，并在121℃的温度下灭菌20min，控制ph值为5.8。

对比例1

采用与实施例1相同外植体制备方法和培养条件，与实施例1的不同之处在于，采用的构树胚性愈伤组织诱导培养基为传统的ms培养基，但未添加植物生长调节剂，将构树无菌苗茎段接种到愈伤诱导培养基14d后开始形成愈伤组织，培养30天后，可见大部分愈伤组织为白色，透明、水渍状、结构疏松，镜检发现其细胞大、形态不规则，核小且偏向一侧，为非胚性愈伤组织。且采用单纯的ms培养基的方式进行体胚诱导，最终培养后未见绿色球状胚。

综上，通过实施例1和对比例1的结果可以说明，采用本发明的构树胚性愈伤组织诱导培养基以及体胚诱导培养基，并结合体胚发生的技术可以实现胚性愈伤组织诱导率高、质量高、培养周期相对较短的优点，为构树良种的快速繁殖提供了一种高效途径。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。