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一种葛藤组织培养外植体消毒的方法

花匠小妙招
2025-01-04 07:23

一种葛藤组织培养外植体消毒的方法

1.本发明涉及葛藤栽培育苗技术领域，具体涉及一种葛藤组织培养外植体消毒的方法。

背景技术：

2.葛藤(pueraria lobata(willd.)ohwi.)又名野葛、葛条、粉葛等，属豆科蝶形花亚科葛属多年生落叶草质藤本，全世界约25个种，我国有17个种(含2个变种)。葛藤因具有耐寒抗旱、耐贫瘠、对土壤要求不高、固土能力强、可快速繁殖、景观效果优良等特性，在生态修复中越来越受到重视。
3.目前，葛藤常用于边坡修复、荒漠化治理等领域，是一种优良的水土保持植物。但目前葛藤苗木紧缺、存量较少，严重影响资源开发与利用。在传统的栽培繁殖技术中，种子繁殖因自然繁殖收种困难难以实现；扦插繁殖和压条繁殖受季节、气候等因素制约，且扦插繁殖成活率低，难以实现批量生产，连年繁殖也易导致植株种质品质下降，限制了优良品种的推广和产业健康发展。因此，利用组织培养进行葛藤的快速繁育、缩短苗木繁殖的周期，解决葛藤苗木资源紧缺的问题十分重要。现有的葛藤植物组织培养技术污染率较高，外植体成活率难以保证，且生长速度慢，生长周期长，导致生产效率不高，生产实践应用较为困难。建立无菌体系是葛藤组织培养的第一步，也是葛藤批量生产最关键的环节，目前采用的常规消毒灭菌方法无法保证葛藤外植体的成活率，影响组织培养进程。针对这些问题，本发明开发了一种提高葛藤外植体消毒效果的方法，其成活率最高可达68.89％，可为葛藤组织培养无菌体系的建立提供技术基础。本发明简单易行，方便实施。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种污染率小、成活率高、外植体繁殖迅速的葛藤外植体消毒方案。
5.本发明提供的一种葛藤组织培养外植体消毒的方法，包括以下步骤：
6.(1)葛藤外植体材料选择：从长势良好、无病虫害的葛藤植株上选取芽点饱满、一年生的幼嫩枝条和成熟叶片作为外植体材料，冷藏处理备用；
7.(2)葛藤外植体处理：以叶片和茎段作为外植体，经清洗或毛刷轻刷后，转移至超净工作台进行消毒处理；
8.(3)葛藤外植体消毒：将外植体先用酒精进行处理，再用hgcl2进行消毒，无菌水冲洗5次后，接种于初代培养基，于第7天(“天”简写为“d”)分别观察统计污染率和成活率；
9.(4)葛藤外植体培养条件：初代培养在经过消毒的培养室内完成，培养室温度为25
±
2℃，光照时长为14h
·
d-1
，光照强度为4000lux。
10.所述外植体清洗处理方法为：将外植体于含洗洁精或洗衣服的自来水中浸泡15min-30min，除去外植体表面污垢，再经流水冲洗冲洗1h-2h，擦干水分后转至超净工作台准备消毒。
11.所述茎段为葛藤枝条上带芽茎段，裁剪为1cm-2cm。
12.所述外植体清洗处理方法为：外植体不清洗，用干燥且干净的软毛刷轻刷，刷去外植体表面绒毛及污垢，准备消毒。
13.所述酒精处理方法为：用75wt％的酒精处理20s-120s。
14.所述hgcl2处理方法为：用0.1wt％的hgcl2处理4min-12min，且使用hgcl2消毒时在hgcl2中加入3-5滴吐温。
14.所述初代培养基为：ms培养基+3.0％蔗糖+0.55％琼脂+1.0mg/l6-苄氨基嘌呤+0.1mg/l萘乙酸，ph5.8-6.0。
15.与现有技术相比，本发明的方法具有以下有益效果：
16.本发明以葛藤外植体为材料，提供一种葛藤组织培养外植体消毒的有效方法。与常规的外植体消毒方法相比，本发明通过对比各处理阶段不同处理对不同部位葛藤外植体消毒效果的影响，探索获取较好消毒效果以及较高无菌率的方法，打破了葛藤外植体获取无菌材料的局限。通过此方法可获得较高的无菌材料，为批量化育苗提供理论基础。
17.利用本发明的消毒方法对葛藤外植体进行消毒后，外植体的成活率显著提高，可达到68.89％，本发明效果显著，简单易行，可为葛藤批量化生产提供技术支持。
附图说明
18.图1是本发明葛藤叶片切块初代培养生长图
19.图2是本发明葛藤茎段切块初代培养生长图
20.图3是本发明葛藤茎尖切块初代培养生长图
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，这些描述并不是对本发明内容作进一步限定。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
22.实施例1
23.一种葛藤组织培养外植体消毒的方法，包括以下步骤：
24.1.外植体材料的选择
25.从当地生健壮、无病虫害、长势良好的葛藤母株上摘取成熟健康叶片作为外植体材料，带回组培室低温保湿存储。
26.2.试验方法
27.将叶片裁剪为1cm
×
1cm大小，放入含洗洁精的清水中浸泡15-30min，之后流水冲洗1h。叶片的消毒先用75％的酒精处理30s、60s、90s和120s四个梯度，再用0.1％的hgcl2消毒6、8和10min(按表1中的处理方法进行分组处理)，无菌水冲洗5次后接种于初代培养基进行初代培养。每个消毒处理接种20-22块叶片，共接种248块叶片。比较不同消毒时间的灭菌效果，7d后统计污染率和成活率。培养室温度为25
±
2℃，光照时间14h
·
d-1
，光照强度4000lux。
28.3.试验结果
29.从表1中可以看出，叶片作为外植体消毒采用75％的酒精和0.1％hgcl2组合处理，
随着消毒时间的延长，污染率有所降低，但酒精和hgcl2消毒时间太长易导致叶片褐化死亡情况加剧。75％酒精灭菌时间为60s时。污染和褐化情况最轻。0.1％hgcl2灭菌时间为8min和10min时，处理3、5、6、8、12均有成活叶片，但灭菌时间10min时易导致叶片褐化死亡。使用75％的酒精消毒90s、0.1wt％hgcl2消毒8min，75％的酒精消毒120s、0.1t％hgcl2消毒10min污染率为86.36％和80％，成活率是13.64％和10％，这两个处理污染率低于其他处理，成活率也高于其他处理，且这两个处理间无显著差异。但此种处理和消毒方式叶片成活率均低于20％，污染情况严重。
30.表1不同灭菌处理对叶片灭菌效果的影响理对叶片灭菌效果的影响
31.实施例2
32.一种葛藤组织培养外植体消毒的方法，包括以下步骤：
33.1.外植体材料的选择
34.从当地生健壮、无病虫害、长势良好的葛藤母株上摘取成熟健康叶片作为外植体材料，带回组培室低温保湿存储。
35.2.试验方法
36.将叶片裁剪为1cm
×
1cm大小，用干燥毛刷轻刷取表面尘土后，转移至超净工作台上。叶片的消毒先用75％的酒精处理30s、60s、90s三个梯度，再用0.1％的hgcl2消毒4、6、8和10min(按表2中的处理方法进行分组处理)，无菌水冲洗5次后接种于初代培养基进行初代培养。初代培养条件与实施例1相同，每组处理接种20块叶片，共接种240块叶片。
37.3.试验结果
38.从表2中可以看出，叶片作为外植体消毒采用75％的酒精和0.1％hgcl2组合处理，随着消毒时间的延长，外植体成活率呈现先上升后下降的趋势。75％酒精处理时间为60s是叶片成活情况最佳，其次为30s。0.1％hgcl2灭菌时间为8min和10min时，叶片成活率高于其他组。使用75％的酒精消毒60s、0.1wt％hgcl2消毒10min，污染率为50％，成活率是40％，成活率显著高于其他组。其余各组成活率均位于20％左右，无较大差别，但对比实施例1，成活率显著提高，说明不经流水冲洗的叶片成活率显著高于流水冲洗叶片。
39.表2不同灭菌处理对叶片灭菌效果的影响表2不同灭菌处理对叶片灭菌效果的影响
40.图1为实施例1、2叶片初代培养生长状况图，a为实施例1中叶片生长图，b、c为实施
例2中叶片生长图。
41.实施例3
42.一种葛藤组织培养外植体消毒的方法，包括以下步骤：
43.1.外植体材料的选择
44.从当地生健壮、无病虫害、长势良好的葛藤母株上选取一年生幼嫩枝条，带回组培室低温保湿存储。待使用时选取芽点饱满、无外伤的幼嫩茎段，裁剪为1-2cm大小。
45.2.试验方法
46.用干燥毛刷轻刷取出茎段表面绒毛和灰层，转移至超净工作台上。茎段的消毒先用75％的酒精处理30s、90s两个梯度，再用0.1％的hgcl2消毒、6、8、10和12min(按表3中的处理方法进行分组处理)，无菌水冲洗5次后，切取茎尖或将茎段接种于初代培养基进行初代培养。本试验培养条件与实施例1相同，茎段共接种117个，茎尖共接种99块。
47.3.试验结果
48.从表3中可以看出，以茎段作为外植体消毒采用75％的酒精和0.1％hgcl2组合处理，酒精处理时间为30s时茎段污染较严重，成活率普遍较低，酒精处理时间为90s时各组茎段的成活率要明显高于30s。随着0.1％hgcl2处理时间的增加，其污染率呈现先减小后增加的趋势，75％酒精处理90s、0.1％hgcl2处理8min时，污染率最低为45.45％，成活率最高为54.55％。且酒精处理时间增加时，褐化死亡情况也相应减少。
49.本试验接种茎尖的灭菌方案为75％酒精处理90s、0.1％hgcl2处理8min和75％酒精处理90s、0.1％hgcl2处理10min，从表3结果可知，茎尖的成活率为50％左右或高于50％，其中酒精处理90s、hgcl2处理10min是茎尖污染率可降至31.11％，成活率可达68.89％。试验结果表明，茎尖和茎段的灭菌效果显著优于叶片，其中，酒精处理90s、hgcl2处理8min的茎段以及茎尖的灭菌效果最佳，成活率可达或高于50％。因此茎段和茎尖可作为葛藤组织培养的外植体，茎段消毒方法可选择酒精处理90s、hgcl2处理8min，茎尖消毒方法可选择酒精处理90s、hgcl2处理10min。
50.表3不同灭菌处理对茎段和茎尖灭菌效果的影响
51.图2为葛藤初代培养茎段生长状况图，其中a为75％酒精90s+0.1％hgcl28min，b为75％酒精90s+0.1％hgcl210min，c为75％酒精90s+0.1％hgcl212min；图3为葛藤初代培养茎尖生长图。
52.根据上述分析，葛藤外植体的选择以及最佳的消毒处理方法为：外植体选择带饱满芽点的幼嫩茎段以及消毒后由茎段切取的茎尖；外植体的处理方法选择先采用干燥且干净的毛刷轻刷、再用75％的酒精处理90s、之后茎段选用0.1％的hgcl2消毒8min、茎尖选用0.1％的hgcl2消毒10min，最后经无菌水冲洗5次。
53.上述实施方式仅示例性说明本发明的原理及其效果，而非用于限制本发明。对于熟悉此技术的人均可在不违背本发明的范畴内对上述实施例进行修饰或改进，但在未脱离本发明技术思想的一切类似成果及改进，仍应由本发明的权利要求所涵盖。