重要根结线虫等温扩增芯片检测体系的建立
重要根结线虫等温扩增芯片检测体系的建立
【摘要】：根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中分布最广、危害最严重的类群之一,几乎能侵染绝大部分高等植物。在我国,根结线虫(非中国种)已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》,建立快速有效的检测方法对于防止外来物种进入我国有重要意义。本研究以山茶根结线虫(M.camelliae)、苹果根结线虫(M.mali)、北方根结线虫(M.hapla)、象耳豆根结线虫(M.enterolobii)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(Mjavanica)、南方根结线虫(M.incongnita)为研究对象,建立了7种重要根结线虫微流体芯片检测体系。首先以山茶根结线虫和苹果根结线虫核糖体DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和横向流动试纸条(1ateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了两种LAMP-LFD新技术,分别可于15 min和35 min内特异性地检出目标种。其针对山茶根结线虫和苹果根结线虫基因组DNA的灵敏度分别可达4 pg/μL和1pg/μL,针对单条线虫的灵敏度皆为1/1000条2龄幼虫基因组DNA。参考以上两个种的LAMP反应体系及条件,结合已经公布的象耳豆根结线虫检测体系,确立了LAMP反应的统一体系和反应条件,据此筛选北方根结线虫、花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫的最佳引物组合。继而将LAMP技术与微流体芯片技术相结合,建立了可同时检测山茶根结线虫等7种根结线虫的等温扩增微流体芯片检测技术。利用该技术只需一次加样,即可在1 h内完成7个指标的同步检测及结果判读,其针对目标种基因组DNA的检测灵敏度可达0.18～18.2pg/μL,针对单条2龄幼虫的检测灵敏度为1/100～1/5条根结线虫的基因组DNA。实际样本检测结果表明,与传统的形态学检测相比,该方法的临床灵敏度及特异性分别为93.75%和94.74%。本研究建立的重要根结线虫等温扩增碟式芯片检测体系对样本和试剂消耗少,操作简单,可实时同步检测7个病原指标,因此有望在各个基层的检验检疫机构中普及使用。
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