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一种基于液体培养基的白芨种苗生产方法

花匠小妙招
2025-01-10 10:41

一种基于液体培养基的白芨种苗生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材种植技术领域，特别是一种基于液体培养基的白芨种苗生产方法。
【背景技术】
[0002]白芨为兰科白芨属的多年生宿根草本植物，是国家重点保护野生植物。白芨花大色艳，具有较高的观赏价值；同时白芨有肥厚肉质的块状假鳞茎，是重要的中药材之一。
[0003]自然野生状态下，成熟的白芨种子呈粉末状，非常细小，在显微镜下多呈纺锤形，长约1.2mm，宽约0.2mm。其种子的结构十分简单，由一层透明的种皮和一个种胚组成。种皮为单层细胞组成，细胞器及原生质均已消失，是一层半透明的死细胞；胚在外形上尚处于未分化状态，为原胚阶段，胚柄退化，无胚乳。开花授粉15周后的种子有胚率仅为59%左右，极少萌发成苗。由于上述原因，白芨种子自然萌发率极低，繁殖困难，加之人们长期掠夺式的采挖导致其野生资源频临枯竭，因此现有的白芨资源无法满足市场的极大需求。
[0004]人工繁育是目前提高白芨产量的有力措施，现有的繁育方法大多以分株为主，SP将块茎切成小块种植，但繁殖系数低，消耗量大，大面积供种依然较为困难，难以满足大规模生产的需要。
[0005]包括白芨在内的兰科植物，通过无菌播种与组织培养的方式，可以在短时间内获得大量的实生苗，不失为一种快速有效的繁殖方法。现有技术主要通过将种子撒播在添加激素的固体培养基上萌发，再生无菌苗，或诱导原球茎、经增殖生根后进行快繁。这些方法大多涉及4-5种以上的培养基，操作较为繁琐，而且周期较长，最短在110天内方能成苗移栽，因此相对生产成本较高。
[0006]在白芨的组织快繁技术中，激素的种类及配比十分关键，直接影响着种子的萌发率、原球茎的诱导率以及生长速度。现有方法中用于种子萌发的培养基为添加包括细胞分裂素类6-BA、KT以及生长素类NAA、2，4-D等的固体培养基，萌发率在50% -95%不等，种子萌发周期较长一般在30-45天左右，且种子萌发率受种子种龄影响大，近成熟的种子(一般20周龄后)萌发率高，15-20周龄前的种子萌发率极低或不萌发。TDZ (噻苯隆)是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，它的活性要比一般细胞分裂素类高几十倍至几百倍。基于TDZ高效的促细胞分裂活性，在白芨的组培快繁中，有研究者将TDZ用于原球茎的增殖并获得良好效果，却未见将其用于种子萌发的报道。TDZ相对BA等常见激素略贵，用于增殖使用量大，时间长，增加成本。

【发明内容】

[0007]本发明要解决的技术问题是为快速获得白芨幼苗提供一种新方法。
[0008]本发明的技术方案是一种基于液体培养基的白芨种苗生产方法，包括如下步骤:
[0009]a、灭菌:将开花授粉15?20周龄的白芨蒴果用自来水流水冲洗30min以上，进行表面灭菌，然后剥开，对种子进行消毒；
[0010]b、萌发:消毒后的种子置于MS+0.5?2.0mg/L TDZ+30g/L白砂糖、pH5.8的液体培养基中，23?27°C，90?120rpm黑暗培养5天后，转入光照16h/暗培养8h的光周期下震荡培养15?20天，种子萌发；
[0011]C、生长成芽:将已萌发的种子接种于MS+0.1?0.5mg/L 6_BA(6_苄氨基腺嘌呤)+30g/L白砂糖+6g/L琼脂、pH5.8的固体培养基上，25 °C，16/8h光周期培养；培养20?30天，即得到幼苗；
[0012]d、生根培养:幼苗接种到1/2MS+0.1?1.0mg/L NAA (萘乙酸)+30g/L白砂糖+0.5?2g/L活性炭(活性炭有利于避免褐化)+6g/L琼脂、pH5.8的培养基上，25°C，16/8h光周期培养；30?40天天后得到成苗，
[0013]e、将成苗进行炼苗，移栽。
[0014]具体的，步骤a中白芨蒴果表面灭菌采用75%乙醇进行表面消毒30s，无菌水冲洗I?2次。
[0015]具体的，步骤a中对种子进行消毒的操作如下:将种子抖落到无菌容器中，加5%次氯酸钠溶液适完全浸泡种子20分钟；用灭菌的50目细胞筛过滤种子；再用无菌水冲洗、过滤，反复4?6次，冲去表面残留的消毒液；细胞筛过滤，得到消毒后的种子。
[0016]优选的，所述的次氯酸钠溶液中滴加I?2滴吐温20。
[0017]具体的，步骤b培养基中添加1.0mg/LTDZ。
[0018]具体的，步骤b中25°C、10rpm暗培养。
[0019]具体的，步骤c培养基中添加0.2mg/L 6-BA。
[0020]具体的，步骤d中培养基中添加0.1?0.5mg/L NAA和2g/L活性炭。
[0021]具体的，步骤e所述炼苗的操作如下:当幼苗的根生长到3?5cm长时，逐渐揭开瓶盖适应3?5天。
[0022]具体的，步骤e所述移栽的操作如下:将炼苗后的成苗，用清水洗净根部琼脂，移栽到添加基质的穴盘中，基质浇透水，弱光培养，保持基质湿润。
[0023]本发明将TDZ应用到白芨的萌发中，同时还选用液体悬浮培养萌发种子，而不是常用的固体培养基表面萌发。白芨种子萌发率极低，对种子成熟度周龄依赖强，一般22周龄前种子未见有萌发报道，萌发时间长一般需要至少一个月。生长周期长，到移栽一般需要半年以上。本发明采用不同的激素组合，特别是TDZ用于萌发种子(一般用于诱导愈伤和诱导芽)，用液体培养基发种子，有效的提高了萌发率、缩短了成苗时间。
[0024]本发明的有益效果:采用开花后15周至20周近成熟的白芨种子进行液体悬浮培养，能显著提高种子萌发率达99%，加快原球茎的生成速度至15天左右(显著效果，关键技术)。该方法操作简便，成本低廉，每瓶液体培养基可萌发数万粒种子，且种子萌发整齐，出苗一致，污染率低；结合简化的固体培养基培养，大大缩短白芨组培周期，最快能在75-90天内获得大量健壮的无菌苗用于移栽；经过诱导丛生芽及增殖培养，能在30-45天内增殖8-10倍；经本方法得到的组培苗原球茎粗大，生根率100%，移栽存活率高达99%。本发明最终实现了白芨组培苗的高效快速生产，并有效简化操作程序，降低生产成本，便于进行规模化生产。
【附图说明】
[0025]图1为液体培养基中萌发的白芨种子(A:种子接种后5天:种子接种后10天；C:种子接种后15天。)
[0026]图2为固体培养基中生长的白芨幼苗(A:种子接种后20天(转接到固体培养基上5天):种子接种后30天(转接到固体培养基上15天)；C:种子接种后45天(转接到固体培养基上30天)；D:转接到固体培养基30天的白芨群体生长情况。)
[0027]图3为生根培养基中生长的白芨苗(A:种子接种后第55天(转接生根培养基10天);B:种子接种后第75天(转接生根培养基30天)；C:转接生根培养基30天的白芨群体生长情况。)
[0028]图4为移栽及定植的白芨组培苗(A:种子接种后第90天(移栽当天)种子接种后弟100天(移栽后10天)；C:种子接种后105天(移栽后15天)；D:种子接种后120天(定植当天)。)
[0029]图5为增殖培养的白芨苗(A:幼苗接种到增殖培养基当天；B:幼苗在增殖培养基上培养30天后。)
【具体实施方式】
[0030]实施例1未成熟白发培养
[0031]1、种子表面灭菌及萌发
[0032]选取开花授粉15周后，未开裂白芨蒴果(含种子)在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30s，无菌水冲洗1-2次。用解剖刀及镊子小心剥开果实，将种子小心的抖落到无菌组培瓶中，加适量5%次氯酸钠溶液(滴加1-2滴吐温20)消毒20分钟。用灭菌的50目细胞筛过滤种子；再用无菌水冲洗、过滤，反复4-6次，冲去表面残留的消毒液。将细胞筛上过滤的种子，以MS+1.0mg/L TDZ+30g/L白砂糖，pH5.8的液体种子萌发培养基冲洗到三角瓶内。25°C，100rpm，黑暗培养15-20天。
[0033]约3天后种子即膨大露白，培养5天后，种胚细胞颜色从淡黄色转变为淡绿色，表明已有叶绿体的产生，种子已经萌发(图1-A)。转入16h/8h的光周期下光照培养5天(接种10天)后，可以观察到大部分种子的生长锥从种子的珠孔端一侧突破种皮，呈现圆球形，形成原球茎(图1-B)。接种15天后原球茎顶端分化出叶原基，呈长条形，逐渐发育成叶片(图 ι-c)。
[0034]2、种子生长成芽
[0035]将接种15天，已萌发的种子经50目细胞筛滤去液体，将种子原球茎接种于MS+0.2mg/L6-BA+30g/L白砂糖+6g/L琼脂，pH5.8的固体诱导成芽培养基上，尽量分散幼苗，每皿约100颗。25°C，16/8h光周期培养。
[0036]种子接种20天后(转接到固