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一种白芨快速繁殖成苗的组培方法与流程

花匠小妙招
2024-11-12 11:06

本发明属于药用植物种植领域，具体涉及一种白芨快速繁殖成苗的组培方法。

背景技术：

白芨是兰科属于白芨，又名连及草、甘根、白给、箬兰、朱兰、紫兰、紫蕙、百笠。多年生草本球根植物(块根)，植株高18-60厘米。主要分布在中国、日本以及缅甸北部。主要花期在春季，但依各地气候之不同，晚冬至夏初都可能开花。白芨有广泛的药用价值及园林价值，主要用于收敛止血，消肿生肌。花有紫红、白、蓝、黄和粉等色，可盆栽室内观赏，亦可点缀于较为荫蔽的花台、花境或庭院一角。白芨具有的药理作用如下：止血作用、保护胃粘膜、抗菌、抗真菌作用、抗癌及防癌作用，其白芨药用价值及高。白芨种子细如粉尘，一个蒴果内所含种子达5万·粒之多。由于缺乏胚乳，种子需与真菌共生才能萌发，自然条件下萌发率非常低。白芨自然繁殖力极低，常规繁殖又较困难、成本高，且多年来对白芨的采集量远大于其生长量，野生白芨自然繁殖已濒临绝迹。为发展人工栽培满足市场需求，已成为道地药材产区目前组织快繁研究的重点。

目前关于白芨的组织培养研究已经有相关报道，但是组织培养所需的成本过高和试管成苗周期长的问题是制约白芨产业化大生产的瓶颈。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明从白芨种子培养入手，对白芨组织培养的培养基组分，通过多年的实验摸索发现，能快速繁殖白芨且能够周年生产的组织培养体系，为工厂化育苗提供技术支撑。

其技术方案为：

一种白芨快速繁殖成苗的组培方法，包括以下步骤：

1)白芨种子无菌萌发

采集白芨蒴果种子，依次用酒精和次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子一端切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养14-25天，萌发的种子形成原球茎，保持组培室温度在22-25℃；

2)白芨原球茎的增殖

将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，22-27天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；

3)白芨类原球茎的分化

将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，26-30天，类原球茎分化成小苗；

4)白芨小苗的壮苗

将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-45天，小苗成长为长势良好的白芨大苗；

5)白芨大苗的生根

将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-60天，大苗成长为完整的白芨组培苗。

优选地，所述播种培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、380-420g蔗糖、 74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述增殖培养基：1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、4.2g/L 硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L甘氨酸、 0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、8.6g/L 硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L 钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、5毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述壮苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、 1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述分化苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、15毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、 1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述生根培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、20毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、480-520g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、 2400-2600g土豆或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述培养基的pH值为5.4-5.8，均采用酸碱调节剂调节所述培养基的pH值。

有益效果：

1、本发明提供的白芨快速繁殖成苗的组培方法培育白芨，白芨快速繁殖培养基系列能够明显提高白芨种子的萌发时间，从传统的100天左右的时间直接缩短为14-25天，并且野生种子萌发率高达93-96.2％，白芨组培苗移栽成活率高达98％。

2、对增殖培养基、壮苗培养基、分化培养基以及生根培养基的组分调整，使得生长出来的白芨组培苗健壮，移栽成活率高达98％。

3、本发明对濒危兰科药用植物白芨的种群保护起到很好促进作用以及对名贵中药材的价值实现奠定生物技术基础。生根培养基优选采用香蕉，使用香蕉的生根培养基成苗时间为32-45天，而使用土豆的生根培养基成苗时间为46-60 天。

具体实施方式

实施例1

一种白芨快速繁殖成苗的组培方法，包括以下步骤：

1)白芨种子无菌萌发

采集白芨蒴果种子，依次用酒精和次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子一端切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养14天，萌发的种子形成原球茎，保持组培室温度在22℃；

2)白芨原球茎的增殖

将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，22天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；

3)白芨类原球茎的分化

将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22℃，26天，类原球茎分化成小苗；

4)白芨小苗的壮苗

将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22℃，32天，小苗成长为长势良好的白芨大苗；

5)白芨大苗的生根

将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22℃，32天，大苗成长为完整的白芨组培苗。

优选地，所述播种培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、380g蔗糖、 74g琼脂、34g碳粉、1900g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述增殖培养基：1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、4.2g/L 硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、8.6g/L 硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L 钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、5毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380g蔗糖、74g琼脂、34g碳粉、1900g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述壮苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉、1900g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述分化苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、15毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、380g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉、1900g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述生根培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、20毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、480g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉、2400g土豆或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述培养基的pH值为5.4，均采用酸碱调节剂调节所述培养基的 pH值。

实施例2

一种白芨快速繁殖成苗的组培方法，包括以下步骤：

1)白芨种子无菌萌发

采集白芨蒴果种子，依次用酒精和次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子一端切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养25天，萌发的种子形成原球茎，保持组培室温度在25℃；

2)白芨原球茎的增殖

将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，27天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；

3)白芨类原球茎的分化

将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在25℃，30天，类原球茎分化成小苗；

4)白芨小苗的壮苗

将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在25℃，45天，小苗成长为长势良好的白芨大苗；

5)白芨大苗的生根

将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在25℃，60天，大苗成长为完整的白芨组培苗。

优选地，所述播种培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、420g蔗糖、 78g琼脂、38g碳粉、2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述增殖培养基：1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、4.2g/L 硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L甘氨酸、 0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、8.6g/L 硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L 钼酸钠、8毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、5毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、420g蔗糖、78g琼脂、38g碳粉、2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述壮苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、420g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉、2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述分化苗培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、15毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、15毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、420g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉、2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述生根培养基：由1000毫升19.5g/L硝酸铵、27.0g/L硝酸钾、 4.2g/L硫酸镁与2.7g/L磷酸二氢钾、1000毫升5.4g/L氯化钙、100毫升0.8g/L 甘氨酸、0.03g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇、 100毫升8.56g/L硫酸亚铁与7.86g/L乙二胺四乙酸二钠、20毫升16.9g/L硫酸锰、 8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠、20毫升0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠、10毫升0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠、520g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉、2600g土豆或者香蕉与10升水组成。

优选地，所述培养基的pH值为5.8，均采用酸碱调节剂调节所述培养基的 pH值。