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《食品工业科技》：刺玫果中花色苷提取工艺优化及抗氧化性分析

花匠小妙招
2025-01-11 22:59

刺玫果中花色苷提取工艺优化及抗氧化性分析

——通化师范学院医药学院沈阳药科大学中药学院

周新宇

秦汝兰副教授

研究背景

刺玫果（Rosa davurica Pall.）为蔷薇科蔷薇属植物刺玫的成熟果实，又名蔷薇果、山刺玫果、野刺玫果等。野生资源丰富，主要分布于我国东北、内蒙、山西及河北等省区。刺玫果中含有黄酮、维生素、皂苷、多糖、三萜类等多种活性物质，其中研究较多的为黄酮类化合物，但关于刺玫果中花色苷的研究报道较少。刺玫果果实酸甜可口，营养丰富。据《中国中药大辞典》中记载，刺玫果可用于治疗胃腹胀痛、小儿积食、咳嗽、腹泻及维生素C缺乏症等疾病，并具有明显的抗疲劳、耐缺氧、抗炎及增强免疫等活性。目前，以野生刺玫果为主要原料的食品、保健品和功能性饮料不断出现。

花色苷（anthocyanins）是具有2-苯基苯并毗喃结构的一类糖苷衍生物，其共轭双键在465~560 nm处有最大光吸收，为植物界中广泛分布的一种水溶性色素，普遍存在于植物的花、果实、根、茎、叶中，具有抗氧化、保护心血管、抗肿瘤等多种功能。近年来对于花色苷抗氧化作用的研究较多，如吴映梅等通过体外抗氧化实验得出黑莓中的总花色苷对DPPH自由基和羟自由基具有较强的清除作用。闫亚美等研究发现质量浓度为0.1 mg·mL−1黑加仑花色苷提取液较同质量浓度的抗坏血酸，表现出更强的还原能力和自由基清除能力。何传波等研究紫薯中花色苷抗氧化活性得出总抗氧化能力为101.38 U·mg−1，表明其花色苷抗氧化活性较强。综合文献分析，进一步揭示花色苷为最直接有效、安全的自由基清除剂。此外，随着研究水平的不断提高，人们逐渐发现合成色素对人体健康存在一定的危害，因而从天然植物中寻找花色苷作为食品着色剂引起了人们的广泛关注。

秦汝兰团队以花色苷得率为评价指标，采用Plackett-Burman设计并结合Box-Behnken实验确定刺玫果中花色苷的最佳提取工艺，通过多种体外抗氧化方法评价刺玫果中花色苷的抗氧化活性，为刺玫果资源的开发及后续产品的研制提供理论依据。

1 刺玫果中花色苷最大吸收波长的确定

由图1可知，刺玫果花色苷提取液在532 nm处具有吸收峰。因此确定刺玫果花色苷最大吸收波长为532 nm。

2 提取溶剂的确定

由于花色苷是极性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做为提取溶剂，Bridgers等以甲醇、乙醇、酸化甲醇和酸化乙醇从紫红薯中提取花色苷时发现，酸化甲醇的提取效果最好。Awika等用丙酮和酸化甲醇提取黑高粱花色苷时发现酸化甲醇的提取效果优于丙酮，经过液相分析得出丙酮提取的花色苷分子结构被修饰。由图2可知，4种提取溶剂从刺玫果中提取花色苷后测定的吸光度值基本与文献得出的结论一致，分别为甲醇>乙醇>水>丙酮，尽管很多报道表明甲醇的提取效果最好，但甲醇具有一定的毒性，因此选择乙醇为提取溶剂。并且花色苷在中性或碱性条件下不稳定，通常采用酸化的有机溶剂进行提取。

3 单因素实验结果

3.1 料液比对刺玫果花色苷提取效果分析

由图3可知，随着料液比的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现递增的趋势，当料液比超过1:15时，刺玫果花色苷的提取量呈现递减趋势。一定质量的刺玫果中花色苷提取率是有限的，溶剂体积的增大利于有效成分的溶出，当提取剂用量继续增加时，反而花色苷得率略有降低，表明花色苷已基本从组织中充分溶出，且提取剂过剩，不但会影响超声效果，而且可能会导致花色苷的水解，适当的料液比不仅有利于花色苷的溶出，而且也减少了料溶剂过多造成的试剂浪费，故选择料液比为1:15进行提取。

3.2 溶剂pH对刺玫果花色苷提取效果分析

图4可知，随着pH的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现先升高后降低的趋势，当pH为2时，刺玫果中花色苷的吸光度值最高。分析其原因可能为花色苷属于水溶性多酚类化合物，可溶于水、乙醇等极性溶剂中，且在酸性条件下结构稳定，故本实验在提取刺玫果中花色苷时，加入HCl试剂，以保证花色苷的结构稳定，防止其降解。文献研究表明，花色苷在pH≤3的介质中呈现稳定的红色，随着pH增大，红色减弱，花色苷的结构转变为查耳酮类，稳定性降低。所以试验选用pH为2溶液从刺玫果中提取花色苷。

3.3 超声温度对刺玫果花色苷提取效果分析

由图5可知，随着超声温度的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值逐渐增大，当超声温度为50 ℃时，刺玫果中花苷的吸光度值最大，温度继续上升，刺玫果中花苷的吸光度值反而降低，这可能是由于温度对细胞内花色苷的渗透、扩散和溶解有一定的影响。在低温时，花色苷溶解度较低，分子不易渗透。随温度升高，加速分子运动，使其溶解度增大，加快分子从细胞层之间的转移，有助于花色苷的提取，但花色苷耐热性较差，在高温环境和超声波的空化作用下，花色苷类物质会发生结构改变，导致提取量降低，吸光度值减小。因此，实验从刺玫果中超声提取花色苷时温度确定为50 ℃。

3.4 不同体积分数乙醇溶液对刺玫果花色苷提取效果分析

通过图6得出，随着乙醇体积分数的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值逐渐增大，当乙醇浓度为60%时吸光度值最高。花色苷是由苷元和糖基组成的，当乙醇体积分数过高时会导致花色苷中糖苷的溶解度降低，使得花色苷提取率随之减少，故实验乙醇体积分数确定为60%。

3.5 超声时间对刺玫果花色苷提取效果分析

从图7可知，随着超声时间的延长，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现急剧上升趋势，当超声时间为30 min时，刺玫果中花色苷的吸光度值最高，之后基本呈现平稳状态，这是因为花色苷在固液之间基本达到了平衡。因此，实验确定超声提取时间为30 min。

3.6 超声次数对刺玫果花色苷提取效果分析

图8所示，当超声提取为2次时，刺玫果中花色苷的吸光度值最大，随着超声次数增加，吸光度值基本保持不变，说明提取2次可以把花色苷全部提取出来，为提高实验效率，故本实验从刺玫果中提取花色苷超声次数确定为2次。

4 Placket-Burman试验结果分析

通过Design-Expert8.0.6软件对表3中的实验数据进行多元回归分析，经影响因素筛选，得到以吸光度值为响应值的线性回归方程Y=0.36+0.014X1+0.041X2+0.084X3+0.050X4+0.041X5+0.019X6，模型P=0.0010（P<0.01），具有统计学意义，说明该模型在研究区域拟合性良好，所得回归方程显著。一般情况下决定系数R2越高，说明实验的可信度和精确度越高，实验得到的R2=97.21%，表明回归模型与数据吻合较好。各因素效应评价结果见表4，从表4中的主效应分析可知，Placket-Burman试验在二水平范围内，超声时间（X2）、乙醇体积分数（X3）、超声温度（X4）、料液比（X5）影响显著（P<0.05），影响响应值的因素顺序依次为乙醇体积分数（P=0.0002）>超声温度（P=0.0023）>超声时间（P=0.0053）=料液比（P=0.0053）>超声次数（X6）（P=0.0826）>溶剂pH（X1）（P=0.1709），由此推断，乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间为影响刺玫果花色苷提取条件的关键因素。

5 Box-Benhnken试验结果分析

5.1 数学模型的建立与显著性实验

在Placket-Burman试验基础上，采用Design-Expert8.0.6软件对表5中的实验数据进行多项拟合回归，得到刺玫果中花色苷吸光度值对超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声温度（C）及料液比（D）4个影响因素的二次多项回归方程：Y=+0.48−0.014A+0.018B+0.028C+0.029D+0.038AB−2.500E−003AC+0.056AD−0.081BC+1.250E−003BD+0.028CD−0.18A2−0.070B2−0.098C2−0.091D2。

回归方程方差显著性分析结果见表6，由表6实验数据可知，模型的F=45.40，P<0.0001，表明实验所用的二次模型是极显著的，具有统计学意义。失拟项P=0.1610（>0.05），表明此响应面模型对试验拟合的情况较好，误差较小；模型拟合的多元决定系数R2=0.9784，表明模型拟合度良好，调整性决定系数R2Adj=0.9569，表明该模型能解释95.69%响应值的变化，则用该模型能代替真实试验点对超声法提取刺玫果中花色苷提取量的分析和预测。从表6各因素的P值可知，回归模型中的B、C、D、AB、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2具有显著性（P<0.05），而A、AC、BD均不显著（P>0.05），表明各因素对刺玫果中花色苷提取量的影响不同，调整不同因素将达到不同提取效果。

5.2 各因素间相互作用响应面分析结果

三维曲面反映每两个影响因素之间的交互作用，曲面越较陡，说明各因素对响应值的影响较为显著，拟合的响应曲面能直观反映各因素之间的交互作用。图9所示为当料液比、超声温度、乙醇体积分数、超声时间中任意两因素固定为0水平时，直观地反映其余两个因素交互作用对花色苷吸光度值的影响。图9中各图可以看出三维曲面较陡，响应值波动较大，表明料液比与超声温度，料液比与超声时间，超声温度与乙醇体积分数，乙醇体积分数与超声时间的之间的交互作用对刺玫果中花色苷吸光度值影响较大，实验结果与方差分析一致。

6 最优工艺条件确定与验证性实验

通过Design-Expert.8.06软件对回归方程进行计算，得到刺玫果花色苷最佳提取工艺条件为：料液比为1:15.9 g·mL−1，超声温度为51.49 ℃，乙醇体积分数为60.88%，超声时间为29.94 min，刺玫果花色苷最大吸光度预测值为0.487，结合实际操作，将提取工艺合理化后，改为：料液比1:15 g·mL−1，超声温度50 ℃，乙醇体积分数60%，超声时间30 min，提取次数2次，溶液pH为2。在此条件下进行3次验证性试验，测定平均吸光度值为0.481±0.019，与预测值接近，说明该工艺准确可行。通过pH示差法计算得出，在最佳工艺条件下，刺玫果中花色苷的提取量为185.033 mg·100g−1。

7 刺玫果中花色苷体外抗氧化活性分析

7.1 刺玫果中花色苷对DPPH·清除能力

DPPH·有单电子，在517 nm波长处，其醇溶液呈紫色。自由基清除剂能使单电子配对，从而使吸光度值降低，颜色褪去，且成定量关系。花色苷分子结构上有多个酚羟基，可以通过自身氧化释放电子，进而清除DPPH等自由基。实验以抗坏血酸（VC）为阳性对照，研究刺玫果中花色苷物质对DPPH·清除能力，由图10可知，刺玫果中花色苷物质和抗坏血酸均具有一定的DPPH·清除能力，但弱于同浓度的VC。刺玫果中花色苷对DPPH·的清除能力在考察浓度1~5 mg·mL−1范围内，抗氧化能力随样品溶液浓度的升高逐渐增强，当样品溶液浓度为5 mg·mL−1，清除率为81.11%。通过SPSS软件计算得出VC和刺玫果花色苷对DPPH·清除能力的IC50值分别为0.270和2.299 mg·mL−1，结果进一步表明刺玫果中花色苷对DPPH·具有一定的清除能力。

7.2 刺玫果中花色苷对超氧阴离子自由基清除能力

超氧阴离子自由基是机体内寿命最长的自由基，在一定条件下可生成羟自由基、过氧化氢、脂质过氧化物及单线态氧等其他活性氧，从而造成机体的氧化损伤。如图11所示，刺玫果中花色苷物质和抗坏血酸均具有一定的超氧阴离子自由基清除能力，且强于同浓度的VC。刺玫果花色苷提取物在实验浓度范围内，对超氧阴离子自由基的抑制作用随质量浓度增加而增强，经SPSS软件计算得刺玫果花色苷提取物和VC溶液的IC50值分别为1.902和2.607 mg·mL−1。由此可见，刺玫果花色苷提取物对超氧阴离子具有较强抗氧化能力。

7.3 刺玫果中花色苷对ABTS+·的清除能力

ABTS在K2S2O8作用下可被氧化成绿色的ABTS+·，在抗氧化物存在时，ABTS+·与之反应变成没有颜色的ABTS，因此ABTS法可用于检测样品的抗氧化能力。图12表明，刺玫果花色苷提取物和VC均具有一定的清除ABTS+·能力，刺玫果花色苷清除ABTS+·能力弱于同浓度时的VC溶液。刺玫果花色苷提取物和VC的IC50值分别为8.993和1.314 mg·mL−1。因此表明，刺玫果花色苷提取物对ABTS+·具有极好的清除能力。

8 结论

本文通过单因素实验及Placket-Burman设计对影响刺玫果花色苷提取的因素进行筛选，并结合Box-Benhnken实验设计及响应面分析法对参数进行优化，确定刺玫果中花色苷最佳提取条件为：采用HCl调节溶液pH为2的60%乙醇作为提取溶剂，料液比1:15 g·mL−1，超声温度为50 ℃，超声时间30 min，提取2次，在此工艺条件下得出刺玫果中花色苷得率为185.033 mg·100g−1。实验条件稳定，操作简单，可作为从刺玫果中提取花色苷的工艺方法。此外，体外抗氧化能力研究结果表明，刺玫果中花色苷对DPPH·、超氧阴离子自由基、ABTS+·均表现出较强的清除能力，IC50值均小于10 mg·mL−1，提示刺玫果中花色苷物质具有一定的抗氧化能力。实验结果为刺玫果资源的开发利用及后续抗氧化产品的研发提供了一定的参考依据。