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独活提取物抑制柑桔病原真菌活性成分的分离与鉴定投稿20111116.doc

花匠小妙招
2024-09-17 01:43

独活提取物抑制柑桔病原真菌活性成分的分离与鉴定李敏敏12，胡军华1,，贺磊1，2，姚廷山1，冉春1，李鸿筠1，刘浩强1（1西南大学柑桔研究所，2西南大学园艺园林学院；重庆,400712）摘要采用生长速率法、溶剂萃取、硅胶柱层析、气相色谱质谱联用（GCMS）等方法研究独活乙醇提取物对3种柑桔贮藏病害病原真菌的抑菌作用，并分离和鉴定其抑菌活性成分。结果表明，独活乙醇提取物对3种柑桔病原真菌均有很好的抑制效果，对柑桔炭疽菌的抑制效果最佳。GCMS鉴定B2组分中含有4种香豆素类化合物异佛手柑内酯、牛防风素、茴芹内酯、异茴芹内酯。异佛手柑内酯、茴芹内酯、异茴芹内酯三种化合物对柑桔炭疽菌的EC50均在4050UG/ML之间，其中茴芹内酯的抑制活性最好，其EC50为415216UG/ML。光学显微镜下观察发现，茴芹内酯处理会导致病原菌菌丝体分支增多，菌丝畸形等变化。关键词独活；抑菌活性；分离鉴定ISOLATIONANDIDENTIFICATIONACTIVEINGREDIENTSOFRADIXANGELICAEBISERATAEEXTRACTSAGAINSTCITRUSFUNGUSPATHOGENSLIMINMIN1,2,HUJUNHUA1,,HELEI1,2,YAOTINSHAN1,RANCHUN1,LIHONGJUN1,LIUHAOQIANG11CITRUSRESEARCHINSTITUTE,SOUTHWESTUNIVERSITY2COLLEGEOFHORTICULTUREANDLANDSCAPEARCHITECTURE,SOUTHWESTUNIVERSITYCHONGQING,400712,CHINAABSTRACTTHEANTIFUNGALACTIVITYOFETHANOLEXTRACTANDACTIVEINGREDIENTSOFRADIXANGELICAEBISERATAEWERESTUDIEDBYUSINGMYCELIALGROWTH,SOLVENTEXTRACTION,COLUMNCHROMATOGRAPHYANDGCMSANALYSISTHERESULTSSHOWEDTHATTHEETHANOLEXTRACTPRESENTSTHEHIGHESTINHIBITORYACTIVITYAGAINSTCOLLETORICHUMGLOEOSPORIOIDESB2ACTIVEINGREDIENTSWEREANALYZEDBYGCMSANDTHERESULTSSHOWEDTHATBIOACTIVECOMPOUNDSOFETHANOLEXTRACTOFRADIXANGELICAEBISERATAEHAS4COMPOUNDSIEISOBERGAPTEN,SPHONDIN,PIMPINELLINANDISOPIMPINELLINANTIFUNGALVIRULENCEOFISOBERGAPTEN,PIMPINELLINANDISOPIMPINELLINWAS4050UG/MLANDTHEEC50OFPIMPINELLIN项目资助国家科技支撑计划（2006BAD22B03B4）；重庆市自然科学基金（CSTC,2008BB1272）作者介绍李敏敏，女，硕士研究生，植物源杀菌剂方向通讯作者胡军华，电话（023）68349005，EMAILDHUJHYAHOOCOMCNWAS415216UG/ML,BESTINTHREECOMPOUNDSPIMPINELLINCOULDINDUCECGLOEOSPORIOIDESTOBECOMEMOREMYCELIUMBRANCHES,DEITYANDSOONKEYWORDSRADIXANGELICAEBISERATAEANTIFUNGALACTIVITYISOLATIONANDIDENTIFICATION柑桔贮藏期间易发生多种病害，最重要的是青霉病和绿霉病，其次是炭疽病、黑腐病、褐色蒂腐病等，常引起果实腐烂，严重影响贮藏及外销，造成重大的经济损失1。生物农药具有无公害、低残留、高安全性、高生物活性及高选择性的特点，逐渐替代合成化学农药成为发展的必然趋势，其中，植物源杀菌剂为生物农药研究热点之一。地球植物资源丰富，其产生的次生代谢产物超过40万种2。种类繁多的植物次生代谢产物是开发植物源杀虫、杀菌剂的物质基础。独活（RADIXANGELICAEBISERATAE）为伞形科植物重齿毛当归（ANGELICAPUBESCENSMAXIMF．BISERRATASHANETYUAN）植物，主要产于湖北、四川及江西等地。独活性微温，味辛、苦，具有镇痛、抗炎、抗癌等生物活性，其主要活性成分为香豆素，挥发油等3,4。范莉等5发现独活挥发油具有良好的抗炎作用和镇痛效果。独活中的异补骨脂素6、东莨菪素7具有抗癌作用。本试验研究了独活提取物对柑桔3种病原真菌的抑菌活性，并进一步分离纯化、鉴定其活性成分，以从中寻找具有开发价值的杀菌剂先导化合物。1材料与方法11供试材料独活购于四川省成都市荷花池中药材市场。9972异佛手柑内酯ISOBERGAPTEN、9950异茴芹内酯ISOPIMPINELLIN购自上海源叶生物科技有限公司。9986茴芹内酯PIMPINELLIN购自上海融合医药科技发展有限公司。12供试病原真菌柑桔青霉菌PENICILLIUMITALICUM、柑桔绿霉菌PENICILLIUMDIGITATUM、柑桔炭疽菌COLLETORICHUMGLOEOSPORIOIDES由西南大学柑桔研究所提供。13试验方法131植物材料预处理将独活根置于60℃烘箱烘干，粉碎后过40目筛（孔径037MM）。所得植物粉用密封袋遮光保存备用。132独活粗提取方法超声波提取称取植物样品20G置入500ML三角瓶中，加入200ML70乙醇，58℃超声提取40MIN，减压抽滤，重复3次。合并三次滤液，高压真空过滤后，58℃旋转蒸发浓缩成膏。称取提取物的重量，用下列公式计算提取率提取率提取物的质量G/样品干重G100133独活乙醇提取物对3种柑桔病原菌的室内毒力测定将待测提取物用少量乙醇溶解，加入适量无菌水配制成一定浓度的供试药液，在9MLPDA培养基中加入1ML药液，配制出02、04、08、16、32MG/ML带药PDA平板培养基。将各病原菌菌饼（直径为6MM）分别接种于平板中央，每皿接1个菌饼，每处理3个重复，同时以加入等体积乙醇至无菌水作为对照。28℃培养72H，采用十字交叉法测定菌落直径。使用DPS软件计算毒力回归方程、有效中浓度EC50及相关系数。134独活乙醇提取物活性成分的分离纯化将独活乙醇提取物用5倍热蒸馏水溶解，分为有机相和水相，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次萃取。将所得有机相中石油醚萃取液A、乙酸乙酯萃取液B和水相中石油醚萃取液C、氯仿萃取液D、乙酸乙酯萃取液E分别减压浓缩，称量后，配制成质量浓度为1MG/ML带药培养基，按133方法对各组分进行抑菌试验，计算抑制率。抑制率（）（对照组平均菌落直径－处理组平均菌落直径）/对照组平均菌落直径100采用硅胶（200300目）柱对有机相中乙酸乙酯萃取部位B进行分离纯化，用石油醚乙酸乙酯梯度洗脱（10、41、21、11、12、14、01），各洗脱液为150