短期镉和铬对牵牛花根际土壤线虫群落的影响
人类工业活动如采矿和制造业产生巨大的环境污染，矿区周围土壤重金属污染严重，其中镉是矿区的典型代表[1]；而因工业废水排放形成的污灌区也成为重金属污染的高危区，其中镉是辽宁省污灌区首要重金属污染物，也是潜在生态风险最大的污染物[2]，怎样高效而安全地处理这些有毒的污染物关系到污染区和污灌区人民健康与非污染区的食品安全。近些年，植物修复成为一种新兴的能减少污染物的环保而经济的方法[3]。牵牛花(Pharhiris nil)是一种有修复功能的植物，它能够吸收土壤中的污染物并把污染物累积在地上部分，能通过收割地上部分来达到移除土壤中污染物的目的。胥九兵等[4]发现在种植牵牛花2个月之后，石油的降解率增加了13%。前人研究表明，在植物的不同部位中根部积累重金属的量比在茎中要多[5]，并且重金属所带来的毒副作用最先影响的是也是根部，这就意味着根部土壤环境和根际植物-微生物的交互作用能够影响重金属的修复过程[6]。但是对于修复植物的研究大多数集中在地上部分，关于植物根际的土壤生物组成和结构的研究很少。土壤线虫是最丰富的土壤无脊椎动物之一，它们占据了土壤食物网中的核心位置[7]。土壤线虫群落能够对土壤进程及土壤环境状况提供有用的信息。近几年土壤线虫已经被广泛的用作重金属污染的指示生物[8]。但是在实验室人为控制条件下，关于不同浓度的重金属对线虫群落影响的研究还很缺乏。本研究利用盆栽实验调查在用牵牛花修复不同浓度镉（Cd）和铬（Cr）90 d后重金属含量的变化及牵牛花根际土壤线虫群落的结构和组成，实验条件可控，排除气候等环境干扰，旨在探究土壤微食物网与周围环境的相互作用关系, 揭示复杂的地下生态过程和生态功能，对土壤修复进程提供有力证据，进而对未来污染土壤治理提供理论支持。本次研究的目的有以下几点：1）评价修复后土壤的环境状况；2）展示土壤线虫对不同程度及不同种类重金属污染的反应；3）为利用土壤线虫来评定植物修复程度提供基本数据。我们推测：短期的修复对重金属降低效果有限，所以剩余的重金属还是能够对土壤线虫群落产生不利的影响，并且影响的程度随不同浓度和线虫不同营养类群、生活策略史的变化而变化。
1. 材料与方法
1.1 供试材料土壤：土壤采集于大连西山国家森林公园，土壤机械组成为13.1% 粘土、50.4% 粉土和 36.5%沙土，采集的土壤过2 mm孔径筛去掉大石块与杂质并充分混匀。
牵牛花：由于牵牛花在常用绿化花卉中，对重金属污染具有较强的耐性[9]，实验选取牵牛花为修复植物。牵牛花种子先种在花土中7 d，待幼苗长出后移入花盆中，每个花盆(直径15 cm，深度12 cm)中移植5颗幼苗，每盆装土600 g，土壤来自于采集的大连西山国家森林公园土壤。牵牛花苗在室温(20±1) ℃下生长3个月。光照强度为5 000 lx，光照时间为每天16 h，每盆花每2 d浇去离子水250 mL。
1.2 盆栽实验设计实验采取对照（CK）、镉和铬3种处理，除对照外，每个处理3种浓度。镉来源Cd(NO3)2· 4H2O，铬来源K2CrO4。每个处理3个重复。不同处理重金属添加浓度，见表1。
处理添加浓度/mg·kg−1 CK000Cd5 （Cd-5）20 （Cd-20）50 （Cd-50）Cr20 （Cr-20）50 （Cr-50）100 （Cr-100）| Show Table
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利用浅盘法[10]对土壤线虫进行分离和提取（每100 g鲜土）。提取出的线虫在60 ℃水浴下杀死，计数并保存在4%的福尔马林水溶液中。每个样品随机选取100条线虫进行鉴定，属的鉴定参考BONGERS（1988）分类图鉴[11]。
1.3.2 分析方法每个样品的土壤含水率用重量分析法，取10 g鲜土，测量经105 ℃下烘干8 h后的土壤重量减少量（g），（土壤减少量/10）×100%则为土壤含水率。土壤pH用电位法测量，称取10 g 通过1 mm 筛孔风干土样置25 mL 烧杯中，加蒸馏水混匀，静置30 min，用校正过的pH 计测定悬液的pH值。土壤有机质用中华人民共和国农业行业标准-土壤检测第6部分：土壤有机质的测定（NY/T 1121.6—2006）进行测量[12]；总镉用中华人民共和国国家标准-土壤质量 铅、镉的测定-石墨炉原子吸收分光光度法（GB/T 17141-1997）进行测量[13]；总铬用中华人民共和国国家环境保护标准-土壤和沉积物铜、锌、铅、镍、铬的测定-火焰原子吸收分光光度法（HJ 419—2019）进行测量[14]。
1.4 数据处理土壤线虫群落的组成和特征由以下几个方面构成：1）营养类群（食细菌线虫（BF）、食真菌线虫（FF）、植物寄生线虫（PP）和捕食杂食线虫（OP））[15]；2）生活史策略类群(c-p 值范围从1 到5，c-p=1代表生命周期短、繁殖力强的线虫，c-p=5代表生命周期长、繁殖能力弱，主要是捕食杂食的线虫[16])；3）多样性指数（H'）[17]；4）营养类群多样性指数（TD）[18]；5）均匀度指数（J’）；6）瓦斯乐斯卡指数(WI)[19]；7）成熟度指数 （MI）[16]；8）丰富度指数（EI）和结构指数（SI）[20]。
在进行数据统计前线虫数量经过ln (x +1)转换。本研究主要用SPSS18.0和Excel 2010软件进行分析。不同重金属对线虫群落影响的显著性通过单因素方差分析(ANOVA)测得，用差异显著性检验（LSD）来比较不同处理之间的差异性，p<0.05为显著。结构方程模型(structural equation modelling，SEM)用来表示不同重金属处理下土壤食物网的关联构成，直观地反映重金属对土壤生态系统的影响，选择相对拟合指数(CFI)和拟合优度 (GFI)来检测模型拟合程度。
2. 结果与分析
在种植牵牛花90 d后土壤中重金属含量有了一定程度的降低，其中Cd-5的吸收率为17.6%；Cd-20的吸收率为13.9%；Cd-50的吸收率为8.9%，与镉相比，牵牛花对铬的吸收率要更低，分别为14.3% （Cr-20）、7.4%（Cr-50）和7.8（Cr-100）。总体看来，牵牛花对重金属的修复作用在低浓度下更强。除了Cd-50处理之外，在添加重金属后牵牛花根系重量都有所增加，并在Cd-5下达到最大。重金属处理的土壤pH值都降低，分别在镉和铬处理的中间浓度达到最低。土壤有机质在镉和铬处理的中间浓度要高于对照，在其他处理下要低于对照。植物根重、土壤理化性质及重金属含量，见表2。
表 2 植物根重、土壤理化性质及重金属含量
N=3 处理浓度 /mg·kg−1重金属含量/mg·kg−1根重/g·株−1pH有机质/mg·kg−1 CK00.210.023 ± 0.001b6.85 ± 0.25a45.51 ± 1.25abCd54.120.032 ± 0.001a6.60 ± 0.30ab43.76 ± 0.68b2017.220.030 ± 0.001a6.32 ± 0.15b46.93 ± 0.40a5045.560.020 ± 0.002c6.53 ± 0.57ab44.19 ± 0.77bCK01.380.023 ± 0.001b6.85 ± 0.25a45.51 ± 1.25abCr2017.140.025 ± 0.002b6.53 ± 0.42ab43.75 ± 1.38b5046.310.031 ± 0.003a6.29 ± 0.35b47.84 ± 1.14a10092.160.029 ± 0.002ab6.46 ± 0.34ab45.69 ± 0.54ab 注：数值表示为平均值±标准误差； 平均值后不同字母表示差异显著（p<0.05）。| Show Table
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重金属添加显著降低了线虫的数量，在高浓度处理下线虫数量达到最低，显著低于对照和中等浓度处理。线虫H’在重金属处理的下要低于对照，并在Cd-5、Cd-50和Cr-100处理下达到显著水平。线虫TD在Cd-20和Cr-50处理下要显著高于对照及低浓度处理。WI对不同重金属的响应不同，镉处理下WI明显降低，而低浓度的铬增加WI的值。线虫MI在不同处理下并无显著的变化，而SI在重金属处理下呈现上升的趋势。线虫EI在Cd-5和Cd-50处理下显著低于对照，然而在铬添加处理中又显著高于对照。镉处理下线虫数量与生态指数，见表3，铬处理下线虫数量与生态指数，见表4。
在未受污染的对照组中，线虫群落结构呈现食细菌线虫>植物寄生线虫>食真菌线虫>捕食杂食线虫的组成，重金属的加入改变了群落组成。镉添加增加了植物寄生线虫的比例，并且在低浓度下（Cd-5）超过食细菌线虫成为优势营养类群。低浓度铬处理（Cr-20）增加了食细菌线虫的比例，而高浓度的铬降低了食细菌线虫比例增加了植物寄生线虫的比例。无论是在对照还是在污染处理下线虫c-p值为2的类群占据绝大多数，这种现象在镉处理下比较明显，铬处理增加了c-p=1线虫的比例。不同处理下线虫营养类群组成，见表5，不同处理下线虫生活史策略（c-p）类群组成，见表6。
指数CKCd-5Cd-20Cd-50 总数812.78 ± 55.29a151.45 ± 22.82c224.61 ± 32.12b26.49 ± 6.62dJ'0.80 ± 0.05b0.83 ± 0.08b0.84 ± 0.10b0.90 ± 0.12aH’2.00 ± 0.13a1.61 ± 0.08b1.93 ± 0.11a1.75 ± 0.10bTD2.23 ± 0.15b2.47 ± 0.17b2.88 ± 0.14a2.66 ± 0.20abWI2.83 ± 0.24a0.90 ± 0.07c1.56 ± 015b1.75 ± 0.13bMI1.91 ± 0.15b2.46 ± 0.18a2.42 ± 0.21a2.37 ± 0.18aSI51.18 ± 5.37b59.10 ± 5.12a62.77 ± 7.46a62.91 ± 7.70aEI61.58 ± 7.23a34.40 ± 5.73c67.87 ± 5.74a49.95 ± 4.73b 注：数值表示为平均值±标准误差。 平均值后不同字母表示差异显著（p<0.05）。| Show Table
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表 6 不同处理下线虫生活史策略（c-p）类群组成
% CKCd-5Cd-20Cd-50Cr-20Cr-50Cr-100 c-p116.583.5214.288.3336.3622.0041.94c-p273.6180.0271.4274.9954.5470.0045.16c-p32.3912.947.148.330.004.006.46c-p43.403.522.380.006.060.003.23c-p54.010.004.768.333.034.003.23| Show Table
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文章利用结构方程模型（SEM）对不同重金属处理对土壤理化及线虫群落影响程度分别进行了分析。结构方程模型揭示了根重、pH、食细菌线虫和食真菌线虫相对多度、植物寄生线虫相对多度可以分别解释对镉处理和铬处理捕食杂食线虫的67%和47%。镉能够直接影响土壤pH、根重、食细菌及食真菌线虫和捕食杂食线虫，并能通过根重及pH对植物寄生线虫产生影响，还能通过根重、植物寄生线虫、食细菌及食真菌线虫间接对捕食杂食线虫产生影响。铬能直接显著影响土壤pH、根重、食细菌及食真菌线虫和捕食杂食线虫，并能通过pH和根重间接影响植物寄生线虫，还能通过根重、pH、食细菌及食真菌线虫间接对捕食杂食线虫产生影响。镉与铬处理下植物、土壤pH及线虫群落的结构方程模型，见图1。
图 1 镉与铬处理下植物、土壤pH及线虫群落的结构方程模型
注：镉处理：卡方（χ2）= 9.28, df = 4, P = 0.055, CFI = 0.97, GFI = 0.90. 铬处理：卡方（χ2）= 4.61, df = 3, P= 0.100, CFI = 0.99, GFI = 0.90。BF：食细菌线虫；FF：食真菌线虫；PP：植物寄生线虫：OP：捕食杂食线虫。矩形代表观察变量；椭圆代表潜变量；红色箭头代表正向相关，绿色箭头代表负向相关；箭头宽度代表路径系数的大小；实线代表关联显著 (p < 0.05)；虚线代表关联薄弱 (p > 0.05)。
3. 讨论与结论
3.1 植物及土壤理化性质的变化根系是植物最先接触到重金属离子的部位，同时也是吸收重金属的重点场所，中低浓度的重金属刺激了牵牛花根的生长，使得在中低浓度下牵牛花对重金属的吸收效果更佳，而高浓度的重金属抑制了根的生长。JOUTEY et al[21]研究发现经100 mg/kg的铬处理7 d后，芝麻(Sesamum indicum) 根系长度减少了86% 以上。根系受到的抑制直接影响了重金属的修复效果，本次研究中重金属的吸收率在高浓度下达到最低。牵牛花对不同金属的修复效果也不同，对镉的吸收率要高于铬，这可能是因为90 d后铬与土壤组分的结合比镉更紧密[22]。
植物为降低重金属的毒害作用通常会分泌高亲和力的有机酸来与重金属离子结合形成螯合物[23]，从而降低了土壤的pH值，另外以重铬酸钾形式加入的铬也能减小土壤体系的pH。刘云惠等[24]指出pH的降低能增加土壤对六价铬的吸附，同时本研究中偏酸性的土壤环境能抑制镉向土壤微孔中扩散，使更多的镉离子存在于土壤溶液中，这就使得残留在土壤中的重金属仍然对土壤环境有着很强的毒副作用。
3.2 重金属对土壤线虫群落影响SÁNCHEZ-MORENO et al[25]提出重金属能够增加或降低线虫的数量。本次研究重金属显著降低了线虫的数量，这与BAKONYI et al[26]报道的镉对线虫有着轻度的影响不同，产生不同的原因可能是短期且高浓度的污染。镉能对土壤酶活和微生物群落结构产生不利影响[27]，我们推测线虫的数量受到其食物资源退化的抑制。除了数量外，重金属还降低了线虫H’，稀有属的急剧减少和消失是H’值降低的主要原因。J’和TD在镉处理下要高于铬处理，说明与铬相比镉处理下线虫群落更稳定。值得注意的是，在中等浓度下不论是镉还是铬污染线虫的数量和多样性都要高于低浓度和高浓度，产生这种现象的原因可能是土壤pH和有机质的变化。Cd-20下有机质含量达到最大，而土壤有机质会降低镉在土壤中的生物有效性；Cr-50下pH最低，促使高毒性六价铬向低毒性三价铬的转化。WI与食植物线虫密切相关，能够反映土壤健康程度。除Cr-20外其他重金属处理均显著降低了WI值，说明植物寄生线虫比例增加。但是WI在本次研究的条件下还不能准确地指示土壤生态环境健康，这是因为重金属的添加促进了植物根的生长，为植物寄生线虫提供了食物资源。所以用WI反应土壤环境时还要考虑植物的变化情况。
在线虫功能组成方面，MI、SI和EI表现出偏离这些指数初衷的现象。MI和SI值往往在受污染和扰动的环境下降低，而本研究中它们的值在重金属污染下并没有降低,研究结果与MARTINEZ et al[8]的研究结果相似。产生这种现象的原因可能是高c-p值类群的比例在不同处理下相对稳定，并且高c-p值类群的数量稀少。因为MI、SI和EI是通过线虫营养类群和生活史策略类群计算而来，目前的结果表明我们需要关于对营养类群和c-p类群更深入的研究来更好地解释短期高强度污染对线虫群落的影响。
线虫4种营养类群的分布反应了他们食物网的联系，并能帮助研究线虫群落内的营养结构。通过结构方程模型看出捕食杂食线虫与其他营养类群间的关联是在捕食者和被捕食者之间密度制约的关系上建立的[28]。在镉处理下线虫各个营养类群间的连接都很紧密，而铬处理下植物寄生线虫与捕食杂食线虫没有直接联系，表明土壤食物网在镉处理下比铬处理下的紧密。营养级间连接受到多种因素的影响，如物种形态和行为的特性以及环境因素[29]。植物寄生线虫受植物本身的影响可能要强于重金属的影响[30]。晋海军等[31]发现镉浓度低于30 mg/kg时促进植物生长，并且镉与细胞壁中羧基功能团、蛋白质和木质素等结合生成沉淀，这使得植物寄生线虫能够容易刺入根皮。在本研究中植物寄生线虫相对多度在整个镉处理中都要高于对照，这可能是造成镉污染下植物寄生线虫与捕食杂食线虫联系紧密的原因。重金属既可以直接对土壤线虫产生影响也可以通过pH和根间接地影响线虫群落。食细菌和食真菌线虫处于连接环境与捕食杂食线虫的中心位置，它们的变化能通过取食关系影响整个食物网。食细菌线虫是整个实验的优势营养类群，它们被认为是干扰的耐受种[32]，但是食细菌线虫的数量在污染处理中仍有显著的降低，这是因为重金属容易集中在根部，使得根际食细菌线虫生长和繁殖受到抑制，特别是优势属拟丽突属（Acrobeloides）的肠和食管细胞受重金属影响发生不规则的超微变形，阻碍了养分摄入及消化[33]。
线虫c-p类群能有效地检测重金属污染,反应最快适应能力最强的c-p1类群比例在受污染的土壤中特别是铬污染下增加，然而最敏感的c-p值4-5类群比例在重金属处理下不但没有降低反而增高。MARTINEZ et al [8,34]同样发现高c-p值线虫在污染地区数量更多。产生这种现象的原因是人为的混土本身是一种高强度的干扰，使c-p值4-5的线虫数量减少，再加上线虫总数在受污染的土壤中明显降低，使高c-p值线虫比例反而受影响较小。ŠALAMÚN et al[30]也发现捕食杂食线虫的比例在不同重金属污染强度下只有15%的浮动。所以可以推测用c-p值小的线虫类群来指示短期污染要比c-p值高的类群更加准确。众所周知，c-p 3类群比c-p 1-2类群更加敏感，但是c-p 3类群比例在镉处理及Cr-100处理下高于低c-p值类群。KORTHALS et al[35]提出一些低c-p值类群和高c-p值类群有着相同的敏感度，即便是同一科的线虫，不同属之间对干扰的反应也不同。所以，需要对线虫生活史策略值划分及与环境之间的关系进行更深入与细致的研究。
3.3 结论牵牛花能在重金属污染的土壤中存活并对土壤镉和铬有一定的吸附能力。重金属能够直接或间接通过根与土壤pH影响土壤线虫。重金属显著降低了线虫的数量和多样性，但是并没有显着降低高c-p值线虫比例。线虫成熟度指数（MI）、结构指数（SI）和富集指数（EI）并不能很好地指示重金属污染，用线虫数量和多样性来反映土壤重金属污染要比线虫功能指数更加准确。
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