中温淀粉酶的热稳定性及水解活性改良研究
中温淀粉酶的热稳定性及水解活性改良研究
【摘要】： α-淀粉酶是一类水解淀粉α-1,4糖苷键从而将其水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。随着应用需求的增加及生物技术的愈加成熟,提高其稳定性及水解活力具有重要的意义。本论文以目前用于工业生产的来源于Cytophaga sp.和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的淀粉酶基因CamyA和BamyA为材料,成功实现了在枯草芽孢杆菌中的异源表达,通过理性设计有效提高其热稳定性和水解活性,同时通过动力学模拟探究了淀粉酶CamyA热稳定性及水解活力提高的机制。枯草芽孢杆菌表达的淀粉酶CAMYA最适温度为55°C,最适pH为7.0,70°C下处理5 min后剩余酶活为26%,在pH 1.0-6.0条件下不稳定。以可溶性淀粉为底物时,比活为5,550 U·mg~(-1)。对其动力学常数进行了测定,K_m为3.19 mg·mL~(-1),V_(max)为6,534μmol·min~(-1)·mg~(-1)。通过不同性质淀粉酶的序列及结构分析,设计突变体CAMYA-ΔR178/ΔG179和CAMYA-S33A/S34E/V35H。突变体ΔR178/ΔG179在70°C下处理5 min后剩余酶活为70%;80°C处理5 min后,ΔR178/ΔG179和野生型剩余酶活分别为28%和8%。而突变体S33A/S34E/V35H表现更高的催化活性,比活较野生型提高1倍(10,725 U·mg~(-1) vs.5,550 U·mg~(-1)),催化效率提高2.3倍。两者组合后得到S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179,在70°C和80°C下处理5 min后剩余酶活分别为90%和40%,比活为15,594 U·mg~(-1),是野生型的2.8倍。模拟轨迹显示,删除R178和G179这两个氨基酸后Loop区变短,淀粉酶结合Ca~(2+)能力增强,从而热稳定性提高。突变后使得淀粉酶由Ca~(2+)依赖型转变为非Ca~(2+)依赖型,可能由于Ca~(2+)结合力增强后,结合的Ca~(2+)不容易丢失,从而在后面的反应中不需要再额外添加。突变位点S33A/S34E/V35H处于淀粉酶的N端结构域,突变后K_m值明显降低,推测该部分突变使酶与底物亲和能力增强,从而提高催化活力。用15 L发酵罐进行90 h发酵后,组合突变体酶活为355,800 U·mL~(-1),蛋白量为23 mg·mL~(-1)。为验证S33A/S34E/V35H位点突变效果的普适性,我们选取了目前工业广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶BAMYA在同样位点进行突变,设计突变体S61A/D62E/I63H,在芽孢杆菌中进行表达后重组酶的比活为10,744 U·mg~(-1),比野生型提高57%(6,835 U·mg~(-1))。野生型BAMYA和突变体BAMYA-S61A/D62E/I63H的K_m值、V_(max)及催化效率分别为3.58 mg·mL~(-1)和2.97 mg·mL~(-1),6,534μmol·min~(-1)·mg~(-1)、16,628μmol·min~(-1)·mg~(-1)以及1,577 mL·s~(-1)·mg~(-1)和3,042mL·s~(-1)·mg~(-1)。另外通过与高比活的序列和结构分析发现,BAMYA的C端位点473-475位的L K N位点可能与酶的催化相关,设计突变位点L473K/K474H/N475K,表达后比活为10,148 U·mg~(-1),比野生型提高48%。K_m值、催化效率分别为2.21 mg·mL~(-1)和4,760 mL·s~(-1)·mg~(-1)。但上述二者的组合突变效果不明显。本研究利用定点突变的方法,有效提高了目前工业应用的淀粉酶的热稳定性和催化活性,获得的突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,同时为淀粉酶突变研究提供参考。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
相关知识
绿豆芽淀粉酶的活性及应用
降落值仪-小麦籽粒中a一淀粉酶活性的测定
一种热稳定性提高的碱性果胶酶
【doc】人参不同年生淀粉酶活性的季节性变化
有机朗肯循环工质热稳定性研究
寄主植物、温度对金银花尺蠖幼虫消化酶活性的影响
四种柱花草种子萌发过程中参与糖代谢的酶活性变化研究
淀粉生物降解生产葡萄糖的研究
淀粉酶纳米花型时间
碱水解
网址: 中温淀粉酶的热稳定性及水解活性改良研究 https://m.huajiangbk.com/newsview1690192.html
| 上一篇: 金属有机骨架MIL |
下一篇: 明胶盐溶液的物理凝胶化及其热稳定 |
