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改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法.pdf

花匠小妙招
2025-02-25 14:38

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810727771.9 (22)申请日 2018.07.05 (71)申请人辽宁工程技术大学地址 123000 辽宁省阜新市细河区中华路 47号 (72)发明人黄静梁密黄媛闫晗 (74)专利代理机构沈阳东大知识产权代理有限公司 21109 代理人马海芳 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) (54)发明名称改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法 (57)摘要一种改性膨胀蛭石/壳聚。

2、糖复合载体及其固定化酶和制备方法，属于固定化酶制备技术领域。改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，其为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。该方法选用的无机材料膨胀蛭石与有机材料壳聚糖价廉易得，生产工艺简单，生产成本低，酶活力回收率高，重复利用率高，可为脂肪酶在有机合成工业、食品工业等方面应用提供潜在支撑。。

3、权利要求书2页说明书5页 CN 108660134 A 2018.10.16 CN 108660134 A 1.一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，其特征在于，该复合载体是改性膨胀蛭石与壳聚糖偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。 2.权利要求1所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)将改性膨胀蛭石放入蒸馏水中，搅拌，溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：蒸馏水(8g12g)： (160mL240mL)； (2)将壳聚糖溶于质量浓度为515醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；其中，按固液比，壳。

4、聚糖：质量浓度为515醋酸水溶液(4g6g)： (240mL360mL)； (3)将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为1mL/min5mL/ min，再加入质量浓度为0.30.7的硅烷偶联剂乙醇溶液，振荡，使改性膨胀蛭石和壳聚糖偶联，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，烘干，备用，得到干燥后的改性膨胀蛭石/ 壳聚糖复合载体；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：壳聚糖：质量浓度为0.30.7的硅烷偶联剂乙醇溶液硅烷偶联剂8g12g： 4g6g： 4060mL。 3.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(。

5、1)中，所述的改性膨胀蛭石为用盐酸改性的膨胀蛭石。 4.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的搅拌为1540搅拌2h5h。 5.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的硅烷偶联剂为硅烷偶联剂kh570或硅烷偶联剂kh550中的一种。 6.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的振荡，振荡频率为100r/min300r/min，振荡温度为2030，振荡时间为2h5h；所述的步骤(3)中，所述。

6、的烘干为100130烘干5h8h。 7.一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，其特征在于，酶采用交联剂戊二醛固定在权利要求1所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体上。 8.权利要求7所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：修饰复合载体将干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体加入质量浓度为0.52的戊二醛水溶液中，振荡反应，使戊二醛中的醛基与复合载体中的壳聚糖的氨基发生Schiff反应，形成共价键，得到戊二醛修饰的复合载体；其中，按固液比，干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体：质量浓度为0.52的戊二醛水溶液(0.21。

7、.2)g： 25mL100mL；步骤2：酶的固定化将质量浓度为0.52酶的磷酸缓冲液，加入戊二醛修饰的复合载体中，使得酶的氨基与戊二醛的醛基发生Schiff反应，形成共价键，得到固定化酶；其中，按体积比，质量浓度为0.52酶的磷酸缓冲液：戊二醛修饰的复合载体1:46 步骤3：后处理固定化完成后，过滤，将过滤固体用磷酸盐缓冲溶液洗涤，至上清液中检测不到酶，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶。 9.如权利要求8所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，其特征在权利要求书 1/2 页 2 CN 108660134 A 2 于，所述的步骤。

8、1中，所述的Schiff反应，其反应工艺为：振荡频率为100r/min300r/min，温度为2040，时间为13h。 10.如权利要求8所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中，所述的振荡固定化的工艺为： 2242下振荡固定化16h。权利要求书 2/2 页 3 CN 108660134 A 3 改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法技术领域 0001 本发明公开了一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法，属于固定化酶制备工艺技术领域。背景技术 0002 脂肪酶，即三酰基甘油水解酶(EC 3.1.1。

9、.3)，普遍存在于动物、植物及微生物中。其可以催化天然底物油脂进行酯交换反应和水解反应，生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯，能在油水界面催化酯水解、醇解、酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成及立体异构体拆分等多种有机反应。因此，脂肪酶在有机合成工业、造纸工业、食品工业、污剂工业及生物表面活性剂工业中都有广泛的应用，是目前催化剂研究热点之一。而脂肪酶成本高且易失活是制约其应用的主要障碍。 0003 脂肪酶，根据其应用形式可分为游离酶与固定化酶。固定化酶是指通过物理或化学方法结合在固相载体上的酶，使本来分散于流动液相与底物均相混合的游离酶成为与底。

10、物异相接触的固定相，从而使酶的催化反应被限制在固定相上进行。游离酶在应用中存在稳定性较差、产物分离纯化困难、不能反复利用等缺点；而固定化酶对热的稳定性提高、耐酸耐碱、对蛋白酶的抵抗性增强、对变性剂及抑制剂的耐受性提高、能够实现酶与产物的分离、可反复使用降低成本，便于自动化生产。 0004 在酶的固定化技术中，载体材料的形状、活性基团及微环境等因素，均可能影响载体与酶的亲和力及固定化酶的活力、稳定性、重复使用性等。蛭石是一种具有层状硅酸盐结构的天然黏土矿物，通常是黑云母经热水溶液蚀变作用或风化而来，在此过程中，云母中的钾离子并非简单地被其他水化。

11、阳离子所交换，而是伴随着化学结构的变化，为含镁，铁质铝硅酸盐的次生变质矿物。蛭石具有天然的多孔道结构、高比表面积及吸附性，机械刚性和热稳定性好，能够防止微生物的降解作用，环境友好且价格低廉，符合作为固定化酶载体的基本条件；若对蛭石进行适当改性，还能提高其吸附能力等性能。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰反应而得到的产物，其学名为 -1,4-聚-葡萄糖胺，一些双功能试剂能够与壳聚糖和蛋白类酶分子上的氨基发生Schiff反应，将酶与壳聚糖交联在一起。发明内容 0005 本发明的目的在于解决游离脂肪酶在应用中存在稳定性较差、产物分离纯化困难、不。

12、能反复利用、成本高等缺点，目前的固定化脂肪酶生产工艺成本高、酶活力回收率低、重复利用率低等不足之处，提供一种兼具无机/有机材料优点的复合载体固定化脂肪酶的方法。 0006 该方法是将无机载体改性膨胀蛭石与有机载体虾外壳壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及黑曲霉脂肪酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。本发明选用的无机材料膨胀蛭石与有机材料壳聚糖价廉易得，生产工艺简单，生产成本低，酶活力回收率高，重复说明书 1/5 页 4 CN 108660134 A 4 利用率高，可为脂肪酶。

13、在有机合成工业、食品工业等方面应用提供潜在支撑。 0007 本发明为解决以上问题所采用的技术方案为： 0008 本发明的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0009 (1)将改性膨胀蛭石放入蒸馏水中，搅拌，溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：蒸馏水(8g12g)： (160mL240mL)； 0010 (2)将壳聚糖溶于质量浓度为515醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；其中，按固液比，壳聚糖：质量浓度为515醋酸水溶液(4g6g)： (240mL360mL)； 0011 (3)将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊。

14、液中，滴入速度为1mL/min 5mL/min，再加入质量浓度为0.30.7的硅烷偶联剂乙醇溶液，振荡，使改性膨胀蛭石和壳聚糖偶联，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，烘干，备用，得到干燥后的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：壳聚糖：质量浓度为0.30.7的硅烷偶联剂乙醇溶液硅烷偶联剂8g12g： 4g6g： 4060mL； 0012 所述的步骤(1)中，所述的改性膨胀蛭石为用盐酸改性的膨胀蛭石，其作用在于除杂增加膨胀蛭石的比表面积。 0013 所述的步骤(1)中，所述的搅拌为1540搅拌2h5h。 0014 所述的步骤(2)中，。

15、所述的壳聚糖为虾外壳提取、蟹外壳提取或市购中的一种方法获取或几种方法获取。 0015 所述的步骤(3)中，所述的硅烷偶联剂为硅烷偶联剂kh570或硅烷偶联剂kh550中的一种。 0016 所述的步骤(3)中，所述的振荡，振荡频率为100r/min300r/min，振荡温度为20 30，振荡时间为2h5h。 0017 所述的步骤(3)中，所述的烘干为100130烘干5h8h。 0018 本发明的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，采用上述制备方法制得，其为改性膨胀蛭石与壳聚糖偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。 0019 本发明的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化。

16、酶的制备方法，包括以下步骤： 0020 步骤1：修饰复合载体 0021 将干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体加入质量浓度为0.52的戊二醛水溶液中，振荡反应，使戊二醛中的醛基与复合载体中的壳聚糖的氨基发生Schiff反应，形成共价键，得到戊二醛修饰的复合载体；其中，按固液比，干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体：质量浓度为0.52的戊二醛水溶液(0.21.2)g： 25mL100mL； 0022 步骤2：酶的固定化 0023 将质量浓度为0.52酶的磷酸缓冲液，加入戊二醛修饰的复合载体中，使得酶的氨基与戊二醛的醛基发生Schiff反应，形成共价键，得到固定化酶；。

17、其中，按体积比，质量浓度为0.52酶的磷酸缓冲液：戊二醛修饰的复合载体1:46 0024 步骤3：后处理 0025 固定化完成后，过滤，将过滤固体用磷酸盐缓冲溶液洗涤，至上清液中检测不到酶，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶。 0026 所述的步骤1中，所述的Schiff反应，其反应工艺为：振荡频率为100r/min300r/ 说明书 2/5 页 5 CN 108660134 A 5 min，温度为2040，时间为13h。 0027 所述的步骤3中，所述的振荡固定化的工艺为： 2242下振荡固定化16h。 0028 本发明的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载。

18、体固定化酶，采用上述方法制得。 0029 本发明的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。 0030 本发明的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法，其有益效果为： 0031 本发明选用的无机材料改性膨胀蛭石与有机材料虾外壳壳聚糖，均价廉易得，合成的复合载体兼具无机与有机载体的优点，生产工艺简单，生产成本较低，酶活力回收率较高(可达到91.53)，重复使用稳定性较好，可为其在。

19、有机合成工业、食品工业、污剂工业及生物表面活性剂工业中的应用提供技术支撑。 0032 本发明改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备过程中，采用先将戊二醛和改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体进行Schiff反应，再进行酶的固定化，使酶与复合载体上的戊二醛醛基通过共价键连接，以保证后期使用过程中，酶不易脱落，能够反复利用。而现有的一些技术是将载体和酶混合，再加入交联剂的反应方法(一锅法)，这种方法容易产生聚合酶的问题，并且产生的聚合酶大颗粒是吸附在载体上，是一种物理吸附，在后期在使用过程中，酶极容易脱落，本发明能有效的避免这一缺点。具体实施方式 0033。

20、下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 0034 实施例1 0035 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0036 将用盐酸改性后的10g膨胀蛭石加入到200mL蒸馏水中，室温搅拌3h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液； 0037 将5g壳聚糖溶于300mL质量浓度为l0醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液； 0038 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为1mL/min，再加入 50mL质量浓度为0.5硅烷偶联剂570乙醇溶液中，在25下振摇3h，最后120烘干6h，得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0039。

21、一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0040 将0.6g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入50mL质量浓度为1戊二醛水溶液中，在室温振荡反应2h，再加入质量浓度为1的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液10mL，在38 下振荡固定化4h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶，经检测，本实施例中酶活力回收率达到91 .53，重复利用10次后酶活力可保留 81.12。 0041 实施例2 0042 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0043 将用盐酸浸泡后的10g改性膨胀蛭石加入到200mL蒸馏。

22、水中，室温搅拌3h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液；说明书 3/5 页 6 CN 108660134 A 6 0044 将5g壳聚糖溶于300mL质量浓度为l0醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液； 0045 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为3mL/min，再加入 50mL质量浓度为0.5硅烷偶联剂570乙醇溶液中，在25下振摇3h，最后120烘干6h，得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0046 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0047 将1g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入50mL质量浓。

23、度为1戊二醛水溶液中，在室温振荡反应2h，再加入质量浓度为1的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液10mL，在34 下振荡固定化4h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶，经检测，本实施例中酶活力回收率达到83 .79，重复利用10次后酶活力可保留 80.06。 0048 实施例3 0049 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0050 将用盐酸浸泡后的10g改性膨胀蛭石加入到200mL蒸馏水中，室温搅拌3h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液； 0051 将5g壳聚糖溶于300mL质量浓度为l0醋酸溶液中，得到壳聚糖醋酸溶。

24、液； 0052 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为2mL/min，再加入 50mL质量浓度为0.5硅烷偶联剂570乙醇溶液中，在25下振摇3h，最后120烘干6h，得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0053 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0054 将0.8g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入50mL质量浓度为1戊二醛水溶液中，在室温振荡反应1h，再加入质量浓度为1的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液10mL，在32 下振荡固定化4h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶。

25、，经检测，本实施例中酶活力回收率达到82 .85，重复利用10次后酶活力可保留 81.05。。 0055 实施例4 0056 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0057 将用盐酸浸泡后的10g改性膨胀蛭石加入到200mL蒸馏水中，室温搅拌3h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液； 0058 将5g壳聚糖溶于300mL质量浓度为l0醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液； 0059 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为2mL/min，再加入 50mL质量浓度为0.5硅烷偶联剂570乙醇溶液中，在25下振摇3h，最后120烘干6h，。

26、得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0060 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0061 将0.8g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入50mL质量浓度为1戊二醛水溶液中， 30振荡反应3h，再加入质量浓度为1的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液10mL，在38 下振荡固定化3h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶，经检测，本实施例中酶活力回收率达到78 .71，重复利用10次后酶活力可保留 79.33。 0062 实施例5 说明书 4/5 页 7 CN 108660134 A 7 0063 一种改性。

27、膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0064 将用盐酸浸泡后的12g改性膨胀蛭石加入到240mL蒸馏水中， 15搅拌5h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液； 0065 将6g壳聚糖溶于360mL质量浓度为15醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液； 0066 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为5mL/min，再加入 60mL质量浓度为0.7硅烷偶联剂550乙醇溶液中，在30下振摇5h，最后130烘干5h，得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0067 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0068。

28、将1.2g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入100mL质量浓度为2戊二醛水溶液中， 10振荡反应2h，再加入质量浓度为2的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液20mL，在42 下振荡固定化1h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶，经检测，本实施例中酶活力回收率达到79 .28，重复利用10次后酶活力可保留 79.01。 0069 实施例6 0070 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤： 0071 将用盐酸浸泡后的8g改性膨胀蛭石加入到160mL蒸馏水中， 40搅拌2h，充分溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液； 0072 将4g壳。

29、聚糖溶于240mL质量浓度为5醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液； 0073 将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为4mL/min，再加入 40mL质量浓度为0.3硅烷偶联剂550乙醇溶液中，在20下振摇5h，最后100烘干5h，得到干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，备用。 0074 一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 0075 将0.2g干燥的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体加入25mL质量浓度为1戊二醛水溶液中， 30振荡反应3h，再加入质量浓度为0.5的黑曲霉脂肪酶磷酸缓冲液10mL，在20 下振荡固定化2h，得到固定化酶，过滤，用磷酸盐缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到脂肪酶，经检测，本实施例中酶活力回收率达到77 .01，重复利用10次后酶活力可保留 77.12。 0076 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。说明书 5/5 页 8 CN 108660134 A 8 。