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一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体预处理方法与流程

花匠小妙招
2025-02-26 06:31

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体预处理方法。

背景技术：

猫须草(clerodendranthusspicatus)，唇形科多年生草本，茎直立，高1-1.5米，四稜形，花冠浅紫或白色，花、果期5-11月；主要分布在广东海南，广西南部，云南南部，台湾及福建；常生于林下潮湿处，有时也见于无荫平地上。猫须草地上部分入药，甘淡微苦，具有较强抗菌、消炎作用，可使肾小管破坏减轻，肾小球细胞结构病变减少，完整肾小球数目增加，对肾组织的损伤有保护和改善作用，能增加肾小球滤过和肾循环血量，促进毒性代谢产物的排除，降低体内血尿酸。由于其具有重要的药理作用，市场需求日益扩大。采用植物组织培养快速繁殖，提供猫须草大规模种植所需健康种苗已经成为急需解决的问题。

植物组织培养快速繁殖的类型有：无菌短枝型、从生芽增殖型、器官发生型和胚状体发生型，然而不同增殖类型的适用范围和优势各异，因此在生产实际中根据植物种类的生长习性及特点选择适合的增殖类型。无菌短枝型快速繁殖技术是将待繁殖的材料剪成带1叶的1芽茎段，转入成苗培养基瓶内，经一定时间培养后可长成大苗、再剪成带1叶的1芽茎段，继代培养又成大苗。继代培养时将大苗反复切段转接，从而迅速获得较多嫩茎。然后将一部分嫩茎切段转移到生根培养基上，即可培养出完整的试管苗。这种方法主要利用顶端优势，可用于枝条生长迅速，或对植物组织培养苗质量要求较高的草本植物和一部分木本植物。该技术成苗快，不经过愈伤组织诱导阶段，遗传性状稳定，培养过程简单，适用范围广，移裁容易成活。

猫须草野生资源在人们的大量采掘下日益减少，而猫须草种植材料主要依赖于扦插和离体微型繁殖等技术提供健康种苗。无菌短枝快速繁殖技术是一项重要的离体微繁技术，但因其外植体通常是直接取自大田中生长的被大量细菌及内吸性真菌污染的带芽茎段等，造成组织培养污染率很高，以致种苗快繁效率很低甚至失败。许多科研工作者采用多菌灵、百菌清、杀毒矾、甲基硫菌灵、庆大霉素、咪酰胺、四环素等试剂单独或者混合药液浸泡外植体作为消毒前的预处理，或者在固体培养基上添加益培基杀菌剂，这些处理在一定程度上降低污染率，但还是不能从根本上解决问题。因此，探索新的外植体高效消毒方法，对解决猫须草种苗无菌短枝快速繁育过程中污染问题有重要的意义。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体预处理方法，采用多种光谱性杀菌剂对培育猫须草外植体的基质、移栽苗及生长空间进行全方位的消毒处理，污染率低，从而提高了猫须草无菌短枝快速繁殖的效率和产量。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体预处理方法，包括以下步骤：

步骤一，对培育基质进行消毒处理：用50%水溶代森铵350倍液，按每平方米培养基质用3公斤稀释液喷洒均匀，待土壤稍干即可装入花盆用于种植；

步骤二，对可密闭的塑料大棚预消毒：在猫须草移栽苗移入前15天，每隔5天一次，第一次用浓度为0.4%的咪酰胺，第二次用浓度为0.2%的代森锰锌，第三次用浓度为0.2%的代森锰锌药液喷洒塑料大棚地面和四周，消毒处理时间为上午，喷药后密闭塑料大棚；

步骤三，移栽苗选择及修剪消毒：移栽苗定植前，选择芽体饱满叶片无病虫害、生长健壮的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，然后在枝条离地面3-4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4%的咪酰胺或者浓度为0.2%的代森锰锌药液浸泡消毒1-2h；

步骤四，移栽苗定植：将步骤三所述的移栽苗定植于装有步骤一所述的培养基质的花盆中，并移入步骤二所述的塑料大棚培养；

步骤五，苗木定期消毒：将步骤四所述的移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4%的咪酰胺和浓度为0.2%的代森锰锌或者单用浓度为0.4%的咪酰胺亦或者单用浓度为0.2%的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次，消毒处理时间为上午；

步骤六，剪取新枝：待步骤五所述的苗木顶部新抽出幼嫩芽段时，从其基部剪断，取出芽段作为组织培养用的外植体材料。

所述的步骤六中待新抽出幼嫩芽段生长8cm-10cm时从其基部剪断。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：（1）操作简单，消毒效果好；（2）该方法生产成本低，可为工厂化快速繁殖提供足够的外植体；（3）污染率低，最低为2.0%。

具体实施方式

实施例1

一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体处理方法，包括以下步骤：

步骤一，对培育基质进行消毒处理：用50%水溶代森铵350倍液，按每平方米培养基质用3公斤稀释液喷洒均匀，待土壤稍干即可装入花盆用于种植；

步骤三，移栽苗选择及修剪消毒：移栽苗定植前，选择芽体饱满叶片无病虫害、生长健壮的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，然后在枝条离地面3cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4%的咪酰胺或者浓度为0.2%的代森锰锌药液浸泡消毒1h；

步骤四，移栽苗定植：将步骤三所述的移栽苗定植于装有步骤一所述的培养基质的花盆中，并移入步骤二所述的塑料大棚培养；

步骤五，苗木定期消毒：将步骤四所述的移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4%的咪酰胺和浓度为0.2%的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次，消毒处理时间为上午；

步骤六，剪取新枝：待步骤五所述的苗木顶部新抽出幼嫩芽段时，待新抽出幼嫩芽段生长8cm时从其基部剪断，作为组织培养用的外植体材料，用灭菌牛皮纸将纸条带回实验室。

实施例2

一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体处理方法，包括以下步骤：

步骤一，对培育基质进行消毒处理：用50%水溶代森铵350倍液，按每平方米培养基质用3公斤稀释液喷洒均匀，待土壤稍干即可装入花盆用于种植。

步骤三，移栽苗选择及修剪消毒：移栽苗定植前，选择芽体饱满叶片无病虫害、生长健壮的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，然后在枝条离地面3.5cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4%的咪酰胺或者浓度为0.2%的代森锰锌药液浸泡消毒1.5h；

步骤四，移栽苗定植：将步骤三所述的移栽苗定植于装有步骤一所述的培养基质的花盆中，并移入步骤二所述的塑料大棚培养；

步骤五，苗木定期消毒：将步骤四所述的移栽苗定植后，每隔7天单用浓度为0.4%的咪酰胺药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次，消毒处理时间为上午；

步骤六，剪取新枝：待步骤五所述的苗木顶部新抽出幼嫩芽段时，待新抽出幼嫩芽段生长9cm时从其基部剪断，作为组织培养用的外植体材料，用灭菌牛皮纸将纸条带回实验室。

实施例3

一种猫须草无菌短枝快速繁殖前的外植体处理方法，包括以下步骤：

步骤一，对培育基质进行消毒处理：用50%水溶代森铵350倍液，按每平方米培养基质用3公斤稀释液喷洒均匀，待土壤稍干即可装入花盆用于种植；

步骤三，移栽苗选择及修剪消毒：选择芽体饱满叶片无病虫害、生长健壮的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，然后在枝条离地面4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4%的咪酰胺或者浓度为0.2%的代森锰锌药液浸泡消毒2h；

步骤四，移栽苗定植：将步骤三所述的移栽苗定植于装有步骤一所述的培养基质的花盆中，并移入步骤二所述的塑料大棚培养；

步骤五，苗木定期消毒：将步骤四所述的移栽苗定植后，每隔7天单用浓度为0.2%的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次，消毒处理时间为上午；

步骤六，剪取新枝：待步骤五所述的苗木顶部新抽出幼嫩芽段后，待新抽出幼嫩芽段生长10cm时从其基部剪断，作为组织培养用的外植体材料，用灭菌牛皮纸将纸条带回实验室。

之后，在实验室的超净工作台上将实施例1、2和3得到的幼嫩芽段剪成1叶的1芽茎段并浸入浓度为75%的酒精中消毒30s，再用无菌水不断摇动冲洗2次，然后浸入浓度为0.1％的氯化汞溶液中浸泡8min，其间不断摇动，然后再用无菌水不断摇动冲洗7次后，用无菌滤纸吸干表面水分，将芽段接种于ms培养基上进行培养，人工气候培养箱设置培养条件为：昼/夜时间为：15h/9h；光照强度2500lx；昼/夜培养温度为23℃/18℃；相对湿度为：85%。

实验结果

接种30天后统计结果表明，采用未经预处理的大田外植体的污染率为100%；定期对密闭空间内植株喷洒浓度为0.4％的咪酰胺外植体的污染率为5.1%；定期对密闭空间内植株喷洒浓度为0.2％的代森锰锌外植体的污染率为6.5%；定期对密闭空间内植株隔次交替喷洒浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌外植体的污染率为2.0%。其中以定期对密闭空间内植株进行消毒是采取隔次交替喷洒浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌的效果最好，其次是单独喷洒浓度为0.4％的咪酰胺，再次是单独喷洒浓度为0.2％的代森锰锌。